EFFECT OF TEMPERATURE ON THE VIABILITY OF PLANKTON CELLS AND MODEL LEGIONELLA PNEUMOPHILA BIOFILMS IN WATER

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Legionella pneumophila - естественный обитатель природных пресноводных водоемов, способный к существованию в самом широком диапазоне условий внешней среды. Экологические исследования на базе современных методов показали, что культуру Legionella spp. можно выделить из 40% пресных водоемов, а в 80% водоемов легионеллы выявляют методом ПЦР [7, 8, 12]. Известно, что в природных водоемах концентрация легионелл обычно не превышает 103 КОЕ на литр, в то время как в потенциально опасных водных системах (система горячего водоснабжения, градирни, джакузи) концентрация может возрасти до 106 - 107 КОЕ на литр, что в целом ряде случаев приводит к возникновению эпидемических вспышек и спорадических случаев легионеллезной инфекции. Так, по данным Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI) с 2002 по 2007 годы в европейских странах зарегистрировано 215 вспышек и групповых случаев легионеллеза, связанных с превышением допустимого уровня легионелл в системе горячего водоснабжения [11, 13]. Температурный фактор является важнейшим в экологии легионелл и эпидемиологии легионеллезной инфекции. Легионеллы выделяют из систем горячего водоснабжения при температуре порядка 66°С и при 70°С из природной воды, но при температуре более 70°С выделить легионеллы не удавалось [14]. Легионеллы способны выделять CO2 при 51,6°С, подтверждая активность ряда ферментных систем микроорганизма при этой температуре. Yee R.B. и Wadowsky R.M. показали, что в природе легионеллы активно размножаются при температуре от 25°С до 45°С, а оптимум лежит между 37 и 42°С [16]. Этот температурный диапазон соответствует температурному режиму эксплуатации джакузи и СПА-бассейнов. Аналогичную температуру достаточно часто выявляют в застойных участках системы горячего водоснабжения или в воде, циркулирующей в градирне [7, 13]. Дезинфекция потенциально опасных водных систем и снижение в них концентрации легионелл до безопасного для человека уровня является в настоящее время единственным реальным путем профилактики легионеллеза [5, 6]. В этой связи, анализ устойчивости L.pneumophila к действию температурного фактора приобретает особую актуальность. Температура воды является естественным регулятором численности легионелл в потенциально опасных водных системах, способным, с одной стороны, обеспечить активное размножение легионелл до опасной для здоровья человека концентрации, а с другой - обеспечить элиминацию или значительное снижение концентрации возбудителя в системе до безопасного уровня. В данной работе изучено влияния температуры воды в диапазоне от 40°С до 70°С на жизнеспособность планктонных форм и модельных биопленок Legionella pneumophila в экспериментальных условиях с целью выбора оптимального температурного режима для использования в качестве одного из профилактических подходов при эксплуатации потенциально опасных водных систем. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы штаммы Legionella pneumophila из коллекции ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (референс-штамм Philadelphia 1, выделенный из легочной ткани пациента в 1979 г., и штамм Pyshma-3, выделенный из системы горячего водоснабжения г.Верхняя Пышма в 2007 г.). Штаммы легионелл выращивали на плотной агаризованной среде буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYEa) с ростовой добавкой («Oxoid») при 37°С в течение 48 ч. Суспензию выросшей культуры легионелл вносили в объеме 1 мл во флаконы с 1 литром стерильной водопроводной воды до конечной концентрации 103,104,105 КОЕ на литр. Для оценки действия температуры на суспензию возбудителя использовали температуру 40°, 50°, 60° и 70°С. Экспозиция культуры микроорганизмов в различной концентрации составляла, соответственно, 3, 6 и 24 часа при различной температуре. Далее высев, количественный учет и идентификацию легионелл из воды и биопленок проводили в соответствии с [2]. Для определения количества бактерий в исследуемой пробе воды использовали формулу: Х=[(8хЬ):о|х (1:s), где: X - количество бактерий на литр в исследуемой пробе, а - количество бактерий, выросших на чашке, b - объем концентрата в мл, с - объем, высеянный на чашку в мл, s - объем исходной пробы в литрах. Для определения количества бактерий в исследуемой пробе брали чашку с наибольшим количеством выросших колоний. Биопленки легионелл получали в 96-луночных плоскодонных пластиковых планшетах для иммуноферментного анализа в соответствии с [1]. Экспозиция биопленок легио-нелл при вышеуказанной температуре также составляла 3, 6 и 24 часа. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Анализ действия различных температурных режимов на планктонные формы и модельные биопленки легионелл свидетельствует, что температура § а а ю о У о м О ft о л о л о Он о 2 2 2^2 нн н-iж X ^ XX . о Х СО О <N п К О ,_ГогГ ^ О О О О О •го Х «го Щ О Г-Г Он £ g о s о w Он т Х< X X X О гч CN ОО 40 Щ Т1 X X X X X X X ,-н^ 40^ ^ ^ Г<1 с<Г ос 1/"Г СО гл' 00 ’ ц О о ООО 3 4£ й ^ ^ гл оо гл гл со со со со I-I х <D о СЧ Ш - НН ^ ОО ft С О О 2 X X X *Г0 ' С«"Г ООО 000 О ООО о м vo о\ со гл ■ ООО' ОО ОЧ (N О О О О о ГО (N 40 го <и> * к <■*■> ffl со s а ft у е f 2 Он № О О О О С <и> * К со ffl со s а ft у е f 2,8х103 6,4х104 5,2х105 3,5х102 2х102 3,3х105 роста роста 7,3х 10 5х102 1,5х104 1,7х104 9х10 2,3х 10 3,3х105 4,7х 10 Через 24 ч 3,8х103 2,8х104 4,1х105 Нет 2 кол. 4 кол. Нет Нет 30 кол. Нет роста Нет роста Нет роста 5,9х102 5,4х104 2,3х105 роста Нет Нет роста роста 17 кол. 9,5х102 4,2х104 5,6х105 роста роста воды является естественным регулятором концентрации и жизнеспособности легио-нелл в целом в условиях эксперимента (табл.). Если при 40°С сохраняются благоприятные условия для сохранения жизнеспособности и наблюдается незначительное увеличение концентрации возбудителя, то в диапазоне температуры от 50° до 60°С происходит значительное снижение количества жизнеспособных клеток легионелл. В то же время, полной элиминации микроорганизмов при температуре 60°С в условиях эксперимента не происходило. Более того, модельные биопленки легионелл частично сохраняли жизнеспособность при температуре 60°С, и лишь экспозиция при температуре 70°С приводила к гибели биопленок и планктонных форм бактерий. Показана зависимость сохранения жизнеспособности легионелл от исходной концентрации возбудителя в воде и длительности экспозиции при различной температуре. Так, если при температуре 60°С и концентрации легионелл в диапазоне 103 - 104 КОЕ на литр было достаточно 6-часовой экспозиции, то при концентрации легионелл 105 КОЕ на литр полной элиминации легионелл из воды достигали лишь при 24-часовой экспозиции. ОБСУЖДЕНИЕ Проведенные ранее исследования свидетельствуют о достаточно высоком уровне контаминации легионеллами систем горячего водоснабжения закрытого типа общественных зданий (гостиницы, больницы, торговые центры) в Московском регионе [3, 7]. В этой связи, весьма актуальным является вопрос о разработке комплекса профилактических мероприятий, позволяющих исключить размножение легионелл в этих системах до опасных для человека концентраций. В настоящее время в отношении легионелл практически во всех европейских странах, США, Российской Федерации введены предельно допустимые концентрации микроорганизма для различных типов потенциально опасных водных систем [4, 11, 13]. Необходимо понимать, что все эти нормативы подобраны эмпирически на основании многолетнего опыта проведения профилактических мероприятий и анализа эпидемических вспышек легионеллеза в различных странах мира и охватывают некую «условную буферную зону» между концентрацией легионелл в природных и искусственных водных системах, не представляющую опасности для населения, и уровнем концентрации легионелл в потенциально опасных водных системах при вспышках болезни легионеров с установленным источником распространения возбудителя. Легионеллы являются убиквитарными микроорганизмами в водной среде. Поэтому в отличие от многих других возбудителей инфекционных заболеваний, способных к размножению в воде, полностью элиминировать легионеллы из водных объектов невозможно. Более того, существенное превышение допустимых концентраций легионелл в потенциально опасных водных системах не обязательно приводит к немедленному возникновению случаев инфекции. Допустимые показатели для L. pneumophila в потенциально опасных водных системах были введены в Российской Федерации СанПином 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза» и предусматривают уровень не более 103 КОЕ на литр воды для систем горячего водоснабжения; для горячей воды ЛПУ в отделениях групп риска рекомендован нулевой уровень [4]. Для борьбы с легионеллами в потенциально опасных водных системах за последние 15 - 20 лет использовали достаточно широкий спектр химических агентов и физических факторов, в том числе таких как хлор- и бром-содержащие биоциды; дезинфектанты на основе перекиси водорода; ионы серебра и меди; ультрафиолет; термический шок; озонирование и другие [6, 9]. Необходимо отметить, что использование большинства применяемых за рубежом методов профилактики в системах горячего водоснабжения возможно в условиях нецентрализованного, локального водоснабжения. Для населения крупных городов и мегаполисов Российской Федерации традиционно характерно централизованное снабжение горячей водой. В этих условиях применение химически активных веществ, к которым относится большинство биоцидов, не представляется перспективным, тем более данные об их эффективности весьма противоречивы [10, 15]. Практически единственным методом, который можно рекомендовать для отечественных систем горячего водоснабжения закрытого типа, является термический шок, то есть кратковременное нагревание воды до температуры не менее 70°С. За рубежом термический шок применяется достаточно широко. Метод хотя и не приводит к элиминации легионелл, но обеспечивает заметное снижение концентрации возбудителя в системе [13]. Полученные в работе данные свидетельствуют, что только при повышении температуры до 70°С в условиях эксперимента имеет место полная элиминация легионелл как в воде, так и биопленках. Конечно, результаты, полученные на модельных биопленках, нельзя полностью экстраполировать на природные биопленки микроорганизмов, образующиеся в трубах систем горячего водоснабжения в условиях многолетней эксплуатации, т.к. они, скорее всего, будут отличаться более высокой устойчивостью [8, 9]. Но с учетом того, что полной элиминации легионелл из системы горячего водоснабжения не требуется в соответствии с действующим законодательством, наиболее выраженное бактерцидное действие на планктонные формы легионелл в системе и значительное снижение жизнеспособности бактериальных клеток в биопленках в условиях прогревания при 70°С не позволит концентрации легионелл превысить допустимый уровень 103 КОЕ на литр при периодическом краткосрочном прогревании воды в системе водоснабжения при данной температуре. Полученные результаты будут полезны для разработки эффективной и рациональной стратегии обеспечения микробиологической безопасности эксплуатации систем горячего водоснабжения в нашей стране. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

I. S Tartakovsky

Sechenov First Moscow State Medical University

T. I Karpova

Sechenov First Moscow State Medical University

O. A Gruzdeva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

O. V Marinenko

Sechenov First Moscow State Medical University

Yu. E Dronina

Sechenov First Moscow State Medical University

References

Supplementary files