MORPHO-FUNCTIONAL CHARACTERISTIC OF ENTEROBACTERIA ADHESIVE ACTIVITY

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Патогенез инфекционных болезней относится к одной из сложных и до настоящего времени во многом неразрешенных проблем, в основе которого лежат многофакторные взаимоотношения между патогеном и хозяином. Механизмы взаимодействия бактерий с клеткой хозяина характеризуются значительной вариабельностью и неспецифичностью, что определяет многообразие клинических проявлений инфекционных процессов [3]. Пусковым и наиболее важным моментом на начальном этапе развития инфекционного процесса является адгезия микроорганизмов к клеткам различных эпитопов [1], которая осуществляется благодаря наличию специальных молекул адгезинов [3], входящих в состав фимбрий бактериальных клеток или поверхностных структур клеточной стенки бактерий [4]. Молекула белка фимбрий состоит из нескольких участков, среди которых доминирует Fim A, а также присутствуют Fim G и Fim H. Последний, как выяснилось, ответственен за связывание Д-маннозы. Наличие фимбрий 1 типа отмечено у большинства представителей семейства Enterobacteriaceae [6]. Кроме того, известно, что Р фимбрии и фимбрии 1 типа у E. coli усиливают в эпителиальных клетках продукцию цитокинов in vivo и in vitro, в отличие от его изогенных пар, не имеющих этих фимбрий [5]. Р фимбрии связываются с Gal-a (1-4) Gal олигосахаридной последовательностью, содержащейся на поверхности билипидного слоя чувствительной клетки, и активизируют в последующем внутриклеточный церамид. В этой связи целью настоящей работы явились поиск эритроцитов различных видов животных и птиц для определения адгезивной активности в реакции гемагглю-тинации некоторых представителей энтеробактерий и изучение морфологии их адге-зинов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы 58 клинических культур энтеробактерий: 21 штамм составляли E.coli, 13 - Citrobacter spp., 11 - Morganella morganii, 9 - Proteus spp. и 4 - Hafnia alvei, выделенные при кишечных инфекциях. Адгезивные свойства бактерий определяли в реакции гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных (быка, барана, собаки, кролика), птиц (гуся, утки и курицы) [Габидуллин З.Г. и др. Авторское свидетельство №1312098]. Для этого брали по 50 мкл 3% суспензии эритроцитов, содержащей 0,6% Д-маннозы и без нее и смешивали на предметном стекле с суспензией культур различной оптической плотности от 250 тыс. до 1 млрд КОЕ/мл, культивированных на 0,5% дрожжевом агаре Хоттингера. По образованию агглютинационных хлопьев в течение 1 - 2 минут судили о способности штаммов давать Д-маннозочувствительную и Д-маннозо-резистентную реакции гемагглютинации. Количественную оценку адгезивной активности энтеробактерий проводили по [2]. Для постановки опыта на предметное стекло наносили каплю буферного раствора (рН 7,2), в которой суспендировали взвесь изучаемых микроорганизмов и отмытых стандартных формалинизированных эритроцитов I(0) группы крови человека. Степень адгезивной активности оценивали с помощью среднего показателя адгезии (СПА), под которым понималось среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой - от 1,04 до 2,0; средней - от 2,4 до 4,0 и высокой - при СПА свыше 4,0. Изучение особенностей клеточной структуры энтеробактерий и ультраструктуры клетки проводили с помощью оптического и электронного (JEM-100B) микроскопов на базе лаборатории физических методов исследования НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат». Для исследования в электронном микроскопе микроорганизмы наносили платиновой петлей и размещали на пленках-подложках, опорой для которых служили специальные медные сетки. Предварительно в световом микроскопе определяли плотность микробных клеток и высушивали при комнатной температуре. Затем оттеняли в специальных вакуумных установках типа Jee-40. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для определения адгезинов в первую очередь нами проведен поиск клеток-мишеней, в частности, в опытах использованы эритроциты различных видов животных и птиц. Исследования проводили с эритроцитами I - IV группы крови человека, а также использовались эритроциты быка, барана, собаки, кролика, гуся, утки и цыпленка. Исследуемые культуры энтеробактерий с эритроцитами I - IV группы крови человека, а также с эритроцитами быка, барана, собаки, кролика не давали реакции гемагглютинации. Опыты показали, что наиболее приемлемыми для определения адгезинов явились эритроциты цыпленка, гуся и утки, т.е. птиц. При этом четко прослеживается как Д-маннозочувствительная, так и Д-маннозорезистентная реакции гемагглютинации. Данная модель в дальнейших опытах была использована для определения адгезинов энтеробактерий. В последующих опытах нами исследованы эти штаммы для количественной оценки адгезивной активности методом [2]. Результаты этих исследований показали, что штаммы энтеробактерий, которые давали положительные результаты в реакциях гемагглютинации, проявляли высокий уровень среднего показателя адгезивности (рис.), тогда как культуры, не проявляющие адгезивной активности в реакции гемагглютинации, в количественных опытах не адгезировались к эритроцитам. В последующих опытах процесс адгезии с эритроцитами исследовали на электронном микроскопе. Результаты позволили определить взаимодействие эритроцитов и бактериальных клеток и процесс адгезии на мембранах эритроцитов. Установлено, что микроорганизмы «атаковали» эритроциты, причем были видны тяжи между ми- L 1 Адгезия энтеробактерий к эритроцитам, характеризующаяся высокими значениями СПА. Световая микроскопия. Увеличение х630 (вверху слева). Микрофотография адгезивной активности энтеробактерий. Клетки высокоадгезивных энтеробактерий в большом количестве (более 10) плотно прилипают к эритроцитам цыпленка. Электронная микроскопия: Jem-100B. Увеличение х10 000 (вверху справа). Фимбрии адгезивных энтеробактерий. Высокоадгезивные бактерии по периметру имеют реснички длиной 110 - 420 нм и шириной 5,0 - 5,4 нм. Электронная микроскопия: Jem-100B. Увеличение х30 000 (внизу). кробными клетками, а на месте адгезии они оттягивали мембрану эритроцитов (рис.), тогда как неадгезивные штаммы покоились свободно от эритроцитов. С целью выяснения природы структур, ответственных за адгезивность энтеробактерий, было проведено электронно-микроскопическое исследование высокоадгезивных бактериальных клеток, обладающих и не обладающих свойством вызывать Д-маннозочувствительную и Д-маннозорезистентную реакции гемагглютинации. Проведенные исследования показали, что клетки штаммов, способные вызывать реакцию гемагглютинации с эритроцитами птиц, по периметру имели реснички длиной 110 - 420 нм и шириной 5,0 - 5,4 нм (рис.), тогда как большинство клеток, не способных давать РГА, не имели таких ресничек. Адгезивная активность бактерий играет важную роль на начальном этапе развития патоген-хозяинных взаимоотношений. Полученные нами данные дают основание заключить, что адгезия энтеробактерий - это сложный процесс, зависящий от наличия определенных фимбриальных структур с определенными размерами (длиной 110 - 420 нм и шириной 5,0 - 5,4 нм), с помощью которых происходит специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина. В частности, экспериментально показано их соответствие с эритроцитами птиц, выявляемые в реакции гемагглютинации. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что для обнаружения адгезинов энтеробактерий наряду с использованием формалинизированных эритроцитов I(0) группы крови человека по [2] (традиционная методика) в реакции гемаг-глютинации можно использовать эритроциты птиц, что позволяет выявить высокоадгезивные штаммы энтеробактерий и, следовательно, установить их причастность к развитию инфекционной патологии человека.

About the authors

M. M Tuigunov

Bashkir State Medical University

D. T Gashimova

Bashkir State Medical University

A. A Akhtareeva

Bashkir State Medical University

Yu. Z Gabidullin

Bashkir State Medical University

A. K Bulgakov

Bashkir State Medical University

G. K Davletshina

Bashkir State Medical University

G. A Idiatullina

Bashkir State Medical University

References

Supplementary files