PHENOTYPICAL CHARACTERISTICS AND GENETICAL DETERMINANTS OF PATHOGENICITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ISOLATED FROM BACTERIAL CARRIERS, RESIDING ON THE TERRITORIES WITH VARIOUS LEVELS OF ANTHROPOGENIC POLLUTION OF AIR ENVIRONMENT

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Клиническое значение стафилококкового бактерионосительства определяется типичностью процесса транслокации стафилококков со слизистых оболочек во внутреннюю среду организма-хозяина с развитием широкого спектра заболеваний [19, 23]. Показано, что у постоянных носителей резидентного типа происходит накопление наиболее вирулентных и резистентных к антибиотикам культур [16], обладающих способностью к инактивации факторов естественной резистентности организма с высокими значениями признаков [4, 10]. На биологические свойства персистирующих в организме стафилококков и частоту распространения стафилококкового бактерионосительства оказывают влияние антропогенные факторы загрязнения воздушной среды [8]. Установлено, что ведущим свойством стафилококков, определяющим формирование бактерионосительства, является их антикарнозиновая активность [9], показано, что Staphylococcus aureus существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных и прикрепленных к субстратам биопленок [12]. Однако данные о частоте встречаемости этих свойств у стафилококков, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, отсутствуют. Способность стафилококков вызывать инфекционный процесс в результате их транслокации обусловлена наличием у некоторых штаммов широкого спектра факторов вирулентности: адгезии, лейкоцидина, энтеротоксинов [15, 18, 24] и антибиотикорезистентности [1]. В связи с этим, актуальным является изучение антибиотикорезистентности, а также распространенности генетических детерминант патогенности среди штаммов стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, как потенциальных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний. Целью работы явилась сравнительная фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов S.aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территориях с антропогенным загрязнением воздушной среды различной интенсивности. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Трехкратно на наличие S.aureus исследовано слизистое отделяемое переднего отдела носа 210 детей (9 - 12 лет), проживающих на территории с высоким (г. Новотроицк Оренбургской области - территория 1) и низким (с. Шарлык Оренбургской области - территория 2) уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды. Анализ загрязнения атмосферного воздуха проводили в соответствии с ГОСТ 17.2.3.01-86 и РД 52.04.186-89. Распространенность заболеваний органов дыхания у детей оценивали по данным отчетной статистики медицинских учреждений (форма 12). Выделенные культуры идентифицировали по биохимическим признакам с использованием тест-систем «StaphyTest» («Lachema», Чехия). Патогенный потенциал культур оценивали по антикарнозиновой активности (АКрА) [5] и способности к образованию биопленок (ОБ) [22]. Значения биопленкообразования стафилококков выражали в условных единицах (ед.), которые рассчитывали как отношение оптической плотности изучаемой культуры (опыт) к оптической плотности раствора в контроле. Устойчивость к следующим антибиотикам: ампициллину, тетрациклину, эритромицину, ципрофлоксацину, ванкомицину, азитромицину, оксациллину, имипинему определяли по [13]. У 24 штаммов S.aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территориях 1 и 2, дополнительно исследовали генетические детерминанты патогенности (luk S-PV и luk F-PV, sec 3, clf A, clf B, agr и mec A). Выделение ДНК осуществляли из бактериальной суспензии (107 КОЕ/мл) суточной агаровой культуры сорбционным методом с использованием набора «Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) согласно рекомендации производителя. Амплификацию проводили с применением подобранных праймеров (табл.) на термоциклере МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле с использованием стандартных наборов «ЭФ» вариант 300 («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Ампликоны визуализировали бромистым этидием при помощи фотодокументационной системы Gel Camera System (UVP Inc., США). Размер амплифицируемых фрагментов определяли в сравнении с маркерными последовательностями (13 фрагментов от 0,25 до 10 Kb, «Сибэнзим», Россия). Статистическую обработку осуществляли с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [2]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Праймеры, использованные для определения генов патогенности S.aureus Ген Праймер Олигонуклеотидная последовательность Размер продукта, п.н. lukS Forward 5’-AATATTGGTGATGGCGCTGAG-3’ Reverse 5’-TACCT CCT GTT GAT GGACCACT-3’ 360 lukF Forward 5’-GTTGATGCAGCTCAACATATCAC-3’ Reverse 5’TAT CT CCACCATAAGAATAACCTACC-3’ 373 sec3 Forward 5’-AGCAAAGAAGTACAAAGAT GAAGT-3’ Reverse 5’-AAAAGGCAAGCACCGAAGTA-3’ 578 clfA Forward 5’-CGC CGG TAA CTG GTG AAG CT-3’ Reverse 5’-TGC TCT CAT TCT AGG CGCACTT-3’ 759 clfB Forward 5’-ATG ATC TTG CTT GCG TT-3’ Reverse 5’-CCG ATT CAA GAG TTA CAC C-3’ 759 Forward 5’-TAGGCAGTGAAATTCGTAAGCA-3’ Reverse 5’-CATACACT GAATTACTGCCACGT-3’ 248 mecA Forward 5’-ACGAGTAGATGCT CAATATAA-3’ Reverse 5’-CTTAGTT CTTTAGCGATT GC-3’ 293 Для реализации поставленной цели нами были выбраны территории, отличающиеся уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды. В атмосферном воздухе территории 1 установлено превышение в 1,5 - 1,9 раза предельно допустимых концентраций диоксида азота, взвешенных веществ, оксида углерода, оксида железа, оксида меди, сероводорода, диоксида серы по сравнению с территорией 2. Комплексный показатель загрязнения атмосферного воздуха территории 1 был в 2,5 раз выше, чем территории 2, и составлял 4,8 и 1,9 единиц, соответственно. Распространенность болезней респираторного тракта среди детей, проживающих на территории 1, в 3,8 раза превышала аналогичный показатель среди детей, проживающих на территории 2 (1778,9+67,8%о против 463,2+26,9%о). При обследовании детей было установлено, что резидентные бактерионосители S.aureus на территории 1 регистрировали в 1,7 раза чаще, чем на территории 2 (в 21,8% и в 12,6% случаев, соответственно). Исследование способности S.aureus к инактивации карнозина показало наличие указанного признака у 100% штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на обеих территориях, однако среднее значение АКрА у стафилококков, выделенных у детей, проживающих на территории 1, составляло 2,6±0,2 мг/мл, а на территории 2 - 1,8±0,1 мг/мл (р < 0,05). Способность S.aureus образовывать биопленки была выявлена у всех культур, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территории 1, тогда как штаммы, изолированные от резидентных бактерионосителей на территории 2, проявляли указанную активность лишь в 49% случаев. Выраженность признака характеризовалась значениями 1,5±0,03 ед. и 1,1±0,04 ед., соответственно (р<0,05). Определение чувствительности стафилококков к антибиотикам показало, что 93% штаммов S.aureus, выделенных от детей на территории 2, и 100% штаммов, выделенных от детей, проживающих на территории 1, были резистентны к ампициллину; к тетрациклину - 5% и 100% штаммов; эритромицину - 10% и 85%; ципрофлоксацину - 4,6% и 85%; ванкомицину - 4,6% и 32% штаммов, соответственно. По 18% культур S.aureus, выделенных от детей, проживающих на обеих территориях, были резистентны к азитроми-цину. Устойчивость к оксациллину (18% штаммов) и имипинему (32% штаммов) обнаружена только у S.aureus, выделенных у детей, проживающих на территории 1. Все выделенные штаммы S.aureus, вне зависимости от территории проживания бактерионосителей, содержали гены clfA и clfB, кодирующие протеины клеточной стенки, ответственные за связывание фибриногена и определяющие адгезивные возможности S.aureus во внутренней среде макроорганизма, а также регуляторный ген agr системы QS S.aureus. При тестировании выделенных стафилококков на наличие генов, детерминирующих синтез лейкоцидина Panton-Valentine (lukS и lukF), ген lukS выявлен не был, тогда как ген lukF присутствовал в геноме 33,4% культур, выделенных от детей на территории 1, и у 20% штаммов, выделенных у детей, проживающих на территории 2, у них же 40% культур содержали ген, детерминирующий синтез стафилококкового энтеротоксина (sec 3). Ни один из штаммов S.aureus не содержал ген mecA, детерминирующий устойчивость к Р-лактамазам. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты, отражающие доминирование у резидентных бактерионосителей S.aureus, проживающих на территории с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, штаммов с высоким уровнем АКрА и ОБ, свидетельствуют об усилении экспрессии персистентных свойств стафилококков под воздействием антропогенных факторов воздушной среды и согласуются с аналогичными результатами, полученными ранее для антилизоцимной, антикомплементарной активности и способности к инактивации интерцида [3, 11]. Загрязнение атмосферного воздуха химическими веществами антропогенного происхождения сказывается и на состоянии здоровья детей, вызывая, в первую очередь, заболевания органов дыхания. Использование антибиотиков для их лечения может вызвать формирование антибиотикорезистентных штаммов. Проведенными исследованиями установлена высокая устойчивость резидентной стафилококковой микрофлоры, выделенной от детей, проживающих на территории 1, к антибиотикам. В частности, уровень резистентности S.aureus к тетрациклину, ципрофлоксацину и ванкомицину в 20, 18 и 6,9 раза соответственно превышал таковой у штаммов, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территории с низким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, а устойчивость к оксациллину и имипинему обнаружена только у S.aureus, выделенных у детей, проживающих на территории 1. Полученные нами данные представляют интерес в свете имеющихся сведений о том, что резистентные к антибиотикам штаммы являются потенциальными возбудителями инфекционно-воспалительных заболеваний, поскольку они отличаются повышенной вирулентностью, способностью быстрого распространения, устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам [1]. Дополнительного изучения требует выявленный нами факт отсутствия у метициллин-резистентных кульутр S.aureus гена mec A, ассоциированного с указанным признаком, что однако может быть объяснено высокой частотой его обнаружения преимущественно среди госпитальных штаммов [7]. С использованием ПЦР у всех исследуемых штаммов обнаружен ген agr, имеющий значение в регуляции экспрессии ряда факторов патогенности S.aureus [21], и гены колонизации clfA и clfB, детерминирующие процесс прикрепления стафилококков к эпите-лиоцитам слизистой оболочки носовых ходов [25]. Этот факт может служить дополнительным свидетельством тому, что поверхностный белок (клампинг-фактор) является определяющим в формировании резидентного бактерионосительства в силу высокой степени сродства к лорикрину (белку, расположенному на поверхности клеток слизистой оболочки носовых ходов) [20]. Настораживает обнаружение у ряда изолятов, выделенных от детей, проживающих на обеих территориях, генетических детерминант лейкоцидина, являющегося маркером тяжелых инфекционных процессов [17], а также гена, детерминирующего синтез стафилококкового энтеротоксина, у штаммов, выделенных от детей, проживающих на территории с низким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, поскольку они могут стать причиной эндогенной инфекции [6, 14]. Таким образом, антропогенное загрязнение воздушной среды, наряду с известными уже негативными последствиями, может приводить к увеличению удельного веса резидентных бактерионосителей среди детей и имеет в своей основе кардинальное изменение биологических свойств S.aureus, в частности, антибиотикорезистентности, а также повышение уровня АКрА и ОБ. Данные факторы персистенции могут являться маркерами бактерионосительства резидентного типа, что необходимо учитывать при разработке эффективных способов санации лиц с длительным бактериовыделением. Изучение вирулентного потенциала стафилококков, выделенных от бактерионосителей, с помощью генетических методов исследования может быть использовано для прогнозирования риска развития эндогенных инфекций.

About the authors

T. M Utkina

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

L. P Popova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

O. L Kartashova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

G. D Khazeeva

Bashkiria State Medical University

A. A Khaliullina

Bashkiria State Medical University

References

Supplementary files