ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПАТОГЕННОСТИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ У БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ АНТРОПОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Клиническое значение стафилококкового бактерионосительства определяется типичностью процесса транслокации стафилококков со слизистых оболочек во внутреннюю среду организма-хозяина с развитием широкого спектра заболеваний [19, 23]. Показано, что у постоянных носителей резидентного типа происходит накопление наиболее вирулентных и резистентных к антибиотикам культур [16], обладающих способностью к инактивации факторов естественной резистентности организма с высокими значениями признаков [4, 10]. На биологические свойства персистирующих в организме стафилококков и частоту распространения стафилококкового бактерионосительства оказывают влияние антропогенные факторы загрязнения воздушной среды [8]. Установлено, что ведущим свойством стафилококков, определяющим формирование бактерионосительства, является их антикарнозиновая активность [9], показано, что Staphylococcus aureus существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных и прикрепленных к субстратам биопленок [12]. Однако данные о частоте встречаемости этих свойств у стафилококков, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территориях с разным уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, отсутствуют. Способность стафилококков вызывать инфекционный процесс в результате их транслокации обусловлена наличием у некоторых штаммов широкого спектра факторов вирулентности: адгезии, лейкоцидина, энтеротоксинов [15, 18, 24] и антибиотикорезистентности [1]. В связи с этим, актуальным является изучение антибиотикорезистентности, а также распространенности генетических детерминант патогенности среди штаммов стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, как потенциальных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний. Целью работы явилась сравнительная фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов S.aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территориях с антропогенным загрязнением воздушной среды различной интенсивности. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Трехкратно на наличие S.aureus исследовано слизистое отделяемое переднего отдела носа 210 детей (9 - 12 лет), проживающих на территории с высоким (г. Новотроицк Оренбургской области - территория 1) и низким (с. Шарлык Оренбургской области - территория 2) уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды. Анализ загрязнения атмосферного воздуха проводили в соответствии с ГОСТ 17.2.3.01-86 и РД 52.04.186-89. Распространенность заболеваний органов дыхания у детей оценивали по данным отчетной статистики медицинских учреждений (форма 12). Выделенные культуры идентифицировали по биохимическим признакам с использованием тест-систем «StaphyTest» («Lachema», Чехия). Патогенный потенциал культур оценивали по антикарнозиновой активности (АКрА) [5] и способности к образованию биопленок (ОБ) [22]. Значения биопленкообразования стафилококков выражали в условных единицах (ед.), которые рассчитывали как отношение оптической плотности изучаемой культуры (опыт) к оптической плотности раствора в контроле. Устойчивость к следующим антибиотикам: ампициллину, тетрациклину, эритромицину, ципрофлоксацину, ванкомицину, азитромицину, оксациллину, имипинему определяли по [13]. У 24 штаммов S.aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территориях 1 и 2, дополнительно исследовали генетические детерминанты патогенности (luk S-PV и luk F-PV, sec 3, clf A, clf B, agr и mec A). Выделение ДНК осуществляли из бактериальной суспензии (107 КОЕ/мл) суточной агаровой культуры сорбционным методом с использованием набора «Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) согласно рекомендации производителя. Амплификацию проводили с применением подобранных праймеров (табл.) на термоциклере МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле с использованием стандартных наборов «ЭФ» вариант 300 («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Ампликоны визуализировали бромистым этидием при помощи фотодокументационной системы Gel Camera System (UVP Inc., США). Размер амплифицируемых фрагментов определяли в сравнении с маркерными последовательностями (13 фрагментов от 0,25 до 10 Kb, «Сибэнзим», Россия). Статистическую обработку осуществляли с использованием параметрических методов. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [2]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Праймеры, использованные для определения генов патогенности S.aureus Ген Праймер Олигонуклеотидная последовательность Размер продукта, п.н. lukS Forward 5’-AATATTGGTGATGGCGCTGAG-3’ Reverse 5’-TACCT CCT GTT GAT GGACCACT-3’ 360 lukF Forward 5’-GTTGATGCAGCTCAACATATCAC-3’ Reverse 5’TAT CT CCACCATAAGAATAACCTACC-3’ 373 sec3 Forward 5’-AGCAAAGAAGTACAAAGAT GAAGT-3’ Reverse 5’-AAAAGGCAAGCACCGAAGTA-3’ 578 clfA Forward 5’-CGC CGG TAA CTG GTG AAG CT-3’ Reverse 5’-TGC TCT CAT TCT AGG CGCACTT-3’ 759 clfB Forward 5’-ATG ATC TTG CTT GCG TT-3’ Reverse 5’-CCG ATT CAA GAG TTA CAC C-3’ 759 Forward 5’-TAGGCAGTGAAATTCGTAAGCA-3’ Reverse 5’-CATACACT GAATTACTGCCACGT-3’ 248 mecA Forward 5’-ACGAGTAGATGCT CAATATAA-3’ Reverse 5’-CTTAGTT CTTTAGCGATT GC-3’ 293 Для реализации поставленной цели нами были выбраны территории, отличающиеся уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды. В атмосферном воздухе территории 1 установлено превышение в 1,5 - 1,9 раза предельно допустимых концентраций диоксида азота, взвешенных веществ, оксида углерода, оксида железа, оксида меди, сероводорода, диоксида серы по сравнению с территорией 2. Комплексный показатель загрязнения атмосферного воздуха территории 1 был в 2,5 раз выше, чем территории 2, и составлял 4,8 и 1,9 единиц, соответственно. Распространенность болезней респираторного тракта среди детей, проживающих на территории 1, в 3,8 раза превышала аналогичный показатель среди детей, проживающих на территории 2 (1778,9+67,8%о против 463,2+26,9%о). При обследовании детей было установлено, что резидентные бактерионосители S.aureus на территории 1 регистрировали в 1,7 раза чаще, чем на территории 2 (в 21,8% и в 12,6% случаев, соответственно). Исследование способности S.aureus к инактивации карнозина показало наличие указанного признака у 100% штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на обеих территориях, однако среднее значение АКрА у стафилококков, выделенных у детей, проживающих на территории 1, составляло 2,6±0,2 мг/мл, а на территории 2 - 1,8±0,1 мг/мл (р < 0,05). Способность S.aureus образовывать биопленки была выявлена у всех культур, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территории 1, тогда как штаммы, изолированные от резидентных бактерионосителей на территории 2, проявляли указанную активность лишь в 49% случаев. Выраженность признака характеризовалась значениями 1,5±0,03 ед. и 1,1±0,04 ед., соответственно (р<0,05). Определение чувствительности стафилококков к антибиотикам показало, что 93% штаммов S.aureus, выделенных от детей на территории 2, и 100% штаммов, выделенных от детей, проживающих на территории 1, были резистентны к ампициллину; к тетрациклину - 5% и 100% штаммов; эритромицину - 10% и 85%; ципрофлоксацину - 4,6% и 85%; ванкомицину - 4,6% и 32% штаммов, соответственно. По 18% культур S.aureus, выделенных от детей, проживающих на обеих территориях, были резистентны к азитроми-цину. Устойчивость к оксациллину (18% штаммов) и имипинему (32% штаммов) обнаружена только у S.aureus, выделенных у детей, проживающих на территории 1. Все выделенные штаммы S.aureus, вне зависимости от территории проживания бактерионосителей, содержали гены clfA и clfB, кодирующие протеины клеточной стенки, ответственные за связывание фибриногена и определяющие адгезивные возможности S.aureus во внутренней среде макроорганизма, а также регуляторный ген agr системы QS S.aureus. При тестировании выделенных стафилококков на наличие генов, детерминирующих синтез лейкоцидина Panton-Valentine (lukS и lukF), ген lukS выявлен не был, тогда как ген lukF присутствовал в геноме 33,4% культур, выделенных от детей на территории 1, и у 20% штаммов, выделенных у детей, проживающих на территории 2, у них же 40% культур содержали ген, детерминирующий синтез стафилококкового энтеротоксина (sec 3). Ни один из штаммов S.aureus не содержал ген mecA, детерминирующий устойчивость к Р-лактамазам. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты, отражающие доминирование у резидентных бактерионосителей S.aureus, проживающих на территории с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, штаммов с высоким уровнем АКрА и ОБ, свидетельствуют об усилении экспрессии персистентных свойств стафилококков под воздействием антропогенных факторов воздушной среды и согласуются с аналогичными результатами, полученными ранее для антилизоцимной, антикомплементарной активности и способности к инактивации интерцида [3, 11]. Загрязнение атмосферного воздуха химическими веществами антропогенного происхождения сказывается и на состоянии здоровья детей, вызывая, в первую очередь, заболевания органов дыхания. Использование антибиотиков для их лечения может вызвать формирование антибиотикорезистентных штаммов. Проведенными исследованиями установлена высокая устойчивость резидентной стафилококковой микрофлоры, выделенной от детей, проживающих на территории 1, к антибиотикам. В частности, уровень резистентности S.aureus к тетрациклину, ципрофлоксацину и ванкомицину в 20, 18 и 6,9 раза соответственно превышал таковой у штаммов, выделенных от бактерионосителей, проживающих на территории с низким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, а устойчивость к оксациллину и имипинему обнаружена только у S.aureus, выделенных у детей, проживающих на территории 1. Полученные нами данные представляют интерес в свете имеющихся сведений о том, что резистентные к антибиотикам штаммы являются потенциальными возбудителями инфекционно-воспалительных заболеваний, поскольку они отличаются повышенной вирулентностью, способностью быстрого распространения, устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам [1]. Дополнительного изучения требует выявленный нами факт отсутствия у метициллин-резистентных кульутр S.aureus гена mec A, ассоциированного с указанным признаком, что однако может быть объяснено высокой частотой его обнаружения преимущественно среди госпитальных штаммов [7]. С использованием ПЦР у всех исследуемых штаммов обнаружен ген agr, имеющий значение в регуляции экспрессии ряда факторов патогенности S.aureus [21], и гены колонизации clfA и clfB, детерминирующие процесс прикрепления стафилококков к эпите-лиоцитам слизистой оболочки носовых ходов [25]. Этот факт может служить дополнительным свидетельством тому, что поверхностный белок (клампинг-фактор) является определяющим в формировании резидентного бактерионосительства в силу высокой степени сродства к лорикрину (белку, расположенному на поверхности клеток слизистой оболочки носовых ходов) [20]. Настораживает обнаружение у ряда изолятов, выделенных от детей, проживающих на обеих территориях, генетических детерминант лейкоцидина, являющегося маркером тяжелых инфекционных процессов [17], а также гена, детерминирующего синтез стафилококкового энтеротоксина, у штаммов, выделенных от детей, проживающих на территории с низким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, поскольку они могут стать причиной эндогенной инфекции [6, 14]. Таким образом, антропогенное загрязнение воздушной среды, наряду с известными уже негативными последствиями, может приводить к увеличению удельного веса резидентных бактерионосителей среди детей и имеет в своей основе кардинальное изменение биологических свойств S.aureus, в частности, антибиотикорезистентности, а также повышение уровня АКрА и ОБ. Данные факторы персистенции могут являться маркерами бактерионосительства резидентного типа, что необходимо учитывать при разработке эффективных способов санации лиц с длительным бактериовыделением. Изучение вирулентного потенциала стафилококков, выделенных от бактерионосителей, с помощью генетических методов исследования может быть использовано для прогнозирования риска развития эндогенных инфекций.

Об авторах

Т. М Уткина

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Л. П Попова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

О. Л Карташова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Г. Д Хазеева

Башкирский государственный медицинский университет

А. А Халиуллина

Башкирский государственный медицинский университет

Список литературы

Дополнительные файлы