BIOLOGICAL ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES OF ENTEROCOCCUS FAECIUM

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Антимикробные пептиды энтерококков - бактериоцины - являются важной группой защитных факторов, с помощью которых бактерии данного рода обеспечивают колонизационную резистентность биотопов пищеварительного тракта [1]. Несмотря на интенсивное изучение этих пептидов, продуцируемых разными штаммами бактерий, механизмы их биологической активности требуют расшифровки. Одним из направлений таких исследований является оценка морфо-функциональных изменений клеток микроорганизмов под действием различных биофакторов, которые можно обнаружить с помощью современных аналитических методов. В этой связи, целью настоящей работы явилось определение влияния очищенных метаболитов энтерококков на некоторые параметры грамположительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследований послужили бактериоциногенные штаммы Enterococcus faecium 7 и 8 из коллекции лаборатории дисбиозов ИКВС УрО РАН. Антимикробные пептиды энтерококков получали при культивировании последних в бульоне Schaedler (Becton Dickinson, USA) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при температуре 37°С. Клетки из среды удаляли центрифугированием (10 000 g, 10°С, 20 мин) на центрифуге Mikro 22R (Hettich, Germany), отбирали надосадочную жидкость и пропускали ее через фильтр Millipore (USA) c диаметром пор 0,22 мкм. Культуральную жидкость обессоливали методом ОФ-ВЭЖХ на колонке с фазой С8. Пептидную фракцию элюировали с колонки 60% растворителем Б (60% водный раствор ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте). Собранную фракцию упаривали досуха в вакуумном концентраторе (Speedvac, USA) и лиофилизировали. Полученный при осаждении осадок перерастворяли в стерильной дистиллированной воде и проверяли на наличие антимикробной активности методом диффузии в агар, нанося аликвоты (5 мкл) каждой собранной фракции на плотную питательную среду Schaedler, смешанной с клетками индикаторной культуры Listeria monocytogenes 88-BK в количестве 106 КОЕ/ мл. При наличии антимикробной активности осадок перерастворяли в 10 мМ трис-HCl для дальнейшего разделения катионообменной хроматографией. Катионообменную хроматографию проводили с использованием колонки Heparin HiTrap-Sepharose HP (2,5 x 5 см) (Amersham Biosciences, England). Элюирование проводили в ступенчатом градиенте NaCl (0 - 0,5 М в 10 мМ трис-HCl) в течение 120 мин при скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование поглощения проводили при длине волны 214 нм. Элюированные фракции объединяли по поглощению, обессоливали, как описано выше, упаривали досуха в вакуумном концентраторе и тестировали на наличие антимикробной активности. Чистоту полученных препаратов и ориентировочную молекулярную массу пептидов оценивали методом MALDI времяпролетной масс-спектрометрии (Bruker Daltonics, Germany). Масс-спектры обрабатывали с помощью программного обеспечения Bruker Data Analysis. Точность измерения масс находилась на уровне 0,015%. Для флуоресцентной окраски использовали набор LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, USA). Бактериальные клетки осаждали при 5000 g в течении 5 мин; полученный осадок ресу-спендировали в 1 мл дистиллированной воды, после чего доводили оптическую плотность взвеси клеток L. monocytogenes 88-BK до 0,1 (OD670) и E. тоИ K12 до 0,05 (OD670). Бактериальные клетки инкубировали в присутствии исследуемого препарата в течении 1 ч, после чего микроорганизмы окрашивали набором красителей. Измерение спектров флуоресценции (возбуждение 480 нм, эмиссия 490 - 700 нм) проводили на спектрометре Солар СМ2203 (Беларусь). Для атомно-силовой микроскопии выращенные клетки L. monocytogenes 88-BK и E. coli K 12 отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего к полученной суспензии добавляли исследуемый препарат. После инкубации в течение 1 ч клетки отмывали дистиллированной водой, в объеме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 30 - 60 мин. Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием атомно-силового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). В процессе сканирования использовали кантилеверы MSCT-AUNM («Vfeeco», США) с жесткостью балки 0,05 Н/м и радиусом порядка 10 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Расчет шероховатости поверхности бактерий проводили путем анализа АСМ-изображений клеточной поверхности фиксированной площади (500 х 500 нм). РЕЗУЛ ЬТАТЫ В процессе двухстадийной процедуры хроматографии из культуральной жидкости энтерококков были выделены пептидные фракции, обладающие антимикробными свойствами в отношении L. monocytogenes. Масс-спектрометрический анализ обессоленных тотальных пептидных экстрактов выявил набор компонентов с молекулярной массой в Рис. 1. Спектры флуоресценции окрашенной флуоресцентными красителями бактериальной популяции L. monocytogenes 88-BK (а) и E.coli К12 (б) контрольной группы (1) и обработанной препаратами очищенных пептидных экстрактов метаболитов энтерококков (2). Ось ординат - интенсивность флуоресценции (отн.ед.); ось абсцисс - длина волны (X, нм). пептидном диапазоне, определяющим отличием между ними было значение верхнего предела данных компонентов. Так, основное количество пиков на спектре препарата, полученного из штамма E. faecium 8, было в диапазоне 1,0 - 1,5 кДа, в то время как в препарате, полученного из штамма E. fae-cium 7, были детектированы отдельные пики до 3,0 кДа. Анализ пептидных профилей с помощью тандемной MALDI MS выявил наличие ряда сходных компонентов (фрагментов) с массой 1,0 - 1,3 кДа, на основании чего можно сделать предположение как о частичном перекрытии спектра соединений, секре-тируемых в культуральную среду разными штаммами, так и о том, что часть из них может быть фрагментами более высокомолекулярных веществ (белков или пептидов). Следующим этапом исследований стала оценка биологических эффектов выделенных пептидных экстрактов в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Для этого с помощью флуоресцентных красителей было определено мембраноповреждающее действие исследуемых препаратов. По окончании инкубации популяция листерий в контрольной группе была представлена преимущественно жизнеспособными клетками (рис. 1 а), о чем свидетельствовало наличие доминирующего пика в области 525 - 550 нм, соответствующей интенсивной флуоресценции SYTO 9. Похожие результаты были зафиксированны и в случае популяции эшерихий (рис. 1 б). Внесение в реакционную смесь очищенного пептидного экстракта метаболитов энтерококков вело к нарушению проницаемости клеточных структур и утрате жизнеспособности листерий, что фиксировалось как увеличение интенсивности флуоресценции в красной области спектра (рис. 1 а). В то же время, аналогичное опытное воздействие на популяцию кишечной палочки не приводило к значимым изменениям проницаемости клеточных барьерных структур для красителя пропидия йодида, как следует из данных спектроскопии (рис. 1 б). Рис. 2. АСМ-изображения интактных клеток L. monocytogenes 88-BK (А) и E.coli К12 (В), обработанных очищенными пептидными экстрактами E. faecium (Б и Г, соответственно). Шкала - 1 мкм (А, Б, В); 0,5 мкм (Г). На заключительном этапе работы с помощью метода атомно-силовой микроскопии выявили особенности морфофункциональной реакции грамположительных (L. monocytogenes 88-BK) и грамотрицательных (Escherichia coli K12) микроорганизмов на воздействие очищенных пептидных экстрактов (ОПЭ) из надосадочной жидкости культур E. faecium. Интактные клетки листерий имели относительно гладкий рельеф поверхности (рис. 2 А), среднеквадратичная шероховатость (отклонение точек профиля от его средней линии) которой составила 1,21±0,29 нм. Рельеф клеточной поверхности эшерихий оказался более развитым (рис. 2 В) со среднеквадратичной шероховатостью 2,35±0,45 нм. В опытной серии обработка листерий ОПЭ штамма E. faecium 7 привела к тому, что большая часть визуализированных объектов представлена клетками с выраженными признаками деструкции клеточной стенки (рис. 2 Б). Детальное исследование ультраструктуры поверхности выявило частичное разрушение клеточной стенки листерий. Среднеквадратичная шероховатость поверхности составила 4,00±0,70 нм, что значимо больше стандартных значений (P<0,05). Морфофункциональная реакция грамотрицательных бактерий E. coli при обработке ОПЭ энтерококков сопровождалась фрагментированием наружной мембраны (рис. 2 Г). Шероховатость поверхности подобных объектов увеличилась с 2,35±0,45нм до 7,59±0,65 нм (Р<0,05). ОБСУЖДЕНИЕ Ранее с помощью атомно-силовой микроскопии было охарактеризовано воздействие культуральной жидкости E. faecium на бактериальную популяцию L. monocytogenes [2]. Полученные при этом результаты морфофункциональной реакции бактерий оказались характерным ответом на воздействие антимикробных пептидов [4]. Продолжение работ в этом направлении было связано с исследованием особенностей биологической активности пептидной фракции, выделенной из культуральной жидкости энтерококков. В результате проведенных исследований из метаболитов E. faecium были выделены антимикробные вещества пептидной природы с молекулярной массой 1,0 - 3,0 кДа. Результатом опытного воздействия пептидов явилось нарушение целостности барьерных структур микробных клеток, что было продемонстрировано посредством флуоресцентной спектроскопии в отношении листерий. Полученные данные согласуются с имеющимися сведениями о механизме бактерицидного действия энтероцинов, направленного на цитоплазматическую мембрану клеток-мишеней с формированием в ней пор, что, в свою очередь, ведет к выходу внутриклеточного калия, аминокислот и других низкомолекулярных веществ [3]. Атомно-силовая микроскопия позволила обнаружить изменения клеточной морфологии как листерий, так и эшерихий, заключающиеся в увеличении показателя шероховатости клеточной стенки и наружной мембраны. Проведенные исследования выявили влияние бактериоцинов энтерококков на микроорганизмы с различным типом строения клеточной стенки и подтвердили важность нарушения проницаемости бактериальных барьерных структур в механизме антимикробного действия энтероцинов. Авторы выражают благодарность директору Центра коллективного пользования приборным оборудованием «Институт микро- и нанотехнологий» Оренбургского государственного университета Пашкевичу С.Н. за возможность проведения части экспериментальных работ с использованием приборного парка ЦКПИМНТ ОГУ.

About the authors

A. S Vasilchenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis; Orenburg State University

E. A Rogozhin

Schemyakin and Ovchinnikov Research Institute of Bioorganic Chemistry

A. V Valyshev

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files