ROLE OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF CORYNEBACTERIA IN ASSOCIATIVE SYMBIOSIS

Full Text

Микроорганизмы рода Corynebacterium - разнообразная группа грамположительных бактерий, занимающих различные биотопы тела человека. Выделяют патогенные коринебактерии, роль которых в развитии инфекции доказана. Типичными представителями являются C. diphtheriae, С. ulcerans, С. pseudotuberculosis [42, 55, 56]. Данные бактерии вызывают развитие дифтерии и дифтериеподобные заболевания у человека. Кроме того, выделяют недифтерийные или условно патогенные коринебактерии, которые являются частью резидентной микрофлоры человека, и их роль в развитии инфекции окончательно не ясна [23]. Авторы рассматривают отдельных представителей данной группы микроорганизмов не только как участников в формировании микробиоценозов и обеспечении колонизационной резистентности различных биотопов тела человека, но и в качестве микроорганизмов, перспективных для пробиотикотерапии [7, 34]. Роль коринебактерий в развитии инфекции известна с 1883 г., когда возбудитель был обнаружен Эдвином Клебсом на срезах пленок, полученных из ротоглотки больных. Через год Фридрихом Лёффлером была выделена чистая культура C. diphtheriaе. В литературе широко описаны случаи различных инфекций у человека, вызванных другими видами коринебактерий: C. xerosis, C. amycolatum, C. striatum, C. minutissimum, C. pseudo-diphtheriticum, C. matruchoti, C. aquaticum, C. genitalium и C. pseudogenitalium и др. В зависимости от биологических особенностей разные виды коринебактерий способны поражать кожу и внутренние органы, особенно у пожилых людей, пациентов с иммуносупрессией или мультиорганной патологией. Многие из них становятся причиной септического артрита и остеомиелита, инфекций при протезировании, заболеваний мочеполовой системы, эндокардитов, пневмоний [26, 27, 50, 59]. Обсемененность различных биотопов коринебактериями по данным различных авторов составляет от 103 до 105 КОЕ/мл [9, 23]. С поверхности кожи чаще всего выделяют C. minutissimum, C. pseudotuberculosis, C. jeikeium, C. amycolatum [47]. Со слизистой миндалин и ротовой полости C. xerosis, C. minutissimum, C.hofmannii [4]. Из уретры мужчин - C. genitalium, C. pseudogenitalium, C. equi, C. seminale, C. xerosis [2]. В вагинальном биотопе присутствуют С. aquaticum, С. jeikeium var. genitalium, С. kutscheri, C. xerosis, С. jeikeium var. pseudogenitalium, C. minutissimum, C. pseudodiphtheriticum, C. renale, C. amycolatum [5, 6, 14]. Несмотря на относительно длительную историю изучения рода Corynebacterium и многочисленные попытки систематизировать накопленные данные и представить их классификацию, последняя до сих пор подвергается постоянному пересмотру и расширению [23]. На основе современной систематики, а также по классификации Берджи (1994) род коринебактерий входит в семейство Corynebacteriaceae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria, тип Actinobacteria, царство Бактерии [23] и включает 88 видов. Большинство видов выделены от человека и являются возбудителями случайных и крайне редких инфекций или представителями резидентной микрофлоры различных биотопов. Кроме того, коринебактерии присутствуют в микрофлоре животных и птиц, а также источником их выделения являются объекты окружающей среды. Проведенные в последние годы исследования по таксономии рода Corynebacterium с использованием методов генетики и молекулярной биологии (определение нуклеотидного состава ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот) [18], метода анализа нуклеотидных последовательностей в рибосо-мальных РНК [35], газожидкостной хроматогорафии клеточных жирных кислот [29], полного секвенса генома бактериальной клетки [58], масс-спектрофотометрии [18] позволили получить новую информацию о характеристике известных и выявить ряд новых видов бактерий рода Corynebacterium: С. aquatimens sp. nov., C. ihumii sp. nov., C. pyruvicip-roducens sp. nov., C. humireducens sp. nov. [19, 44, 57, 60]. Являясь частью микробиоты человека коринебактерии вступают во взаимодействие как с организмом хозяина, так и с микроорганизмами, что делает их неотъемлемой частью ассоциативного симбиоза. Не являются исключением патогенные и условно патогенные коринебактерии, вызывающие различные инфекционно-воспалительные процессы у человека, поскольку инфекция рассматривается в качестве модели ассоциатвиного симбиоза [3]. Естественно, в условиях взаимоотношений с микробиотой и хозяином коринебактерии реализуют ряд биологических свойств (адгезия, факторы патогенности, антагонизм, антибиотикорезистентность), которые могут определять их участие в ассоциативном симбиозе как доминантных или ассоциативных микроорганизмов. Адгезивная способность коринебактерий. Одной из важных биологических характеристик коринебактерий является их способность прикрепляться к поверхности эукариотических клеток макроорганизма. Адгезия микроорганизмов к тканям хозяина осуществляется в основном за счет поверхностных белков и фимбрий [37]. У патогенных видов коринебактерий, в частности, у C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pilosum [33, 55] хорошо изучены пили, или фимбрии - нитевидные структуры, ответственные за процесс прикрепления бактерий к эпителиальным клеткам хозяина. Как и у других грамположительных бактерий, сборка пилей коринебактерий происходит двуступенчато. В сборке участвуют специализированные для поверхностных белков LP*TG ферменты сортазы, которые детерминированы в кластерах генов пилина [37]. С. diphtheriae продуцирует три типа пилей, различных по струткуре: SpaA-, SpaD-, SpaH-тип. Схожий с другими типами прототип SpaA пилей содержит SpaA формирующий остов (вал) пилей и два минорных пилина SpaB/SpaC, локализованных в основании и верхней части соответственно. Минорные пилины SpaB/SpaC имеют решающее значение в прикреплении патогена к эпителиальным клеткам гортани и таким образом являются основными структурами в адгезии и развитии инфекционного процесса у человека [61]. Подобные структуры ранее в литературе были названы геммаглю-тининами [38]. Оказалось, что фимбрии не были единственной структурой, связанной с геммаглюти-нирующей активностью C. diphtheriae [38]. Устойчивость геммаглютининов к воздействию таких факторов как кипячение, детергенты и трипсин подтверждает вовлечение в процесс адгезии нефимбриальных структур, находящихся на поверхности бактериальной клетки [38]. Кроме фимбрий у коринебактерий в процессе адгезии участвуют поверхностные белоксодержащие биополимеры. Наиболее изучены белоксодержащие биополимеры у C. diphtheriae и C. glutamicum [28, 52], у них исследованы порины - белок PS1, имеющий миколтрансферазную активность и белок PS2, формирующий S-слой клеток [21]. Известно, что белоксодержащие биополимеры C.diphtheriae могут играть роль ответственных за адгезию антигенных детерминант, связывать бактериофаги и иммуноглобулины [38, 42], штаммы C.ulcerans - связывать фибриноген, фибронектин и коллаген [55]. Часто функцию медиаторов адгезии у микроорганизмов выполняют ассоциированные с клеткой лектины - белки, биологическая роль которых состоит в прямом нековалентном взаимодействии с углеводами или гликоконьюгатами, следствием чего является реакция агглютинации или преципитации [10, 38]. Сведения о лектинах коринебактерий в литературе весьма ограничены и касаются в основном патогенных представителей рода - C. diphtheriae, C. parvum и C. pyogenus в связи с их участием в инфекционных процессах. Так. у C. diphtheriae описаны поверхностные лектиноподобные нефимбриальные белки с молекулярной массой 67 и 72 кДА, которые могут функционировать как адгезины и способны связываться с рецепторами эритроцитов человека. Исследования по лектинам непатогенных коринебактерий ограничены. Подгорский В.С. и соавт. (2011) в своей работе при изучении лектиновых свойств клеток непатогенных коринебактерий установили и наличие лектинов, связанных с внутренними слоями клеточной стенки у С. ammoniagenes, C. glutamicum, C. flavescens, С. terpenotabidum, C. variabile, C. vitaeruminis. Лектины исследуемых микроорганизмов обладали уникальной специфичностью к углеводам и сиа-ловым кислотам. Romeo-Steiner S. et al. [47] изучили адгезивную способность коринебактерий C. pseudotuberculosis, C. group F-1, C. group JK, C. minutissimum, C. group G-2, C. xerosis, выделенных из подмышечной впадины здоровых пациентов, к буккальным эпителиоцитам и дифференцированным и недифференцированным кератиноцитам и влияние на адгезивную способность коринебактерий маннозы, галактозы, ^ацетил^-глюкозамина и фибро-нектина. Оказалось, что вышеперечисленные соединения существенно снижали адгезивную способность исследуемых штаммов как к буккальным эпителиоцитам, так и к кератиноцитам. Способность коринебактерий связывать маннозу, галактозу, N-ацетил-D-глюкозамин и фибронектин доказывает наличие различных рецепторов и адгезинов на поверхности этих бактериальных клеток. Вероятно, наличие различных адгезинов и рецепторов на поверхности коринебактерий обусловливает их способность не только колонизировать различные биотопы тела человека, но и конкурировать за сайты адгезии с другими условно патогенными микроорганизмами, что является важным фактором в поддержании колонизационной резистентности. Помимо специфической адгезии, основанной на молекулярном взаимодействии между адгезинами микробных клеток и специфическими рецепторами мембраны клеток-мишеней [22], прикрепление коринебактерий к эукариотическим клеткам представляет собой сложный неспецифический процесс, который может быть обусловлен физикохимическими взаимодействиями бактерий с поверхностью. К ним относятся электростатические, гидрофобные, Вандер-Ваальсовы взаимодействия, броуновское движение. По мнению ряда исследователей [17, 48] на начальной стадии адгезии бактерий к субстрату определяющую роль играет гидрофобность их поверхности. Данное свойство дает бактериальным клеткам возможность преодолевать электростатический барьер эпителия и обусловливает, таким образом, первый неспецифический этап взаимодействия. Исследование по гидрофобности рода Corynebacterium ограничено несколькими видами: C.diphtheriae, C.renale, C. pilosum [33, 48]. Выявлена прямая связь степени гидрофобности клеточной поверхности C.diphtheriae и адгезивности [33], C. jeikeium var. genitalium, С. kutscheri, C. minutissimum [9]. С одной стороны, наличие гидрофобной поверхности - дополнительный фактор успешной колонизации для коринебактерий, с другой стороны, для патогенных микроорганизмов - важный фактор в развитии инфекционного процесса, так как наличие гидрофобной поверхности помогает коринебактериям уклоняться от фагоцитоза. Взаимодействие коринебактерий с микроорганизмами. Являясь частью единой микроэкологической системы человека, коринебактерии находятся в тесном взаимоотношении с другими условно патогенными микроорганизмами, населяющими различные биотопы тела человека. Результирующей этих взаимодействий может явиться формирование нор-мо или патоценозов. Коринебактерии располагают широким арсеналом антимикробных факторов. Антагонистичнская активность коринебактерий связана с продукцией бактериоцинов и бактериоцинподобных субстанций, органических кислот, лизоцима. Еще в 1977 году Nakano H. et al. [40] обнаружили у C. hydrocarboclastus наличие кори-нецина (аналога хлорамфеникола), по своим свойствам обладающего бактерицидной активностью по отношению к грамположительным бактериям (коккам и палочкам). Позже Kwaszewska A. et al. [36] у 90% исследуемых коринебактерий, выделенных с кожи пациентов, определили наличие бактериоцин-подобной субстанции. Спектр ее активности охватывал грамположительные бактерии. Наличие бактериоцинов у коринебактерий позволяет конкурировать с условно патогенными микроорганизмами в различных биотопах тела человека и адаптироваться к условиям местообитания. С одной стороны, бактериоциногенность патогенных видов коринебактерий способствует их распространению в биотопах, а с другой - бактериоци-ны могут играть защитную роль, а их продуцентов можно рассматривать как представителей индигенной нормальной микрофлоры хозяина. В данном случае бактериоцино-гению непатогенных коринебактерий, по-видимому, можно отнести к факторам колонизационной резистентности организма. Другим важным фактором экологической значимости в межмикробном взаимодействии, выявленным у коринебактерий, является способность микроорганизмов продуцировать лизоцим. Данный фермент относится к классу ферентов-мурамидаз, субстратом действия которых является пептидогликан бактерий. Лизоцим микроорганизмов имеет значение как антагонистически важный фактор [1], участвующий в формировании микробного биоценоза. Наличие лизоцимной активности было выявлено у коринебактерий, выделенных из репродуктивного тракта здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями. Данным признаком обладали следующие виды: С. aquaticum, С. bovis, С. jeikeium var. genitalium, С. jeikeium var. pseudogenitalium, С. kutscheri, С. minutissimum, С. pseudodiphteriticum, С. renale, С. xerosis, C. amycolatum [9]. Отдельного внимания заслуживают неспецифические механизмы антагонистического действия коринебактерий в отношении грампозитивной и грамнегативной микрофлоры, включающее ингибирующее действие молекул органических кислот, вызывающих локальное снижение рН в различных биотопах. Способность коринебактерий продуцировать молочную, пропионовую и уксусную кислоту, тем самым сдвигая рН среды в «кислую» сторону, исследователи рассматривают как дополнительный механизм, способствующий формированию и восстановлению микробиоценозов. Так, поддерживая кислую рН в вагинальном биотопе, коринебактерии предотвращают его заселение условно патогенной флорой [8]. Коринебактерии способны продуцировать ингибиторы каталазы, которые не только локализуются внутриклеточно, но и выделяются в культуральную жидкость [11]. Секреция коринебактериями ингибиторов каталазы играет важную роль в межмикробных взаимодействиях. Предварительная обработка клеток S.aureus внеклеточными метаболитами коринебактерий повышала чувствительность стафилококков к перекиси водорода и приводила к снижению прироста биомассы в опыте по сравнению с контролем. Выявленный эффект ингибирования активности каталазы S.aureus коринебактериями можно рассма-тивать как один из возможных механизмов межклеточных взаимодействий, определяющих формирование микробиоценозов. Кроме того, был выявлен эффект потенцирования коринебактериями антагонистической активности перекись продуцирубщих лактобацилл по отношению к условно патогенным микроорганизмам [15]. Феномен потенцирования антагонизма зависел от уровня перекись продукции лактобацилл и уровня ингибиторов каталазы коринебактерий. Приведенные данные фактически являются аргументом в пользу доказательства наличия симбиотических взаимодействий коринебактерий и лактобацилл в реализации колонизационной резистентности. Таким образом, непатогенные коринебактерии продуцируют широкий спектр веществ, определяющих их антагонистическую активность. Данное свойство характеризует их конкурентоспособность в экологической нише и, вероятно, является определяющим в формировании нормо- и патоценозов. Факторы патогенности коринебактерий..Адгезируясь на поверхности эпителиальных клеток-мишеней хозяина, патогенные коринебактерии способны вызывать развитие ряда инфекционных заболеваний. Роль патогенных коринебактерий в развитии инфекционного процесса связана с наличием факторов инвазии, главным из которых является дифтерийный токсин (ДТ) - основной фактор вирулентности C. diphtheriae. ДТ состоит из одиночной полипептидной цепи с молекулярной массой 58 350 Да, которая, в свою очередь, состоит из 3 структурно-функциональных доменов. Содержащий аминогруппу компонент (фрагмент A) с молекулярной массой 21 кДа содержит домен, катализирующий с использованием НАД рибозилирование АДФ эукариотического фактора элонгации 2, который инактивирует синтез белка в клетках человека. Карбокситерминальный компонент токсина - фрагмент Б (39 кДа) - содержит эукариотический рецепторосвязывающий и гидрофобный домены, отвечающие за транспорт каталитического домена через эндо-сомальную мембрану в цитозоль [44]. Дифтериеподобный токсин был обнаружен еще у двух представителей рода Corynebacterium: C. ulcerans и C. pseudotuberculosis. Кроме ДТ у этих же микроорганизмов обнаружены сиалидазы [58], часто обозначаемые как нейрами-нидазы, ферменты гликозил-гидролазы, которые избирательно отщепляют от различных гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов сиаловые кислоты. Под влиянием этого фермента повреждаются мембраны клеток. Наличие нейраминидазы у данных микроорганизмов рассматривается как фактор вирулентности [39]. Дифтерийный токсин и нейраминидазная активность, как правило, не встречаются у условно патогенных видов или встречаются достаточно редко. При оценке способности продуцировать нейрамини-дазу Краева Л.А. и соавт. [4] установили, что 97% исследуемых культур C. nondiphtheriae (C. pseudotuberculosis, C. urealyticum, C. ulcerans) не продуцировали ее или нейрамини-дазная активность была низкой, в то время как у 71% изолятов C. diphtheriae нейрамини-дазная активность была высокой. Благодаря наличию дифтерийного токсина, поверхностных структур и секретируемых факторов патогенности, штаммы С. diphtheriae способны вызывать апоптоз макрофагов, что является одним из механизмов реализации патогенных свойств и развития инфекционного процесса данного штамма [12]. У С. diphtheriae обнаружен белок DIP0733, который может быть напрямую связан с бактериальной инвазией и индукцией апоптоза эпите-лиоцитов на ранней стадии дифтерии и инфекций, связанных с инвазией Cdiphtheriae [51]. Индукция апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя выживанию. Другие патогенные виды коринебактерий, в частности C. pseudotuberculosis, также способны вызывать индукцию апоптоза макрофагов. Влияние коринебактерий на запрограммированную гибель макрофагов была определена на индукции апоптоза в культуре макрофагов мышей клеточной линии macrophage cell lines J774, инфицированных бактериями. Штаммы C. pseudotuberculosis могли выживать в макрофагах более 48 часов [56]. Важным биологическим свойством, позволяющим коринебактериям выживать в биотопах, является способность секретировать различные субстанции, направленные на инактивацию механизмов иммунитета организма. Ранее было показано наличие антилизоцим-ной (АЛА), антикомплементарной (АКА), антигистоновой (АГА), анти-ДНКазной активности у коринебактерий, выделенных из различных биотопов тела человека [4, 5, 9, 14]. Авторы прослеживают прямую корреляцию между продукцией данных факторов и вирулентностью у отдельных штаммов коринебактерий. Наличие секретируемых факторов персистенции у патогенных и условно патогенных коринебактерий, с одной стороны, способствует уклонению от иммунной системы хозяина, что играет важную роль в развитии инфекции, с другой стороны, те же факторы для коринебактерий как представителей резидентной флоры могут обеспечивать выживание в условиях воздействия факторов врожденного иммунитета. Константинова О.Д. [5] выявила высокую распространенность АЛА и АКА у клинических изолятов вагинальных коринебактерий, выделенных как от здоровых женщин, так и у женщин с эндометритами. В популяционной структуре Corynebacterium spp. были представлены клоны с различной выраженностью указанных признаков. Одинцова О.В. [9] при изучении биологических свойств коринебактерий, изолированных из вагинального биотопа, выявила, что культуры с АЛА чаще выделяли от пациенток с неспецифическими воспалительными процессами влагалища (70%) и здоровых рожениц (62%). Причем уровень экспрессии АЛА исследуемых микроорганизмов был невысоким и не зависел от микроэкологического состояния биотопа. Однако автор предположила, что высокая частота АЛА культур, полученных от рожениц, в сочетании с малой выраженностью данного признака может служить необходимым фактором для закрепления кори-неформ в качестве резидентной микрофлоры. АЛА коринеформных бактерий может рассматриваться как дополнительный фактор, способствующий их доминированию в вагинальном микробиоценозе. Антибиотикорезистентность. Применение антибиотиков в клинической практике приводит к нарушению микробной экологии человека, т. к. антибиотики оказывают специфическое действие не только в месте локализации инфекции, но влияют и на нормальную микрофлору [16]. Изучение чувствительности к антибиотикам коринебактерий как возбудителей тяжелых инфекционных заболеваний широко освещено в литературе. По данным Olender A. [41] одной из серьезных проблем, связанных с лечением инфекций, вызванных коринебактериями, является выделение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью и соответственно выбор антибиотика для лечения. Это определяется наличием детерминант патогенности и устойивости к антибиотикам в одних и тех же носителях генетической информации (плазмидах). Как у патогенных, так и у условно патогенных коринебактерий [46] описаны гены, которые приводят к появлению различных механизмов устойчивости к антибиотическим веществам, например, устойчивости к тетрациклину (tetA, tetB и tetM гены) у C. striatum [45], фторхинолонам (единичные или множественные мутации в субединице А гиразы) и стрептограмину В (MLSB) у C. macginleyi, C. striatum и C. amycolatum [54]. По данным Gomez-Garces et al. [32] и Fernandez-Roblas et al. [31] высокий уровень устойчивости к макролидам и линкозамидам у микроорганизмов рода Corynebacterium был основан на продукции rRNA метилазы, которая вызывала двойное метилирование аденина 23S rRNA и приводила к изменениям в структуре сайта связывания антибиотика. Ген erm кодирует этот фермент [20], который относится к классу X для коринебактерий [46]. Ген erm X был обнаружен у многих видов коринебактерий: C. diphtheriae, C. jeikeium, C. xerosis, C. striatum [25] и C. pseudodiphtheriticum, C. accolens, C. tuberculostearicum, C. aurimucosum, C. pseudogenitalium [41]. Ген erm X может быть локализован в плазмиде pNG2 [29], связан с транспозоном Tn5432 в R плазмиде pTP10 [49] и в хромосоме [45]. С другой стороны, для непатогенных коринебактерий множественная лекарственная устойчивость может выступать как фактор адаптации. В литературе существует ряд работ по изучению исходного спектра чувствительности к антибиотикам коринебактерий, выделенных из различных биотопов тела человека [9, 23]. На примере вагинального биотопа нами [14] изучена чувствительность коринебактерий к антибиотическим веществам с различным механизмом воздействия на бактериальную клетку. В большинстве случаев исследуемые штаммы проявляли высокую резистентность к бета-лактамам (оксациллину и пенициллину), макролидам (эритромицину) и ко-тримоксазолу. При этом высокая резистентность к данным антибиотикам выявлена у коринебактерий, выделенных как у здоровых женшин, так и у женщин с микроэкологическими нарушениями. Резистентность к оксациллину была высокой у всех доминирующих видов: C. minutissimum, C. amycolatum и C. group JK. У штаммов С. group JK была выявлена высокая резистентность к широкому спектру антибиотиков, что, вероятно, является генетически обусловленной резистентностью данного вида. Наличие у коринебактерий устойчивости к различным антибиотическим веществам, вероятно, выступает как фактор адаптации и определяет возможность сохранения и пер-систенции их как в нормоценозе, так и при микроэкологических нарушениях в условиях проводимой антибиотикотерапии. Таким образом, микроорганизмы рода Corynebacterium spp. широко представлены в микрофлоре тела человека, причем их количество и видовой состав имеют свои особенности в различных биотопах. Длительное существование коринебактерий в макроорганизме обеспечивается, с одной стороны, разнообразными механизмами, определяющими колонизирующую способность этих микроорганизмов, а с другой - их устойчивостью к факторам естественной резистентности организма хозяина и высокой способностью адаптироваться к микроэкологическим условиям. Вступая в симбиотические взаимодействия с организмом хозяина, доминантными и ассоциативными микроорганизмами они принимают важное участие в формировании ассоциативного симбиоза различных биотопов тела человека.

About the authors

I. V Gladysheva

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

S. V Cherkasov

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files