EPITOPIC SPECIFICITY OF A SYNTHETIC DISACCHARIDE, RECURRING LINK OF CAPSULE POLYSACCHARIDE CHAIN OF SEROTYPE 3 STREPTOCCUS PNEUMONIAE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции полисахаридными и конъюгированными вакцинами, покрывающими 80 - 90% серотипов штаммов, выделяемых от пациентов при заболеваниях пневмококковой этиологии, привела к снижению заболеваемости во всех возрастных группах населения [1, 5, 9]. В то же время, показано, что применение традиционных вакцин на основе капсульного полисахарида пневмококка не предотвращает появления антибиотикоустойчивых штаммов этого возбудителя [14, 16, 22], новых серотипов пневмококка [12, 17, 18], а состав применяемых зарубежных вакцин не учитывает региональные особенности распространения штаммов в России и возможное изменение эпидемиологической ситуации. Наряду с этим, к недостаткам вакцин на основе капсульных полисахаридов относится сложность технологии их получения и освобождения от бактериальных примесей, не всегда успешное проведение ковалентного присоединения нескольких полисахаридов к белку-носителю из-за их высокой молекулярной массы и недостаточной степени очистки [8, 19]. Эти факторы определяют высокую стоимость таких вакцин и ограничивают их массовое применение в практике. В связи с этим, приоритетным направлением современной вакцинологии является разработка синтетических и полусинтетических пневмококковых вакцин [7, 20]. Эпитопы капсульного полисахарида пневмококка могут быть представлены олигосахаридами, полученными путем химического синтеза. Иммунный ответ на олигосахариды высокоспецифичен. Некоторые олигосахариды, конъюгированные с белком, индуцируют образование более высокого уровня антител (АТ) к капсульному полисахариду, чем традиционные полисахаридные конъюгатные вакцины [11]. В ранее проведенных исследованиях нами показано, что синтетический гексасахарид, отражающий участок цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (БСА), является иммуногенным, вызывает образование протективных IgG и защищает мышей от заражения пневмококком этого серотипа [3]. Дальнейшие исследования предполагают проведение синтеза олигосахаридных фрагментов других серотипов пневмококка для последующего создания поливалентной полусинтетической конъюгированной вакцины. В настоящей работе исследованы иммунологические свойства синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3, значимость которого в последние годы возрастает [1]. По данным российских исследователей штаммы этого серотипа являются частой причиной осложненной и неосложненной пневмонии, отита, а также встречаются при назофарингеальном носительстве [6]. Цель работы - изучение эпитопной специфичности синтетического дисахарида, повторяющегося звена капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированного с БСА. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использованы мыши линии BALB/c массой 14 - 16 г, самцы, кролики породы шиншилла массой 2,5 - 3 кг из питомника НЦ биомедицинских технологий (филиал «Андреевка»); синтетический дисахарид, отражающий повторяющееся звено капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгировали с БСА скваратным методом [4]. Конъюгат дисахарида [pGlcA-(1-4)P-Glc-O-спейсер]l9-БСА содержал 19% углеводов. Разовая иммунизирующая доза конъюгата дисахарида составляла 8 мкг/мышь в расчете на олигосахарид. Гидроксид алюминия прибавляли к конъюгату из расчета 0,5 мл на 1 мг сухого препарата, сорбцию проводили в течение ночи при температуре +4°C. Препарат, содержащий капсульный полисахарид S. pneumoniae типа 3, получали из инактивированных ацетоном микробных клеток однократной водной экстракцией с последующим лиофильным высушиванием. Присутствие капсульного полисахарида в препарате подтверждено методом ингибирования ИФА при сорбции на планшетах конъюгата синтетического дисахарида. Антимикробные сыворотки к S. pneumoniae серотипа 3 получали при использовании двух видов животных - мышей и кроликов. Для получения мышиных антимикробных сывороток мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно дозой 500 мкг инактивированных ацетоном сухих микробных клеток штамма S. pneumoniae серотипа 3 в расчете на мышь 6-кратно с интервалом 7 суток. Сыворотку крови получали через 20 дней после последней иммунизации, аликвотировали и хранили при температуре минус 80°C. Иммунизацию кроликов проводили внутривенно многократно увеличивающимися дозами инактивированных микробных клеток в течение 30 дней. Общее количество инъекций: 12 - 15. Сыворотки лиофильно высушивали и хранили при +4°C. Для последующей оценки возможной перекрестной активности конъюгата дисахарида получали антимикробные сыворотки к S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19А, 19F и 23F. Мышей иммунизировали 4 - 5-кратно внутрибрюшинно нарастающими сублетальными дозами живой культуры каждого серотипа пневмококка, начиная с дозы 500х106 микробных клеток, с интервалом между введениями 14 дней. Сыворотку крови получали на 14 сутки после последней иммунизации, аликвотировали и хранили при температуре минус 80°C. Антигенную активность синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 определяли методом конкурентного ИФА при сорбции на планшетах бактериального капсульного полисахарида этого серотипа пневмококка в концентрации 10 мкг/ лунка [2]. Процент ингибирования сыворотки рассчитывали по формуле: 100% - [(У/Х х 100)]%, где Х - оптическая плотность сыворотки (ОП450) до внесения антигена, У - ОП450 после прибавления антигена. Титр IgG к S. pneumoniae серотипа 3 в антимикробных сыворотках крови определяли методом ИФА [2] при использовании в качестве покрывающего лунки антигена конъюгата дисахарида. Для определения титра IgG в сыворотке крови мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида, на планшетах сорбировали препарат капсульного полисахарида. В качестве контроля использовали сыворотки неиммунизированных животных. Статистическую обработку данных проводили при использовании программного обеспечения Statistica 8. Достоверность различий между сравниваемыми группами определяли методом Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Рис. 1. Выбор оптимальной сорбирующей дозы дисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированного с БСА, на полистироловых аланшетах. Титр IgG - последнее разведение антимикробной сыворотки кролика, превышающее ОП450 в контроле не менее, чем в 2 раза. Здесь и на рис. 2, 3: данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, * р<0,05 по тесту Манна-Уитни. Для проведения исследований разработана экспериментальная твердофазная ИФА тест-система, предназначенная для определения АТ к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма. Оптимальную сорбирующую дозу конъюгата дисахарида, позволяющую выявить наибольшее количество АТ, исследовали в диапазоне концентраций от 1,6 до 0,0125 мкг/лунка. Результат оценивали по титру IgG к дисахариду - повторяющемуся звену капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в антимикробной сыворотке кроликов, иммунизированных инактивированными бактериями этого же серотипа (рис. 1). Оптимальная сорбирующая доза конъюгата дисахарида, позволяющая выявить наибольший уровень IgG (1:3200) в антимикробной сыворотке кроликов, составляла 0,2 - 0,4 мкг в расчете на лунку по сравнению с другими испытанными концентрациями (p<0,05). В дальнейшей работе использовали концентрацию конъюгата дисахарида 0,4 мкг/лунка. Рис. 2. Оценка специфичности ИФА тест-системы в реакции с антимикробными сыворотками животных к различным серотипам S. pneumoniae. Сорбирован конъюгат дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в концентрации 0,4 мкг/лунка. а - антимикробная кроличья сыворотка к S. pneumoniae серотипа 3; К - контроль. Для оценки специфичности экспериментальной тест-системы определяли титр IgG в кроличьих и мышиных антимикробных сыворотках к серотипу 3, а также серотипам 6B, 10A, 19A, 19F, 23F, выбранных в качестве отрицательного контроля (рис. 2). Результат сравнивали с титром АТ у неиммунизированных животных (контроль). Оценка специфической активности ИФА тест-системы показала, что конью-гат синтетического дисахарида взаимодействовал только с IgG к S. pneumoniae серотипа 3 (p<0,05). В остальных антимикробных сыворотках (6В, 10А, 14, Рис. 3. Конкурентный ИФА с антигенами S. pneumoniae серотипа 3. Сорбирован конъюгат синтетического дисахарида с БСА в концентрации 0,4 мкг/лунка. Разведение антимикробной кроличьей сыворотки 1:400. К - контроль сыворотки; КП - бактериальный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3. Ингибирование активности сыворотки проводили в концентрации 10 мкг/лунка каждым из препаратов. 19F и 23F) титр АТ соответствовал уровню, определяемому у неиммунизированных животных (контроль), что подтвердило специфичность разработанной ИФА тест-системы. Антигенную активность синтетического дисахарида, конъюгированного с БСА, и его составляющих - дисахаридно-го лиганда и БСА, а также бактериального капсульного полисахарида определяли методом конкурентного ИФА при использовании разработанной тест-системы. Результат оценивали по проценту ингибирования IgG в антимикробной сыворотке кролика (рис. 3). Конъюгат дисахарида, дисахарид per se и капсульный полисахарид снижали ОП450 антимикробной контрольной сыворотки с 1,04 до 0,22 (p<0,05); 0,87 и 0,448 ед. (p<0,05) соответственно, то есть процент ингибирования АТ к повторяющемуся звену капсульного полисахарида для каждого из этих препаратов составил 78,8; 16,3 и 56,9%. БСА не вступал в реакцию с сывороточными антителами, следовательно, его вклад в ингибирование сыворотки в составе конъюгата дисахарида можно исключить. Для выявления способности конъюгата дисахарида вызывать образование IgG к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 мышей иммунизировали конъюгатом, сорбированным на гидроксиде алюминия, двукратно разовой дозой 8 мкг по дисахариду в расчете на мышь. Титр IgG определяли на 14 сутки после второй иммунизации. Установлено, что титр IgG к капсульному полисахариду в сыворотке крови иммунизированных мышей составил 1:1600 по сравнению с неиммунизированными животными (1:200), то есть в 8 раз превышал контрольные значения (p<0,05). ОБСУЖДЕНИЕ Разработка пневмококковых вакцин на основе синтетических олигосахаридов, отражающих фрагменты цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae, является приоритетным направлением современной вакцинологии. В различных лабораториях мира получен ряд синтетических олигосахаридов серотипов 1-4, 6А/В, 7F, 8, 9A/V, 14, 17F, 18C, 19A/F, 22F, 23F, 27, 29 [13]. Конъюгаты белков-носителей с некоторыми синтетическими олигосахаридами, отвечающими фрагментам капсульных полисахаридов различных серотипов, были исследованы в качестве потенциальных вакцин [10]. В настоящей работе исследована эпитопная специфичность синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 и его способность в составе конъюгата с БСА индуцировать образование IgG к капсульному полисахариду этого серотипа пневмококка. При разработке ИФА тест-системы установлено, что оптимальная концентрация конъюгата дисахарида, сорбированного на планшете, составила 0,2 - 0,4 мкг в расчете на лунку. Использование такой сорбирующей дозы позволило выявить наиболее высокий уровень АТ в поликлональной антимикробной кроличьей сыворотке. Показано, что конъюгат дисахарида, сорбированный на планшете, характеризовался высокой степенью специфичности и взаимодействовал только с IgG к S. pneumoniae серотипа 3 в сыворотках животных, не вступая в реакцию с антителами к другим серотипам пневмококка (6B, 10A, 19A, 19F, 23F). Разработанная высокочувствительная и специфичная ИФА тест-система для определения уровня антител к S. pneumoniae серотипа 3 дополняет ранее предложенную тест-систему на основе синтетического гексасахарида серотипа 14 [2]. В реакции конкурентного ИФА выявлено, что дисахарид, конъюгированный с БСА, на 78,8% ингибировал связывание АТ, присутствующих в поликлональной антимикробной сыворотке крови кроликов, иммунизированных инактиврированными бактериальными клетками S. pneumoniae серотипа 3. Доказано, что АТ к БСА, которые могут присутствовать в сыворотке иммунизированных животных, не влияли на результат реакции. Ингибирующая активность бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3 составила 56,9%. Сходные результаты получены нами ранее при исследовании свойств конъюгата гексасахарида S. pneumoniae серотипа 14 [2] и согласуются с данными других авторов, исследовавших ингибирующую активность синтетических олигосахаридов S. pneumoniae серотипа 14 [15]. Меньшая антигенная активность капсульного полисахарида могла быть связана с недостаточной степенью его очистки от бактериальных примесей, а также отсутствием взаимодействия с олигосахарид-специфическими АТ, присутствующими в антимикробной сыворотке [15], которые могут вносить свой вклад в ингибирование реакции. Safari D. et al. [21] при исследовании иммуногенной активности конъюгатов синтетических олигосахаридов S. pneumoniae серотипа 14 показали, что в большинстве иммунных сывороток присутствуют олигосахарид-специфические антитела, не все из которых распознают капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14. То есть, выявленное нами присутствие в антимикробных сыворотках антител к дисахариду не позволяло сделать заключение о том, будут ли они распознавать капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3. Способность антител к дисахариду вступать во взаимодействие с капсульным полисахаридом была доказана при исследовании сывороток мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в ИФА, где в качестве покрывающего лунки антигена использовали бактериальный капсульный полисахарид. Установлено, что в сыворотке крови мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида, в высоком титре (1:1600) присутствуют IgG к капсульному полисахариду. Аналогичные данные получены при исследовании иммуногенной активности синтетического гексасахарида, отражающего участок цепи S. pneumoniae серотипа 14 [3]. На основе полученных данных сделан вывод о том, что синтетический дисахарид, отражающий единичное повторяющееся звено капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, содержит ключевой эпитоп. Использование иммуногенных синтетических олигосахаридов актуальных серотипов пневмококка открывает путь для создания полусинтетической конъюгированной поливалентной пневмококковой вакцины, наиболее важным преимуществом которой является возможность быстрой замены ее серотипового состава в соответствии с эпидемиологической ситуацией и региональными особенностями.

About the authors

E. A Kurbatova

Mechnikov Reasearch Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

N. K Akhmatova

Mechnikov Reasearch Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

N. B Egorova

Mechnikov Reasearch Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

I. B Semenova

Mechnikov Reasearch Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

N. E Yastrebova

Mechnikov Reasearch Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

Yu. E Tsvetkov

Zelinsky Institute of Organic Chemistry

Moscow, Russia

E. V Sukhova

Zelinsky Institute of Organic Chemistry

Moscow, Russia

D. V Yashunsky

Orekhovich Research Institute of Biomedical Chemistry

Moscow, Russia

N. E Nifantiev

Zelinsky Institute of Organic Chemistry

Moscow, Russia

References

Supplementary files