ЭПИТОПНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО ДИСАХАРИДА, ПОВТОРЯЮЩЕГОСЯ ЗВЕНА КАПСУЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА STREPTOCCUS PNEUMONIAE СЕРОТИПА 3


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Изучение эпитопной специфичности синтетического дисахарида, повторяющегося звена S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Материалы и методы. Конъюгат синтетического дисахарида с БСА получали скваратным методом. Антигенную активность конъюгата исследовали методом конкурентного ИФА. Титр IgG к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 определяли в ИФА при использовании сывороток мышей, двукратно иммунизированных конъюгатом дисахарида, сорбированным на гидроксиде алюминия. Результаты. Конъюгат дисахарида, использованный в качестве покрывающего лунки антигена (4 мкг/лунка) в ИФА, характеризовался высокой степенью специфичности и взаимодействовал только с IgG к S. pneumoniae серотипа 3 в антимикробных сыворотках животных, не вступая в реакцию с антителами (АТ) к другим серотипам пневмококка (6B, 10A, 19A, 19F, 23F). В реакции конкурентного ИФА выявлено, что дисахарид, конъюгированный с БСА, ингибировал связывание АТ к дисахариду на 78,8%, бактериальный капсульный полисахарид на 56,9%, БСА не ингибировал активность сыворотки. При исследовании сывороток мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в ИФА, где в качестве сорбированного на планшете антигена использовали капсульный полисахарид, установлено присутствие IgG к капсульному полисахариду в титре 1:1600. Заключение. Дисахарид, являющийся единичным повторяющимся звеном S. pneumoniae серотипа 3, содержит ключевой эпитоп капсульного полисахарида. Синтетический дисахарид может быть использован как компонент мультивалентных конъюгированных пневмококковых вакцин и для разработки диагностических тест-систем.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции полисахаридными и конъюгированными вакцинами, покрывающими 80 - 90% серотипов штаммов, выделяемых от пациентов при заболеваниях пневмококковой этиологии, привела к снижению заболеваемости во всех возрастных группах населения [1, 5, 9]. В то же время, показано, что применение традиционных вакцин на основе капсульного полисахарида пневмококка не предотвращает появления антибиотикоустойчивых штаммов этого возбудителя [14, 16, 22], новых серотипов пневмококка [12, 17, 18], а состав применяемых зарубежных вакцин не учитывает региональные особенности распространения штаммов в России и возможное изменение эпидемиологической ситуации. Наряду с этим, к недостаткам вакцин на основе капсульных полисахаридов относится сложность технологии их получения и освобождения от бактериальных примесей, не всегда успешное проведение ковалентного присоединения нескольких полисахаридов к белку-носителю из-за их высокой молекулярной массы и недостаточной степени очистки [8, 19]. Эти факторы определяют высокую стоимость таких вакцин и ограничивают их массовое применение в практике. В связи с этим, приоритетным направлением современной вакцинологии является разработка синтетических и полусинтетических пневмококковых вакцин [7, 20]. Эпитопы капсульного полисахарида пневмококка могут быть представлены олигосахаридами, полученными путем химического синтеза. Иммунный ответ на олигосахариды высокоспецифичен. Некоторые олигосахариды, конъюгированные с белком, индуцируют образование более высокого уровня антител (АТ) к капсульному полисахариду, чем традиционные полисахаридные конъюгатные вакцины [11]. В ранее проведенных исследованиях нами показано, что синтетический гексасахарид, отражающий участок цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (БСА), является иммуногенным, вызывает образование протективных IgG и защищает мышей от заражения пневмококком этого серотипа [3]. Дальнейшие исследования предполагают проведение синтеза олигосахаридных фрагментов других серотипов пневмококка для последующего создания поливалентной полусинтетической конъюгированной вакцины. В настоящей работе исследованы иммунологические свойства синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3, значимость которого в последние годы возрастает [1]. По данным российских исследователей штаммы этого серотипа являются частой причиной осложненной и неосложненной пневмонии, отита, а также встречаются при назофарингеальном носительстве [6]. Цель работы - изучение эпитопной специфичности синтетического дисахарида, повторяющегося звена капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированного с БСА. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использованы мыши линии BALB/c массой 14 - 16 г, самцы, кролики породы шиншилла массой 2,5 - 3 кг из питомника НЦ биомедицинских технологий (филиал «Андреевка»); синтетический дисахарид, отражающий повторяющееся звено капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгировали с БСА скваратным методом [4]. Конъюгат дисахарида [pGlcA-(1-4)P-Glc-O-спейсер]l9-БСА содержал 19% углеводов. Разовая иммунизирующая доза конъюгата дисахарида составляла 8 мкг/мышь в расчете на олигосахарид. Гидроксид алюминия прибавляли к конъюгату из расчета 0,5 мл на 1 мг сухого препарата, сорбцию проводили в течение ночи при температуре +4°C. Препарат, содержащий капсульный полисахарид S. pneumoniae типа 3, получали из инактивированных ацетоном микробных клеток однократной водной экстракцией с последующим лиофильным высушиванием. Присутствие капсульного полисахарида в препарате подтверждено методом ингибирования ИФА при сорбции на планшетах конъюгата синтетического дисахарида. Антимикробные сыворотки к S. pneumoniae серотипа 3 получали при использовании двух видов животных - мышей и кроликов. Для получения мышиных антимикробных сывороток мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно дозой 500 мкг инактивированных ацетоном сухих микробных клеток штамма S. pneumoniae серотипа 3 в расчете на мышь 6-кратно с интервалом 7 суток. Сыворотку крови получали через 20 дней после последней иммунизации, аликвотировали и хранили при температуре минус 80°C. Иммунизацию кроликов проводили внутривенно многократно увеличивающимися дозами инактивированных микробных клеток в течение 30 дней. Общее количество инъекций: 12 - 15. Сыворотки лиофильно высушивали и хранили при +4°C. Для последующей оценки возможной перекрестной активности конъюгата дисахарида получали антимикробные сыворотки к S. pneumoniae серотипов 6В, 10А, 19А, 19F и 23F. Мышей иммунизировали 4 - 5-кратно внутрибрюшинно нарастающими сублетальными дозами живой культуры каждого серотипа пневмококка, начиная с дозы 500х106 микробных клеток, с интервалом между введениями 14 дней. Сыворотку крови получали на 14 сутки после последней иммунизации, аликвотировали и хранили при температуре минус 80°C. Антигенную активность синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 определяли методом конкурентного ИФА при сорбции на планшетах бактериального капсульного полисахарида этого серотипа пневмококка в концентрации 10 мкг/ лунка [2]. Процент ингибирования сыворотки рассчитывали по формуле: 100% - [(У/Х х 100)]%, где Х - оптическая плотность сыворотки (ОП450) до внесения антигена, У - ОП450 после прибавления антигена. Титр IgG к S. pneumoniae серотипа 3 в антимикробных сыворотках крови определяли методом ИФА [2] при использовании в качестве покрывающего лунки антигена конъюгата дисахарида. Для определения титра IgG в сыворотке крови мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида, на планшетах сорбировали препарат капсульного полисахарида. В качестве контроля использовали сыворотки неиммунизированных животных. Статистическую обработку данных проводили при использовании программного обеспечения Statistica 8. Достоверность различий между сравниваемыми группами определяли методом Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Рис. 1. Выбор оптимальной сорбирующей дозы дисахарида S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированного с БСА, на полистироловых аланшетах. Титр IgG - последнее разведение антимикробной сыворотки кролика, превышающее ОП450 в контроле не менее, чем в 2 раза. Здесь и на рис. 2, 3: данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, * р<0,05 по тесту Манна-Уитни. Для проведения исследований разработана экспериментальная твердофазная ИФА тест-система, предназначенная для определения АТ к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма. Оптимальную сорбирующую дозу конъюгата дисахарида, позволяющую выявить наибольшее количество АТ, исследовали в диапазоне концентраций от 1,6 до 0,0125 мкг/лунка. Результат оценивали по титру IgG к дисахариду - повторяющемуся звену капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в антимикробной сыворотке кроликов, иммунизированных инактивированными бактериями этого же серотипа (рис. 1). Оптимальная сорбирующая доза конъюгата дисахарида, позволяющая выявить наибольший уровень IgG (1:3200) в антимикробной сыворотке кроликов, составляла 0,2 - 0,4 мкг в расчете на лунку по сравнению с другими испытанными концентрациями (p<0,05). В дальнейшей работе использовали концентрацию конъюгата дисахарида 0,4 мкг/лунка. Рис. 2. Оценка специфичности ИФА тест-системы в реакции с антимикробными сыворотками животных к различным серотипам S. pneumoniae. Сорбирован конъюгат дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в концентрации 0,4 мкг/лунка. а - антимикробная кроличья сыворотка к S. pneumoniae серотипа 3; К - контроль. Для оценки специфичности экспериментальной тест-системы определяли титр IgG в кроличьих и мышиных антимикробных сыворотках к серотипу 3, а также серотипам 6B, 10A, 19A, 19F, 23F, выбранных в качестве отрицательного контроля (рис. 2). Результат сравнивали с титром АТ у неиммунизированных животных (контроль). Оценка специфической активности ИФА тест-системы показала, что конью-гат синтетического дисахарида взаимодействовал только с IgG к S. pneumoniae серотипа 3 (p<0,05). В остальных антимикробных сыворотках (6В, 10А, 14, Рис. 3. Конкурентный ИФА с антигенами S. pneumoniae серотипа 3. Сорбирован конъюгат синтетического дисахарида с БСА в концентрации 0,4 мкг/лунка. Разведение антимикробной кроличьей сыворотки 1:400. К - контроль сыворотки; КП - бактериальный капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3. Ингибирование активности сыворотки проводили в концентрации 10 мкг/лунка каждым из препаратов. 19F и 23F) титр АТ соответствовал уровню, определяемому у неиммунизированных животных (контроль), что подтвердило специфичность разработанной ИФА тест-системы. Антигенную активность синтетического дисахарида, конъюгированного с БСА, и его составляющих - дисахаридно-го лиганда и БСА, а также бактериального капсульного полисахарида определяли методом конкурентного ИФА при использовании разработанной тест-системы. Результат оценивали по проценту ингибирования IgG в антимикробной сыворотке кролика (рис. 3). Конъюгат дисахарида, дисахарид per se и капсульный полисахарид снижали ОП450 антимикробной контрольной сыворотки с 1,04 до 0,22 (p<0,05); 0,87 и 0,448 ед. (p<0,05) соответственно, то есть процент ингибирования АТ к повторяющемуся звену капсульного полисахарида для каждого из этих препаратов составил 78,8; 16,3 и 56,9%. БСА не вступал в реакцию с сывороточными антителами, следовательно, его вклад в ингибирование сыворотки в составе конъюгата дисахарида можно исключить. Для выявления способности конъюгата дисахарида вызывать образование IgG к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 3 мышей иммунизировали конъюгатом, сорбированным на гидроксиде алюминия, двукратно разовой дозой 8 мкг по дисахариду в расчете на мышь. Титр IgG определяли на 14 сутки после второй иммунизации. Установлено, что титр IgG к капсульному полисахариду в сыворотке крови иммунизированных мышей составил 1:1600 по сравнению с неиммунизированными животными (1:200), то есть в 8 раз превышал контрольные значения (p<0,05). ОБСУЖДЕНИЕ Разработка пневмококковых вакцин на основе синтетических олигосахаридов, отражающих фрагменты цепи капсульного полисахарида S. pneumoniae, является приоритетным направлением современной вакцинологии. В различных лабораториях мира получен ряд синтетических олигосахаридов серотипов 1-4, 6А/В, 7F, 8, 9A/V, 14, 17F, 18C, 19A/F, 22F, 23F, 27, 29 [13]. Конъюгаты белков-носителей с некоторыми синтетическими олигосахаридами, отвечающими фрагментам капсульных полисахаридов различных серотипов, были исследованы в качестве потенциальных вакцин [10]. В настоящей работе исследована эпитопная специфичность синтетического дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 и его способность в составе конъюгата с БСА индуцировать образование IgG к капсульному полисахариду этого серотипа пневмококка. При разработке ИФА тест-системы установлено, что оптимальная концентрация конъюгата дисахарида, сорбированного на планшете, составила 0,2 - 0,4 мкг в расчете на лунку. Использование такой сорбирующей дозы позволило выявить наиболее высокий уровень АТ в поликлональной антимикробной кроличьей сыворотке. Показано, что конъюгат дисахарида, сорбированный на планшете, характеризовался высокой степенью специфичности и взаимодействовал только с IgG к S. pneumoniae серотипа 3 в сыворотках животных, не вступая в реакцию с антителами к другим серотипам пневмококка (6B, 10A, 19A, 19F, 23F). Разработанная высокочувствительная и специфичная ИФА тест-система для определения уровня антител к S. pneumoniae серотипа 3 дополняет ранее предложенную тест-систему на основе синтетического гексасахарида серотипа 14 [2]. В реакции конкурентного ИФА выявлено, что дисахарид, конъюгированный с БСА, на 78,8% ингибировал связывание АТ, присутствующих в поликлональной антимикробной сыворотке крови кроликов, иммунизированных инактиврированными бактериальными клетками S. pneumoniae серотипа 3. Доказано, что АТ к БСА, которые могут присутствовать в сыворотке иммунизированных животных, не влияли на результат реакции. Ингибирующая активность бактериального капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3 составила 56,9%. Сходные результаты получены нами ранее при исследовании свойств конъюгата гексасахарида S. pneumoniae серотипа 14 [2] и согласуются с данными других авторов, исследовавших ингибирующую активность синтетических олигосахаридов S. pneumoniae серотипа 14 [15]. Меньшая антигенная активность капсульного полисахарида могла быть связана с недостаточной степенью его очистки от бактериальных примесей, а также отсутствием взаимодействия с олигосахарид-специфическими АТ, присутствующими в антимикробной сыворотке [15], которые могут вносить свой вклад в ингибирование реакции. Safari D. et al. [21] при исследовании иммуногенной активности конъюгатов синтетических олигосахаридов S. pneumoniae серотипа 14 показали, что в большинстве иммунных сывороток присутствуют олигосахарид-специфические антитела, не все из которых распознают капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14. То есть, выявленное нами присутствие в антимикробных сыворотках антител к дисахариду не позволяло сделать заключение о том, будут ли они распознавать капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 3. Способность антител к дисахариду вступать во взаимодействие с капсульным полисахаридом была доказана при исследовании сывороток мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида S. pneumoniae серотипа 3 в ИФА, где в качестве покрывающего лунки антигена использовали бактериальный капсульный полисахарид. Установлено, что в сыворотке крови мышей, иммунизированных конъюгатом дисахарида, в высоком титре (1:1600) присутствуют IgG к капсульному полисахариду. Аналогичные данные получены при исследовании иммуногенной активности синтетического гексасахарида, отражающего участок цепи S. pneumoniae серотипа 14 [3]. На основе полученных данных сделан вывод о том, что синтетический дисахарид, отражающий единичное повторяющееся звено капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 3, содержит ключевой эпитоп. Использование иммуногенных синтетических олигосахаридов актуальных серотипов пневмококка открывает путь для создания полусинтетической конъюгированной поливалентной пневмококковой вакцины, наиболее важным преимуществом которой является возможность быстрой замены ее серотипового состава в соответствии с эпидемиологической ситуацией и региональными особенностями.
×

Об авторах

Е. А Курбатова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Москва

Н. К Ахматова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Москва

Н. Б Егорова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Москва

И. Б Семенова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Москва

Н. Е Ястребова

НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова

Москва

Ю. Е Цветков

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского

Москва

Е. В Сухова

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского

Москва

Д. В Яшунский

НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича

Москва

Н. Э Нифантьев

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского

Москва

Список литературы

  1. Белошицкий Г.В., Королева И.В. Серотиповая характеристика штаммов S.pneumoniae в Москве. Эпидемиол. вакцинопроф. 2014, 74 (1): 90-96.
  2. Курбатова Е.А. Воробьев Д. С., Семенова И. Б., Сухова Е. В., Яшунский Д. В., Цветков Ю.Е., Нифантьев Н.Э. Разработка подходов к созданию экспериментальной тестсистемы для оценки антигенной активности синтетических олигосахаридных лигандов, родственных фрагментам цепи капсульного полисахарида Streptoccoccus pneumoniae типа 14. Биохимия. 2013, 7: 1046-1052.
  3. Курбатова Е.А., Воробьев Д.С., Ахматов Э.А., Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Цветков Ю.Е., Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Нифантьев. Н.Э. Протективная активность гликоконъюгата на основе синтетического гексасахарида - родственного фрагменту цепи капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae серотипа 14. БЭБИМ. 2014, 157 (5): 630-633.
  4. Сухова Е. В., Яшунский Д. В., Цветков Ю. Е., Курбатова Е. А., Нифантьева Н.Э.Синтез олигосахаридных фрагментов капсульного полисахарида Streptococcus pneumoniae тип 14 и их неогликоконъюгатов с бычьим сывороточным альбумином. Известия Акад. наук. Сер. хим. 2014, 2: 511-521.
  5. Таточенко В.К. Перспективы развития иммунопрофилактики в России. Журн. микробиол. 2010, 5: 90-98.
  6. Харит С.М. Пневмококковые вакцины. В кн.: Вакцины и вакцинация: национальное руководство. Под ред. В.В. Зверева, Б.Ф.Семенова, Р.М.Хаитова. М., ГЭОТАР-Медиа, 2011.
  7. Deng S., Bai L., Reboulet R. et al. A peptide-free, liposome-based oligosaccharidevaccine, adjuvanted with a natural killer T cell antigen, generates robust antibody responses in vivo. Chem. Sci. 2014, 4: 1437-1441.
  8. Galan M.C., Dumy P, Renaudet O. Multivalent glyco(cyclo)peptides. Chem. Soc. Rev. 2013, 42: 4599-4612.
  9. Hutchison B.G., Oxman A.D., Shannon H.S. et al. Clinical effectiveness of pneumococcal vaccine. Meta-analysis. Can. Fam. Physician. 1999, 45: 2381-2393.
  10. Jansen W.T., Snippe H. Short-chain oligosaccharide protein conjugates as experimental pneumococcal vaccines. Indian J. Med. Res. 2004, 119 (Suppl): 7-12.
  11. Jansen W.T., Hogenboom S, Thijssen M.J. et al. Synthetic 6B di-, tri-, and tetrasaccharide-protein conjugates contain pneumococcal type 6A and 6B common and 6B-specific epitopes that elicit protective antibodies in mice. Infect. Immun. 2001, 69: 787-793.
  12. Jin P, Kong F., Xiao M. et al. First report of putative Streptococcus pneumoniae serotype 6D among nasopharyngeal isolates from Fijian children. J. Infect. Dis. 2009, 200 (9): 13751380.
  13. Kamerling J.P. Pneumococcal polysaccharides: A chemical view. In: Tomasz A. (ed.). Streptococcus pneumoniae, molecular biology and mechanisms of disease. New York, Mary Ann Liebert, 1999: 81-114.
  14. Kellner J.D. Drug-resistant Streptococcus pneumoniae infections: clinical importance, drug treatment, and prevention. Semin. Respir. Infect. 2001, 16: 186-195.
  15. Mawas F., Niggemann J., Jones C. et al. Immunogenicity in a mouse model of a conjugate vaccine made with a synthetic single repeating unit of type 14 pneumococcal polysaccharide coupled to CRM197. Infect. Immun. 2002, 70: 5107-5114.
  16. Ongkasuwan J., Valdez T.A., Hulten K.G. et al. Pneumococcal mastoiditis in children and the emergence of multidrug-resistant serotype 19A isolates. Pediatrics. 2008, 122 (1): 34-39.
  17. Park I.H., Park S., Hollingshead S.K., Nahm M.H. Genetic basis for the new pneumococcal serotype, 6C. Infect. Immun. 2007, 75 (9): 4482-4489.
  18. Park I.H., Pritchard D.G., Cartee R., et al. Discovery of a new capsular serotype (6C) within serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 2007, 45 (4): 1225-1233.
  19. Peri F. Clustered carbohydrates in synthetic vaccines. Chem. Soc. Rev. 2013, 42 :4543-4556.
  20. Safari D., Marradi M., Chiodo F. et al. Gold nanoparticles as carriers for a synthetic Streptococcus pneumoniae type 14 conjugate vaccine. Vaccine. 2011, 29 (4): 849-854.
  21. Safari D., Dekker H.A.T., Joosten A.F. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against S. pneumoniae type 14. Infect. Immun. 2008,76 (10): 4615-4623.
  22. Schreiber J.R., Jacobs M.R. Antibiotic-resistant pneumococci. Pediatr. Clin. North Am. 1995, 42: 519-37.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Курбатова Е.А., Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Семенова И.Б., Ястребова Н.Е., Цветков Ю.Е., Сухова Е.В., Яшунский Д.В., Нифантьев Н.Э., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах