ROLE OF LABORATORY METHODS IN EPIDEMIC CONTROL OF BRUCELLOSIS OUTBREAKS IN MOSCOW ZOO NURSERY

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Бруцеллез - особо-опасная зоонозная инфекция, которая приводит к экономическим потерям в сельском хозяйстве и создает серьезные проблемы практического здравоохранения в России, связанные с состоянием и оценкой здоровья людей после контактов с больными животными. Современный бруцеллез характеризуется хроническим течением в более 70% случаев и инвалидизацией до 30% у больных трудоспособного возраста [11, 12]. Заболеваемость бруцеллезом у людей связана с эпизоотиями среди основных сельскохозяйственных животных - крупного и мелкого рогатого скота, который в этом случае становится источником инфекции для людей [14]. Социально-экономические преобразования в сельском хозяйстве страны в 90-х годах прошлого века привели к созданию многочисленных мелких частных хозяйств. В условиях недостаточного финансирования ветеринарной службы и сокращения лабораторных исследований скот в частном секторе оказывался вне ветеринарного контроля. Трансграничные перемещения животных частных владельцев часто проходили вне таможенного и ветеринарного контроля, а владельцы больных животных были не в состоянии проводить дорогостоящие противобруцеллезные мероприятия, что негативно воздействует на эпизоотическую ситуацию в России [6, 10, 12]. Эпиднадзор за бруцеллезом - это комплексное наблюдение за инфекцией c анализом многолетней динамики заболеваемости людей в целом по России, в округах и на конкретных территориях повышенного риска заражения, содержащих очаги бруцеллезной инфекции среди сельскохозяйственных животных[2, 10]. При разработке и введении эффективной системы эпиднадзора бруцеллеза следует учитывать ряд проблемных особенностей этой инфекции: частое хроническое течение инфекции у людей и животных, различную продолжительность инкубационного периода, неспецифическую клиническую симптоматику, возможность латентного течения инфекции [6, 12, 14]. Лабораторные методы устанавливают точный диагноз и выступают в качестве ключевого звена в системе эпиднадзора за бруцеллезом [9, 14]. Эффективность эпиднадзора напрямую зависит от главных требований лабораторного анализа: высокой чувствительности, специфичности и быстроты выполнения [8, 9]. До настоящего времени в очагах бруцеллеза одновременно широко не используются комплексные лабораторные методы диагностики, что не позволяет объективно сравнить их эффективность и определить их роль в эпиднадзоре. В представленной работе в течение 2003 - 2011 гг. использовали различные лабораторные методы диагностики для анализа инфицированности и заболеваемости людей в подсобном хозяйстве зоопитомника Московского зоопарка, расположенного в 100 км от Москвы. В результате трансграничного перемещения из Таджикистана в конце 2002 года больных бруцеллезом овец в апреле 2003 г. возникла вспышка бруцеллеза среди сотрудников зоопитомника, контактировавших с больными животными. Цель работы - оценить роль методов лабораторной диагностики бруцеллеза в непрерывном по времени эпиднадзоре за вспышками бруцеллеза людей на территории подсобного хозяйства в зоопитомнике Московского зоопарка. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В течение 2003 - 2013 гг. 2 раза в год исследовали сыворотки крови у более чем 200 сотрудников зоопитомника (2003 г. - 89, 2004 г. - 100, 2005 г. - 69, 2006 г. - 58, 2007 г. - 62, 2008 г. - 60, 2009 г. - 70, 2010 г. - 70, 2011 г. - 60, 2012 г. - 74, 2013 г. - 73), находящихся и работающих в очаге бруцеллеза, с применением комплекса лабораторных методов на бруцеллез. Серологические реакции агглютинации в пробирках по Райту (РА), на стекле по методу Хеддльсона (РХ), анти-глобулиновой пробы Кумбса (РК) проводили по [9]. Постановку ИФА осуществляли в твердофазном варианте по методике [5]. Для сенсибилизации планшетов использовали иммунодоминантный S-ЛПС Brucella abortus 99 в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,4 (ФСБ). Иммобилизацию проводили при 4°C в течение 16 ч, затем удаляли трехкратной промывкой ФСБ с 0,005% твин-20 несвязавшийся антиген. В лунки добавляли по 100 мкл испытуемых сывороток с разведения 1:100 и титровали в ФСБ до 1:12 800. Реакцию взаимодействия антиген-антитело проводили 1 ч при 37°C с последующей промывкой. Добавляли в лунку 100 мкл пероксидазного античеловеческого конъюгата производства ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в рабочем разведении 1:400 и инкубировали при 37°С в течение 40 мин. После пятикратной промывки вносили субстрат-индикаторный раствор, содержащий 0,04% 0-дифенилендиамина в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере pH 6,0 c 0,04% раствором перекиси водорода в том же объеме. Через 10 мин. реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 N раствора серной кислоты. Реакцию учитывали на планшетном фотометре Multiskan FC фирмы «Thermo Fisher Scientific» (Финляндия) при длине волны 492 нм. Положительным считали результат, более чем в 2 раза превышающий оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем, диагностическим титром являлось разведение 1:200. Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента. ПЦР-РВ для детектирования ДНК бруцелл в клинических образцах сывороток основывалась на мишени ДНК гена BCSP31, кодирующего один из поверхностных белков бруцелл размером 31 кД с использованием методики выделения ДНК на сорбенте Silica (SiO2) [8]. Bносили 100 мкл сыворотки в пробирку c 500 мкл лизирующего буфера (6 M GuSCN гуанидин тиоционат, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 6,5, 2% Triton X-100). После растворения добавляли 20 мкл 4% сорбента (Silica, «Хеликон», Россия). Содержимое пробирок перемешивали на вортексе в течение 30 сек. и осаждали сорбент центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 секунд. Осадок отмывали последовательно: в 500 мкл отмывочного буфера 1 (6 M GuSCN гуанидин тиоционат, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 6,5), дважды в 500 мкл отмывочного буфера 2 (25% изопропанола, 25% этанола, 100 mM NaCl и 10 mM Tris-HCl pH 8,0) и в заключение в 500 мкл отмывочного раствора 3 (70% этанола 10 mM NaCl). В пробирки с высушенным при комнатной температуре сорбентом добавляли 40 мкл элюирующего ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). Элюцию ДНК с сорбента проводили в водяной бане 10 мин при 65°С, после центрифугирования при 10 000 об/мин в течение 5 мин супернатант содержал очищенную матричную ДНК. Амплификацию в 2003 - 2011 гг. проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-НО рН 8,6, 2,5 мМ MgCl2, 16,6 мМ ^Н4)2 SO4 , 0,2 мМ каждого из дНТФ, по 6 рmol каждого праймера и 1,5 ед. Tag-полимеразы («Силекс» Россия) и 10 мкл выделенной ДНК. Родоспецифические праймеры на последовательности гена BCSP31 из 19 нуклеотидов, фланкирующих фрагмент в 260 нуклеотидных пар (н. п.): прямой праймер Br1 5'-aGt CAG ACG TTG CCT ATT G-3' и обратный праймер Br2 5'- GTG TTC AGC CTT GAT ATC G-3 в концентрации 6 pm. В 2012 - 2013 гг. использовали реагенты (кат. номер R-402) фирмы «Синтол» (Россия) с интер-калирующим красителем SYBR Green. Положительным контролем служили 10 нг ДНК референтных штаммов бруцелл. ПЦР-РВ проводили на приборе Rotor Q фирмы «Qiagen» (США). Амплификацию проводили при следующих температурных режимах: 94°С - 1 мин 30 сек, 94°С - 20 сек, 54°С - 20 сек, 72°С - 20 сек - 5 циклов и 94°С - 1 сек, 54°С - 1 сек, 72°С - 1 сек - 45 циклов. Специфичность амплификационных продуктов подтверждали пиками плавления в диапазоне 70 - 99°С. РЕЗУЛЬТАТЫ Сравнение динамики изменения инфицированности среди обследуемых сотрудников зоопитомника в 2003 - 2013 гг. показало, что максимальное знчение этого показателя (42,7%) наблюдалось в начальный период эпизоотии бруцеллеза овец в 2003 г. В послеэпизоотический период 2005 - 2006 гг. инфицированность уменьшалась до 15,9 - 17,2%. Но в 2007 и 2009 гг. вновь поднялась до 27,4 и 35,7% с охватом новых сотрудников, которые ранее (2003 - 2006 гг.) не реагировали на бруцеллез. В это время (2007 и 2009 г.) в зоопитомнике зарегистрировали эпизоотию бруцеллеза среди крупного рогатого скота и 2-летнего яка. В последующие 2010 - 2013 гг. инфицированность снижалась до 10,5 - 11,4 и 9,6 - 6,6% соответственно без выявления новых случаев клинических форм бруцеллеза. За весь период обследования в течение 11 лет среди контактирующих с больными животными сотрудников зоопитомника выявлено 42,2% (30 человек в абсолютных цифрах), инфицированных возбудителем бруцеллеза, среди них у 14% (10 человек) болезнь перешла в клинические формы (6 - острый, 4 - хронический). Таким образом, эпизоотии бруцеллеза мелкого и крупного рогатого скота в зоопитомнике коррелировали по времени с подъемами инфицированности людей и определяли вспышки бруцеллеза среди обслуживающего персонала зоопитомника. Сравнение эффективности использования методов ПЦР-РВ и ИФА на протяжении 11 лет мониторинга бруцеллеза показало, что в период возникновения эпизоотии в 2003 г. ПЦР-РВ (32,6%) выявляла инфицированность людей в 5,8 раза эффективней по сравнению с ИФА (5,6%). На следующий 2004 г. ликвидации эпизоотии положительные диагностические титры (1:200 и выше) в ИФА регистрировали у 14,0% всех обследованных (приближались к показателям ПЦР-РВ - 18,0%). В межэпизоотический период 2005 - 2006 гг. ИФА по эффективности (8,7 - 10,3%) в 6,2 - 3,0 раза превышал ПЦР-РВ (1,4 - 3,4%). В периоды эпизоотии 2007 и 2009 гг. эффективность ИФА повышалась до значений 22,6 и 21,4%, что в 1,55 - 3,01 раза превышало показатели ПЦР-РВ (14,5 - 7,1%). В послеэпизоотический период 2010 - 2013 гг. положительный ИФА уменьшался до 10,5 - 12,0 и 7,4 - 5,1% соответственно, но в более чем 4 раза превосходил ПЦР-РВ (2,4 - 0%). Изучение динамики значений положительных титров ИФА контактных сотрудников в течение 11 лет показало, что титры антител у контактных сотрудников повышались к 2007 г. в период начала эпизоотии и относительно стабилизировались к 2009 г. Но в 2010 - 2011 гг. происходило максимальное повышение титров (до 3,3 log 2), которое могло быть связанно с присутствием в зоопитомнике больных бруцеллезом животных, не идентифицированных ветеринарной службой. В 2012 - 2013 гг. происходило снижение титров антител у инфицированных сотрудников, что соответствовало заявлениям ветеринарной службы об отсутствии бруцеллеза среди животных зоопитомника. Сравнение эффективности трех разновидностей традиционного серологического метода агглютинации показало, что РХ оказалась наиболее эффективной как в периоды эпизоотий (от 13,5 до 18,6%), так и в межэпизоотический период (14,5 - 15,5%) и снижалась после эпизоотии (4,9 - 2,9%). РК подтверждала эффективность в диагностике хронических форм бруцеллеза в межэпизоотии (10,1%) и в разгар эпизоотии (12,9%). РА была положительной преимущественно при острой форме развившегося бруцеллеза, обострении хронической инфекции и регистрировалась в небольшом проценте случаев в период эпизоотий (3,4 - 3,2%) и в периоды межэпизоотий (7,2 - 6,6%). В целом традиционные серологические тесты показали меньшую чувствительность, информативность и большую продолжительность до 2 дней анализа, по сравнению с ПЦР-РВ и ИФА. ОБСУЖДЕНИЕ Для эффективного осуществления эпидемиологического надзора за бруцеллезной инфекцией необходимо активно использовать лабораторные методы диагностики в очагах бруцеллеза людей и животных. В настоящее время только активное экспедиционное выявление больных бруцеллезом (не по обращаемости больного) сможет приблизить к реальному показателю заболеваемости людей в России. При этом необходимо на каждой административной территории, в каждом эпидемическом очаге бруцеллеза на основе лабораторных методов диагностики своевременно осуществлять адекватные лечебные и профилактические мероприятия с изучением и установлением всех факторов, определяющих эпизоотический и эпидемический процессы. Экспедиционный подход был реализован в 30-х годах ХХ века для изучения бруцеллеза на практике П.Ф.Здродовским и П.А.Вершиловой [1, 2]. По инициативе П.Ф.Здродовского в 1936 г. Наркомздрав СССР организовал республиканские и краевые бруцеллезные станции, через которые бруцеллезная лаборатория ВИЭМ координировала практическую реализацию такого подхода. Война помешала реализовать в полной мере их возможности. Экспедиции продолжились в 50 - 60-е годы, доказывая свою состоятельность и эффективность в периоды опасных эпизоотий козье-овечьего бруцеллеза [2, 3]. Многолетние эпизоотологические и эпидемиологические исследования очагов бруцеллезной инфекции и динамики их течения в Молдавской республике в 70-х годах доказали эффективность комплексного подхода c использованием серологических методов диагностики при проведении противобруцеллезных мероприятий [13]. Но использование одной серологии не позволяет дать полную характеристику очага инфекции и сделать заключение о ликвидации бруцеллезной инфекции в эпидемическом очаге [14]. Очаги бруцеллеза в России после ликвидации источника инфекции в подавляющем большинстве случаев не подвергаются активному и последовательному по времени эпидемиологическому надзору. Как правило, заключения об эпидемическом благополучии по бруцеллезу животных и людей на территории очагов делается на основе пассивного мониторинга статистической службой Роспотребнадзора об отсутствии новых случаев первично-регистрируемого бруцеллеза людей при обследовании по обращению. В этой связи, в противовес существующей тенденции анализа очагов бруцеллеза нами проведено активное, непрерывное в течение 11 лет, обследование сотрудников с высоким риском заражения в очаге бруцеллеза, имеющем специфические особенности, благоприятствующие возникновению вспышек среди людей. Очаг бруцеллеза возник в подсобном хозяйстве зоопитомника Московского зоопарка в результате трансграничного перемещения из Таджикистана в конце 2002 г. больных овец, не прошедших предварительного ветеринарного освидетельствования, и последующих грубых нарушениях ветеринарно-санитарных правил их размещения. Зоопитомник находится в 100 км от Москвы, основной задачей его является разведение редких, трудноразводимых в неволе видов зверей и птиц. Для этой цели зоопитомнику предоставлена территория протяженностью около 200 га, многочисленный и часто меняющийся обслуживающий персонал, специалисты-зоологи, ветеринары и др. В отличие от обычных животноводческих ферм в подсобном хозяйстве содержат, разводят и привозят туда мелкий и крупный рогатый скот, служащий кормом для хищников зоопитомника Московского зоопарка. Подсобное хозяйство зоопитомника занимает территорию около 50 га с пастбищами и сенокосами, где содержится крупный, мелкий рогатый скот и птицы. После применения радикальных методов борьбы с овечьим бруцеллезом (убой всех имеющихся в подсобном хозяйстве овец в 2003 г.) регистрация новых случаев инфицирования контактных сотрудников зоопитомника резко снизилась на 2 году (в 3 раза) и прекратилась на 3 и 4 году от начала регистрации эпизоотического очага. Однако в 2007 и 2009 гг. вновь были выявлены свежие случаи инфицирования людей, ранее не имеющих положительных реакций на бруцеллез. По предположению ветеринарной службы невыявленным источником инфекции для нового инфицирования людей явилась матка яка, произведшая больное потомство, обнаруженное только в 2009 г. Ветеринарная служба зоопитомника не проводила бактериологические посевы крови и внутренних органов больных животных в периоды эпизоотий, культуры бру-целл не были выделены и вид бруцелл не был идентифицирован для каждой эпизоотии, все заключения основывались на положительных серологических реакциях. При наблюдении контактных сотрудников в очаге бруцеллеза число инфицированных составило 42,2%, у 27,5% из них положительный IgG иммунный ответ в ИФА сохранялся в течение всего периода наблюдения при отсутствии клинических проявлений болезни. Но клинические формы бруцеллеза среди всех наблюдавшихся контактных сотрудников были диагностированы у 14,7% - 10 человек (6 - острый, 4 - первично-хронический бруцеллез). Результаты проделанной работы позволили сравнить эффективность и определить роль каждого метода в эпиднадзоре за бруцеллезной инфекцией. В соответствии с патогенезом бруцеллеза в острой фазе заболевания наибольшее количество возбудителя присутствует в фагоцитах крови, разносящих бруцеллы в паренхиматозные органы для последующего хронического внутриклеточного персистирования в различного типа клетках хозяина [4, 7]. Полученные нами данные подтверждают значение метода ПЦР, который выявляет ДНК возбудителя, соответствующее десяткам клеток, что позволяет косвенно заключить о присутствии бруцелл в фагоцитах крови при положительных результатах этого анализа [4, 7]. ПЦР явилась наиболее эффективным методом выявления инфицирования людей в очаге бруцеллеза, когда положительные результаты коррелировали по времени с выявлением эпизоотий больных бруцеллезом животных в зоопитомнике. Но положительный результат в ПЦР не всегда свидетельствовал о наличии активного инфекционного процесса, ДНК бруцелл выявляли у сотрудников без клинических признаков заболевания. Этот метод может служить критерием полноты ликвидации очагов бруцеллеза. ИФА является методом, выявляющим на основной иммунодоминантный O-антиген большое количество разных IgG, продукция которых начинается спустя 2 - 3 недели после инфицирования, при этом антительный ответ может сохраняться на протяжении десятков лет [4, 8]. В этом заключается более высокая чувствительность ИФА по сравнению с ПЦР при диагностике хронических форм бруцеллеза в периодах между эпизоотиями и после них. Низкая чувствительность серологического метода не позволяет реально оценить инфицированность персонала и возможные контакты с инфекцией. РА регистрировалась в основном при острых формах бруцеллеза. Таким образом, зоопитомник можно было считать оздоровленным от бруцеллезной инфекции, начиная с 2012 - 2013 гг. при отсутствии свежих случаев инфицирования (регистрация ПЦР-РВ, ИФА и традиционная серология) и при снижении титров ИФА у всех сотрудников с хроническим бруцеллезом. Использование комплекса лабораторных методов на бруцеллез контактных сотрудников также позволяет косвенно сделать заключение об эпидемическом благополучии по бруцеллезу животных в зоопитомнике.

About the authors

Yu. K Kulakov

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

M. D Novikova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

T. A Tolmacheva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

M. M \Zheludkov\

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files