EXPERIENCE OF USING IMMUNE CHROMATOGRAPHY TEST FOR DIAGNOSTICS OF PNEUMOCOCCAL PNEUMONIA

Full Text

По данным зарубежной литературы частота пневмоний у взрослых варьирует в широком диапазоне, составляя у лиц молодого возраста 1 - 11,6%, а в старших возрастных группах - 25 - 44% [17]. В России, согласно официальной статистике, среди населения старше 18 лет регистрируется до 440 000 случаев внебольничных пневмоний в год [9]. К числу наиболее распространенных поражений органов дыхания относится пневмококковая внебольничная пневмония, при которой у пациентов с тяжелой сопутствующей патологией (хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет, заболевания почек и печени, сердечно-сосудистой системы, ВИЧ-инфекция) летальность достигает 15 - 30% [2, 4]. Одной из причин высокой летальности является недостаточно эффективная лабораторная диагностика внебольничных пневмоний. По данным отечественной литературы известно, что у 50 - 70% больных с внебольничными пневмониями отсутствует этиологический диагноз [5 - 7, 9]. В настоящее время этиологическая расшифровка внебольничных пневмоний, вызванных Streptococcus рneumoniaе, в стационарах и поликлиниках осуществляется при исследовании мокроты бактериологическим методом, позволяющим выделить живую культуру возбудителя, определить чувствительность к антимикробным препаратам и провести внутривидовое ти-пирование штаммов. Однако этот метод имеет ряд недостатков: значительная продолжительность микробиологических исследований (результат определяется спустя 48 - 72 часа с момента получения материала), трудность идентификации патогенного микроорганизма при отсутствии продуктивного кашля [11]. Результативность бактериологического метода ограничивается также и широким распространением среди населения практики применения антибактериальных препаратов до обращения за медицинской помощью. При микробиологической идентификации чистой культуры лидирующего инфекционного агента пневмоний - S. pneumoniae известным препятствием является его высокая требовательность к питательным средам [7]. Кроме того, инкубация возбудителя осуществляется в атмосфере c повышенным содержанием СО2, что требует применения СО2-термостата. Указанные особенности приводят к дополнительным финансовым затратам. Следует отметить, что в настоящее время для верификации пневмококковых пневмоний нередко используется полимеразная цепная реакция. При этом ряд характеристик ПЦР: высокая чувствительность, возможность проведения анализа после начала антибактериальной химиотерапии, быстрота выполнения определяют преимущества этого метода в сравнении с другими. Однако, мнение о целесообразности использования ПЦР для диагностики пневмококковой инфекции весьма противоречивы. Ряд отечественных исследователей отмечают более высокую частоту обнаружения S. pneumoniae в патологическом материале, полученном от больных внебольничными пневмониями при применении ПЦР, в отличие от микробиологического исследования. Так, в мокроте при применении метода ПЦР S. pneumoniae обнаруживают в 79% , а при использовании микробиологического исследования лишь в 25%, в крови частота обнаружения S. pneumoniae данными методами составляет 25% и 0% соответственно [1]. За рубежом ПЦР-диагностика на пневмо- и аутолизины S. pneumoniae применяется ограниченно, так как в ходе изучения выявлено, что чувствительность ее не превышает 82% (по аутолизину) и 89% (по пневмолизину), а специфичность является минимальной - 38% и 27% соответственно [12, 13]. Методы по определению пневмококковых антигенов с помощью реакций встречного иммуноэлектрофореза, иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов не нашли широкого применения в силу высокой стоимости, трудоемкости и относительно недостаточных параметров чувствительности и специфичности [16, 18]. В последние годы все большую популярность приобретают иммунохроматографические экспресс-тесты идентификации возбудителей. Подобные методы быстрой лабораторной диагностики инфекций используются для обнаружения Helicobacter pylori в кале и Legionella pneumophila в моче, а также широко применяются для верификации таких распространенных инфекций как туберкулез, сифилис, гонорея, хламидиоз [21, 22]. Экспресс-тест используется в наркологии, выявляя всю гамму применяемых наркотических веществ с высокой достоверностью определения, в гинекологии и акушерстве, в кардиологии [23]. Между тем данные по использованию иммунохроматографического экспресс-теста для верификации пневмококковых пневмоний в отечественной литературе весьма малочисленны. Цель настоящего исследования явилось обоснование использования иммунохроматографического анализа для диагностики пневмококковой пневмонии. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа осуществлялось в два этапа. На первом этапе исследования мы провели оценку чувствительности и специфичности иммунохроматографического метода (тест Binax NOW) при верификации пневмококковой пневмонии. В качестве «золотого» стандарта был использован бактериологический метод. Были сформированы две группы пациентов (1 - 33 пациента с бактериологически подтвержденной пневмококковой пневмонией, 2 - 42 больных с пневмониями другой этиологии: Staphylococcus aureus (40,5+7,5%), Mycobacterium tuberculosis (23,8+6,5%), Klebsiella pneumoniae (16,7±5,7%), Moraxella catarrhalis (7,1 ±3,9%), Haemophilus influenzae (7,1 ±3,9%), Streptococcus pyogenes (4,8±3,2%). При бактериологическом исследовании мокроты у пациентов второй группы ни в одном случае S. pneumoniae выделен не был. Определение специфичности и чувствительности метода проводили с использованием четырехпольной таблицы по методу, изложенному в [10]. На втором этапе исследования мы апробировали данный тест на базе Краевой клинической инфекционной больницы для этиологической расшифровки пневмоний у больных, госпитализированных в инфекционный стационар в 2010 - 2012 гг. с диагнозом внебольничная пневмония, подтвержденным рентгенографией органов грудной клетки. Были обследованы 260 пациентов в возрасте 18 - 65 лет. Одновременно с обследованием биологического материала от пациентов в иммунохроматографическом анализе проводилось бактериологическое исследование мокроты и назофарингеального мазка. Иммунохроматографический анализ выполнялся на тесте Binax NOW (ООО «Ниармедик плюс», Россия), разработанным для выявления растворимого антигена S. pneumoniae в моче. Исследование осуществлялось при поступлении пациента в стационар, до назначения этиотропной терапии, после получения информированного согласия больного. Для проведения анализа использовалась тест-кассета, содержащая мембрану с нанесенными в виде двух отдельных полосок кроличьими антителами к антигену S.pneumoniae и козьими антителами против IgG кролика в комбинации с конъюгатом из кроличьих антител к антигену S.pneumoniae и анти-видовых антител, конъюгированных с окрашенными частицами. Вторая полоска дает контрольную линию, проявляющуюся розовым или красным цветом. Кассета имеет лунку для внесения исследуемого в тесте образца, расположенную на противоположной стороне устройства. Образцы мочи для исследования собирали в стандартные контейнеры, доводили до комнатной температуры и непосредственно перед тестированием перемешивали легким вращательным движением. Затем стерильный тампон на палочке (прилагаемый к диагностическому набору) погружали в мочу и помещали в кассету. Добавляли 3 капли реагента А (цитратно-фосфатного буфера с лаурил-сульфатом, Твином-20 и азидом натрия) из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывали, чтобы привести исследуемый образец мочи в контакт с тест-полоской. При наличие в моче антигена S.pneumoniae происходит его связывание с находящимися на подложке антителами окрашенного конъюгата, а также с иммобилизованными на мембране кроличьими антителами к антигену S.pneumoniae, в результате чего возникает окрашенная розовая или красная линия в зоне чтения образца. Иммобилизованные на полоске в виде линии козьи антитела против IgG кролика также связывают окрашенный конъюгат и формируют вторую линию - контрольную. Положительный результат регистрировали через 10 - 15 минут по наличию двух окрашенных линий в зоне чтения. На отрицательный результат указывала одна окрашенная контрольная линия, свидетельствуя о том, что антиген S.pneumoniae в тестируемом образце не обнаружен. Бактериологическое исследование респираторного секрета и назофарингеального мазка проводили, согласно методическим указаниям, изложенным на основе международных рекомендаций (NCCLS, 2000) [7], с оценкой морфологических особенностей роста возбудителя и его фенотипических характеристик. Забор исследуемого материала производился при поступлении больного в стационар, до назначения антибактериальной терапии, с последующей его транспортировкой в бактериологическую лабораторию. При соблюдении питательных потребностей и других условий роста через 16 - 20 часов на 5% кровяном агаре пневмококк формировал мелкие округлые блестящие бесцветные с ровным краем мягкой консистенции и а-гемолизом колонии, которые спустя 24 часа имели полую сферическую форму с уплощенным центром, в результате аутолиза. При микроскопии обнаруживались грамположительные ланцетовидные диплококки диаметром 0,5 - 1,25 мкм, не имеющие спор и жгутиков. Большинство штаммов были окружены полианионной полисахаридной капсулой. Дальнейшая идентификация S.pneumoniae проводилась стандартными фенотипическими методами, основными из которых были чувствительность к оптохину и лизис в присутствии солей желчи. Конечным этапом определялась его чувствительность к антибиотикам. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel 2003, BIOSTAT для Windows (Microsoft). Достоверность различия определяли с использованием критерия X2 при р< 0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Оценка специфичности и чувствительности иммунохроматографического метода показала, что в группе пациентов (n=33) с бактериологически подтвержденным диагнозом пневмококковая пневмония антиген S. рneumoniaе в моче был выявлен у 28 человек, у 5 пациентов, в образцах мокроты которых был выделен S. рneumoniaе, экспресс-тест Binax NOW дал отрицательный результат. Среди пациентов с непневмококковой этиологией внебольничных пневмоний (n=42) у 4 человек в моче были обнаружены антигены S. рneumoniaе, в 38 случаях экспресс-тест Binax NOW дал отрицательный результат. Претестовая вероятность наличия S pneumoniae в дыхательных путях оказалась равна 42,7%. Доля правильных результатов теста составила 88%. Показатель чувствительности теста составил 84,8%, специфичности - 90,5%, что согласуется с результатами зарубежных и отечественных авторов (94% и 86% соответственно) [3, 14, 21]. Прогностическая ценность положительного результата иммунохроматографического экспресс-теста, указывающая на вероятность того, что пациент на данный момент действительно болен пневмококковой пневмонией и врач может с большей уверенностью считать, что положительный результат теста подтверждает предполагаемый диагноз, составила 86,9%. Прогностическая ценность отрицательного результата, то есть вероятность того, что при негативном результате теста у пациента отсутствует внебольничная пневмония, вызванная S. pneumoniae, была в пределах 88,9%. Отношение вероятности получения положительного результата теста у больного к вероятности положительного результата у здорового пациента (ОП+) составило 8,9. Следует отметить, что при ОП+=1 диагностический тест считается абсолютно неинформативным и вероятность положительного результата одинакова у больных и у здоровых пациентов [10]. Полученные нами данные указывают на то, что больной человек с большей вероятностью будет иметь положительный результат экспресс-теста в сравнении со здоровым и связь между положительным результатом и пневмококковой инфекцией высока. Получив хорошие характеристики валидности теста, на втором этапе исследования мы провели апробацию теста в клинике. В иммунохроматографическом методе было исследовано 260 образцов мочи от пациентов параллельно со взятием мокроты и назофарингеального мазка на микробиологическое исследование. Однако следует отметить, что микробиологическое исследование мокроты было проведено лишь у 165 (63,5%) пациентов, так как у остальных больных проведение бактериологического исследования было невозможным вследствие отсутствия при поступлении в стационар продуктивного кашля. Микробиологическое исследование назофарингеального мазка позволило выделить S. рneumoniaе у 12 пациентов (4,6±1,3%). При бактериологическом исследовании мокроты у больных, поступивших с продуктивным кашлем, S. рneumoniaе был выделен у 33 (20,0±2,0%) пациентов. В остальных случаях агентами, обусловившими развитие внебольничной пневмонии, явились: S. aureus (10,3±1,2%), M. tuberculosis (6,1 ± 1,1 %), K. рneumoniae (4,2±0,8 %), H. тй^^ае и M. catarrhalis (по 1,8±0,5%), S. pyogenes (1,2±0,9%). У 90 больных с наличием продуктивного кашля патогенная флора в мокроте не была выявлена, 59 (65,6±5,0%) из них до госпитализацией уже принимали антибактериальную терапию. У части больных определяли возбудителей, для которых нехарактерно развитие бронхолегочного синдрома, что свидетельствовало о контаминации материала флорой верхних дыхательных путей. К таким микроорганизмам относились: Streptococcus mitis (6,7± 1,9%), Streptococcus salivarius и Streptococcus oralis (по 4,8± 1,6%), Streptococcus milleri (3,6±1,4%), Staphylococcus epidermidis и Streptococcus viridans (по 0,6±0,3%). При исследовании 260 образцов мочи в иммунохроматографическом экспресстесте пневмококковая пневмония была диагностирована у 92 чел. (35,4±2,9%), которым своевременно была назначена терапия с учетом этиологии заболевания. ОБСУЖДЕНИЕ Показатели чувствительности и специфичности иммунохроматографического теста, характеристика валидности, полученная нами в ходе исследования, не отличаются от таковых, полученных по результатам многочисленных мультицентровых рандомизированных клинических исследований зарубежных авторов [21]. Первый опыт использования иммунохроматографического теста для диагностики пневмококковых пневмоний при обследовании пациентов, поступивших на госпитализацию в инфекционный стационар с предварительным диагнозом внебольничная пневмония, также показал его большую чувствительность по сравнению с бактериологическим исследованием. Так, при микробиологическом исследовании назофарингеального мазка S. pneumoniae был выделен в 4,6±1,3% случаев. Из 12 человек с установленным носительством S. pneumoniae у пяти отмечалось одновременное наличие пневмококка на слизистых оболочках носоглотки и в мокроте, что указывало на возможный переход бактерионосительства пневмококка в клиническую форму инфекции, у остальных 7 человек отсутствовал продуктивный кашель, из-за чего провести микробиологическое исследование мокроты было невозможно. Следует отметить, что у всех лиц с выявленным пневмококком иммунохроматографический экспресс-тест также определил содержание в моче пневмококкового клеточного полисахарида. Микробиологическое исследование мокроты, проведенное у больных в течение 72 часов от момента их госпитализации в отделение, оказалось эффективным лишь у 42,7±3,1% обследуемых больных. В остальных 57,3±3,1% случаев по указанным выше объективным и субъективным причинам микробиологический метод не позволил установить наличие возбудителя заболевания. Пневмококковая этиология заболевания была подтверждена в 20,0±2,0% случаев от числа бактериологически расшифрованных случаев. Использование иммунохроматографического экспресс-теста в этой же группе пациентов позволило выявить антиген S. pneumoniae в моче в 35,4±2,9% случаев. Хотелось бы отметить, что при сопоставлении результатов бактериологического и иммунохроматографического методов были определены микроорганизмы, давшие 4 ложноположительных результата в экспресс-тесте Binax NOW Ими оказались S. mitis, S. milleri, S. salivarius, что вполне понятно, поскольку они имеют сходный антиген, на нахождение которого направлен быстрый тест для выявления антигена S. pneumoniae [15]. Следует заметить, что указанные возбудители являются условно патогенной флорой. При верификации диагноза иммунохроматографическим экспресс-тестом антиген S. pneumoniae в моче определялся в 3,6 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании назофарингеального мазка (%2=14,7, p=0,000), и в 1,8 раза чаще, чем при исследовании мокроты (х2=5,9, p=0,015). Следует заметить, что проведение экпресс-теста при невозможности осуществления в течение первых часов от момента поступления больного в стационар можно, согласно рекомендациям, отсрочить на одни сутки. При этом, образцы мочи могут храниться при комнатной температуре (15 - 30°С) 24 часа до начала тестирования, а при 2 - 8°С или замороженные при (-10 -20°С) - две недели. В качестве консерванта может быть использована борная кислота. Также допускается пересылка образцов мочи в герметично упакованных контейнерах при 2 - 8°С или замороженными, что является несомненным удобством, так как при бактериологическом методе хранение исследуемого образца (мокроты) более 24 часов приводит к невозможности выделения возбудителя. Еще одним преимуществом иммунохроматографического теста, которое подчеркивается обществом инфекционных заболеваний Америки (IDSA), является его состоятельность у пациентов, принимавших антибактериальную терапию до начала госпитализации [22]. В нашем исследовании у двух пациентов, принимавших в течение 3 - 4 дней до поступления в стационар препараты, относящиеся к группе макролидов, иммунохроматографический экспресс-тест определил наличие антигена, что было подтверждено бактериологическим методом. Зарубежные исследователи отмечают некоторые ограничения предлагаемой методики. Так, тест валидирован только с использованием образцов мочи и спиномозговой жидкости (при менингитах). Другие биологические среды, которые могут содержать антиген S.pneumoniae, не оценивались, вследствие чего отрицательный результат, полученный в экспресс-тесте, не исключает наличия пневмококковой инфекции. Поэтому для постановки точного диагноза необходимо, опираясь на клинические проявления заболевания, использовать иммунохроматографический тест в сочетании с культуральными исследованиями [15]. Кроме этого, ложноположительные результаты экспресс-теста можно получить в первые 48 часов после введения пневмококковой вакцины, вследствие чего не рекомендуется назначать данную методику обследования в течение 5 дней после осуществления специфической профилактики [20]. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

V. V Nikolenko

Perm State Medical Academy

I. V Feldblyum

Perm State Medical Academy

N. N Vorobieva

Perm State Medical Academy

S. O Golodnova

Perm State Medical Academy

V. V Semerikov

Perm State Pharmaceutical Academy

A. V Polushkina

Perm State Medical Academy

K. A Pavroz

Perm State Medical Academy

References

Supplementary files