ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ТЕСТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОКОККОВОЙ ПНЕВМОНИИ


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Обоснование использования иммунохроматографического анализа для диагностики пневмококковой пневмонии. Материалы и методы. Изучена чувствительность и специфичность иммунохроматографического метода (тест-система Binax Now) для верификации пневмококковой пневмонии. Проведена апробация данного метода для этиологической расшифровки пневмоний у 260 пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар. Результаты. Установлена высокая чувствительность (84,8%) и специфичность (90,5%) иммунохроматографического теста. Антиген Streptococcus pneumoniae в моче у больных с внебольничной пневмонией при использовании иммунохроматографического экспресс-теста определялся в 3,6 раза чаще, чем при бактериологическим исследовании назофарингеального мазка, и в 1,8 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании мокроты. Заключение. Применение иммунохроматографического экспресстеста Binax NOW может быть рекомендовано для своевременной верификации пневмококковых пневмоний наряду с бактериологическим методом исследования.

Полный текст

По данным зарубежной литературы частота пневмоний у взрослых варьирует в широком диапазоне, составляя у лиц молодого возраста 1 - 11,6%, а в старших возрастных группах - 25 - 44% [17]. В России, согласно официальной статистике, среди населения старше 18 лет регистрируется до 440 000 случаев внебольничных пневмоний в год [9]. К числу наиболее распространенных поражений органов дыхания относится пневмококковая внебольничная пневмония, при которой у пациентов с тяжелой сопутствующей патологией (хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет, заболевания почек и печени, сердечно-сосудистой системы, ВИЧ-инфекция) летальность достигает 15 - 30% [2, 4]. Одной из причин высокой летальности является недостаточно эффективная лабораторная диагностика внебольничных пневмоний. По данным отечественной литературы известно, что у 50 - 70% больных с внебольничными пневмониями отсутствует этиологический диагноз [5 - 7, 9]. В настоящее время этиологическая расшифровка внебольничных пневмоний, вызванных Streptococcus рneumoniaе, в стационарах и поликлиниках осуществляется при исследовании мокроты бактериологическим методом, позволяющим выделить живую культуру возбудителя, определить чувствительность к антимикробным препаратам и провести внутривидовое ти-пирование штаммов. Однако этот метод имеет ряд недостатков: значительная продолжительность микробиологических исследований (результат определяется спустя 48 - 72 часа с момента получения материала), трудность идентификации патогенного микроорганизма при отсутствии продуктивного кашля [11]. Результативность бактериологического метода ограничивается также и широким распространением среди населения практики применения антибактериальных препаратов до обращения за медицинской помощью. При микробиологической идентификации чистой культуры лидирующего инфекционного агента пневмоний - S. pneumoniae известным препятствием является его высокая требовательность к питательным средам [7]. Кроме того, инкубация возбудителя осуществляется в атмосфере c повышенным содержанием СО2, что требует применения СО2-термостата. Указанные особенности приводят к дополнительным финансовым затратам. Следует отметить, что в настоящее время для верификации пневмококковых пневмоний нередко используется полимеразная цепная реакция. При этом ряд характеристик ПЦР: высокая чувствительность, возможность проведения анализа после начала антибактериальной химиотерапии, быстрота выполнения определяют преимущества этого метода в сравнении с другими. Однако, мнение о целесообразности использования ПЦР для диагностики пневмококковой инфекции весьма противоречивы. Ряд отечественных исследователей отмечают более высокую частоту обнаружения S. pneumoniae в патологическом материале, полученном от больных внебольничными пневмониями при применении ПЦР, в отличие от микробиологического исследования. Так, в мокроте при применении метода ПЦР S. pneumoniae обнаруживают в 79% , а при использовании микробиологического исследования лишь в 25%, в крови частота обнаружения S. pneumoniae данными методами составляет 25% и 0% соответственно [1]. За рубежом ПЦР-диагностика на пневмо- и аутолизины S. pneumoniae применяется ограниченно, так как в ходе изучения выявлено, что чувствительность ее не превышает 82% (по аутолизину) и 89% (по пневмолизину), а специфичность является минимальной - 38% и 27% соответственно [12, 13]. Методы по определению пневмококковых антигенов с помощью реакций встречного иммуноэлектрофореза, иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов не нашли широкого применения в силу высокой стоимости, трудоемкости и относительно недостаточных параметров чувствительности и специфичности [16, 18]. В последние годы все большую популярность приобретают иммунохроматографические экспресс-тесты идентификации возбудителей. Подобные методы быстрой лабораторной диагностики инфекций используются для обнаружения Helicobacter pylori в кале и Legionella pneumophila в моче, а также широко применяются для верификации таких распространенных инфекций как туберкулез, сифилис, гонорея, хламидиоз [21, 22]. Экспресс-тест используется в наркологии, выявляя всю гамму применяемых наркотических веществ с высокой достоверностью определения, в гинекологии и акушерстве, в кардиологии [23]. Между тем данные по использованию иммунохроматографического экспресс-теста для верификации пневмококковых пневмоний в отечественной литературе весьма малочисленны. Цель настоящего исследования явилось обоснование использования иммунохроматографического анализа для диагностики пневмококковой пневмонии. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа осуществлялось в два этапа. На первом этапе исследования мы провели оценку чувствительности и специфичности иммунохроматографического метода (тест Binax NOW) при верификации пневмококковой пневмонии. В качестве «золотого» стандарта был использован бактериологический метод. Были сформированы две группы пациентов (1 - 33 пациента с бактериологически подтвержденной пневмококковой пневмонией, 2 - 42 больных с пневмониями другой этиологии: Staphylococcus aureus (40,5+7,5%), Mycobacterium tuberculosis (23,8+6,5%), Klebsiella pneumoniae (16,7±5,7%), Moraxella catarrhalis (7,1 ±3,9%), Haemophilus influenzae (7,1 ±3,9%), Streptococcus pyogenes (4,8±3,2%). При бактериологическом исследовании мокроты у пациентов второй группы ни в одном случае S. pneumoniae выделен не был. Определение специфичности и чувствительности метода проводили с использованием четырехпольной таблицы по методу, изложенному в [10]. На втором этапе исследования мы апробировали данный тест на базе Краевой клинической инфекционной больницы для этиологической расшифровки пневмоний у больных, госпитализированных в инфекционный стационар в 2010 - 2012 гг. с диагнозом внебольничная пневмония, подтвержденным рентгенографией органов грудной клетки. Были обследованы 260 пациентов в возрасте 18 - 65 лет. Одновременно с обследованием биологического материала от пациентов в иммунохроматографическом анализе проводилось бактериологическое исследование мокроты и назофарингеального мазка. Иммунохроматографический анализ выполнялся на тесте Binax NOW (ООО «Ниармедик плюс», Россия), разработанным для выявления растворимого антигена S. pneumoniae в моче. Исследование осуществлялось при поступлении пациента в стационар, до назначения этиотропной терапии, после получения информированного согласия больного. Для проведения анализа использовалась тест-кассета, содержащая мембрану с нанесенными в виде двух отдельных полосок кроличьими антителами к антигену S.pneumoniae и козьими антителами против IgG кролика в комбинации с конъюгатом из кроличьих антител к антигену S.pneumoniae и анти-видовых антител, конъюгированных с окрашенными частицами. Вторая полоска дает контрольную линию, проявляющуюся розовым или красным цветом. Кассета имеет лунку для внесения исследуемого в тесте образца, расположенную на противоположной стороне устройства. Образцы мочи для исследования собирали в стандартные контейнеры, доводили до комнатной температуры и непосредственно перед тестированием перемешивали легким вращательным движением. Затем стерильный тампон на палочке (прилагаемый к диагностическому набору) погружали в мочу и помещали в кассету. Добавляли 3 капли реагента А (цитратно-фосфатного буфера с лаурил-сульфатом, Твином-20 и азидом натрия) из прилагающейся пластиковой капельницы. Устройство закрывали, чтобы привести исследуемый образец мочи в контакт с тест-полоской. При наличие в моче антигена S.pneumoniae происходит его связывание с находящимися на подложке антителами окрашенного конъюгата, а также с иммобилизованными на мембране кроличьими антителами к антигену S.pneumoniae, в результате чего возникает окрашенная розовая или красная линия в зоне чтения образца. Иммобилизованные на полоске в виде линии козьи антитела против IgG кролика также связывают окрашенный конъюгат и формируют вторую линию - контрольную. Положительный результат регистрировали через 10 - 15 минут по наличию двух окрашенных линий в зоне чтения. На отрицательный результат указывала одна окрашенная контрольная линия, свидетельствуя о том, что антиген S.pneumoniae в тестируемом образце не обнаружен. Бактериологическое исследование респираторного секрета и назофарингеального мазка проводили, согласно методическим указаниям, изложенным на основе международных рекомендаций (NCCLS, 2000) [7], с оценкой морфологических особенностей роста возбудителя и его фенотипических характеристик. Забор исследуемого материала производился при поступлении больного в стационар, до назначения антибактериальной терапии, с последующей его транспортировкой в бактериологическую лабораторию. При соблюдении питательных потребностей и других условий роста через 16 - 20 часов на 5% кровяном агаре пневмококк формировал мелкие округлые блестящие бесцветные с ровным краем мягкой консистенции и а-гемолизом колонии, которые спустя 24 часа имели полую сферическую форму с уплощенным центром, в результате аутолиза. При микроскопии обнаруживались грамположительные ланцетовидные диплококки диаметром 0,5 - 1,25 мкм, не имеющие спор и жгутиков. Большинство штаммов были окружены полианионной полисахаридной капсулой. Дальнейшая идентификация S.pneumoniae проводилась стандартными фенотипическими методами, основными из которых были чувствительность к оптохину и лизис в присутствии солей желчи. Конечным этапом определялась его чувствительность к антибиотикам. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel 2003, BIOSTAT для Windows (Microsoft). Достоверность различия определяли с использованием критерия X2 при р< 0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Оценка специфичности и чувствительности иммунохроматографического метода показала, что в группе пациентов (n=33) с бактериологически подтвержденным диагнозом пневмококковая пневмония антиген S. рneumoniaе в моче был выявлен у 28 человек, у 5 пациентов, в образцах мокроты которых был выделен S. рneumoniaе, экспресс-тест Binax NOW дал отрицательный результат. Среди пациентов с непневмококковой этиологией внебольничных пневмоний (n=42) у 4 человек в моче были обнаружены антигены S. рneumoniaе, в 38 случаях экспресс-тест Binax NOW дал отрицательный результат. Претестовая вероятность наличия S pneumoniae в дыхательных путях оказалась равна 42,7%. Доля правильных результатов теста составила 88%. Показатель чувствительности теста составил 84,8%, специфичности - 90,5%, что согласуется с результатами зарубежных и отечественных авторов (94% и 86% соответственно) [3, 14, 21]. Прогностическая ценность положительного результата иммунохроматографического экспресс-теста, указывающая на вероятность того, что пациент на данный момент действительно болен пневмококковой пневмонией и врач может с большей уверенностью считать, что положительный результат теста подтверждает предполагаемый диагноз, составила 86,9%. Прогностическая ценность отрицательного результата, то есть вероятность того, что при негативном результате теста у пациента отсутствует внебольничная пневмония, вызванная S. pneumoniae, была в пределах 88,9%. Отношение вероятности получения положительного результата теста у больного к вероятности положительного результата у здорового пациента (ОП+) составило 8,9. Следует отметить, что при ОП+=1 диагностический тест считается абсолютно неинформативным и вероятность положительного результата одинакова у больных и у здоровых пациентов [10]. Полученные нами данные указывают на то, что больной человек с большей вероятностью будет иметь положительный результат экспресс-теста в сравнении со здоровым и связь между положительным результатом и пневмококковой инфекцией высока. Получив хорошие характеристики валидности теста, на втором этапе исследования мы провели апробацию теста в клинике. В иммунохроматографическом методе было исследовано 260 образцов мочи от пациентов параллельно со взятием мокроты и назофарингеального мазка на микробиологическое исследование. Однако следует отметить, что микробиологическое исследование мокроты было проведено лишь у 165 (63,5%) пациентов, так как у остальных больных проведение бактериологического исследования было невозможным вследствие отсутствия при поступлении в стационар продуктивного кашля. Микробиологическое исследование назофарингеального мазка позволило выделить S. рneumoniaе у 12 пациентов (4,6±1,3%). При бактериологическом исследовании мокроты у больных, поступивших с продуктивным кашлем, S. рneumoniaе был выделен у 33 (20,0±2,0%) пациентов. В остальных случаях агентами, обусловившими развитие внебольничной пневмонии, явились: S. aureus (10,3±1,2%), M. tuberculosis (6,1 ± 1,1 %), K. рneumoniae (4,2±0,8 %), H. тй^^ае и M. catarrhalis (по 1,8±0,5%), S. pyogenes (1,2±0,9%). У 90 больных с наличием продуктивного кашля патогенная флора в мокроте не была выявлена, 59 (65,6±5,0%) из них до госпитализацией уже принимали антибактериальную терапию. У части больных определяли возбудителей, для которых нехарактерно развитие бронхолегочного синдрома, что свидетельствовало о контаминации материала флорой верхних дыхательных путей. К таким микроорганизмам относились: Streptococcus mitis (6,7± 1,9%), Streptococcus salivarius и Streptococcus oralis (по 4,8± 1,6%), Streptococcus milleri (3,6±1,4%), Staphylococcus epidermidis и Streptococcus viridans (по 0,6±0,3%). При исследовании 260 образцов мочи в иммунохроматографическом экспресстесте пневмококковая пневмония была диагностирована у 92 чел. (35,4±2,9%), которым своевременно была назначена терапия с учетом этиологии заболевания. ОБСУЖДЕНИЕ Показатели чувствительности и специфичности иммунохроматографического теста, характеристика валидности, полученная нами в ходе исследования, не отличаются от таковых, полученных по результатам многочисленных мультицентровых рандомизированных клинических исследований зарубежных авторов [21]. Первый опыт использования иммунохроматографического теста для диагностики пневмококковых пневмоний при обследовании пациентов, поступивших на госпитализацию в инфекционный стационар с предварительным диагнозом внебольничная пневмония, также показал его большую чувствительность по сравнению с бактериологическим исследованием. Так, при микробиологическом исследовании назофарингеального мазка S. pneumoniae был выделен в 4,6±1,3% случаев. Из 12 человек с установленным носительством S. pneumoniae у пяти отмечалось одновременное наличие пневмококка на слизистых оболочках носоглотки и в мокроте, что указывало на возможный переход бактерионосительства пневмококка в клиническую форму инфекции, у остальных 7 человек отсутствовал продуктивный кашель, из-за чего провести микробиологическое исследование мокроты было невозможно. Следует отметить, что у всех лиц с выявленным пневмококком иммунохроматографический экспресс-тест также определил содержание в моче пневмококкового клеточного полисахарида. Микробиологическое исследование мокроты, проведенное у больных в течение 72 часов от момента их госпитализации в отделение, оказалось эффективным лишь у 42,7±3,1% обследуемых больных. В остальных 57,3±3,1% случаев по указанным выше объективным и субъективным причинам микробиологический метод не позволил установить наличие возбудителя заболевания. Пневмококковая этиология заболевания была подтверждена в 20,0±2,0% случаев от числа бактериологически расшифрованных случаев. Использование иммунохроматографического экспресс-теста в этой же группе пациентов позволило выявить антиген S. pneumoniae в моче в 35,4±2,9% случаев. Хотелось бы отметить, что при сопоставлении результатов бактериологического и иммунохроматографического методов были определены микроорганизмы, давшие 4 ложноположительных результата в экспресс-тесте Binax NOW Ими оказались S. mitis, S. milleri, S. salivarius, что вполне понятно, поскольку они имеют сходный антиген, на нахождение которого направлен быстрый тест для выявления антигена S. pneumoniae [15]. Следует заметить, что указанные возбудители являются условно патогенной флорой. При верификации диагноза иммунохроматографическим экспресс-тестом антиген S. pneumoniae в моче определялся в 3,6 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании назофарингеального мазка (%2=14,7, p=0,000), и в 1,8 раза чаще, чем при исследовании мокроты (х2=5,9, p=0,015). Следует заметить, что проведение экпресс-теста при невозможности осуществления в течение первых часов от момента поступления больного в стационар можно, согласно рекомендациям, отсрочить на одни сутки. При этом, образцы мочи могут храниться при комнатной температуре (15 - 30°С) 24 часа до начала тестирования, а при 2 - 8°С или замороженные при (-10 -20°С) - две недели. В качестве консерванта может быть использована борная кислота. Также допускается пересылка образцов мочи в герметично упакованных контейнерах при 2 - 8°С или замороженными, что является несомненным удобством, так как при бактериологическом методе хранение исследуемого образца (мокроты) более 24 часов приводит к невозможности выделения возбудителя. Еще одним преимуществом иммунохроматографического теста, которое подчеркивается обществом инфекционных заболеваний Америки (IDSA), является его состоятельность у пациентов, принимавших антибактериальную терапию до начала госпитализации [22]. В нашем исследовании у двух пациентов, принимавших в течение 3 - 4 дней до поступления в стационар препараты, относящиеся к группе макролидов, иммунохроматографический экспресс-тест определил наличие антигена, что было подтверждено бактериологическим методом. Зарубежные исследователи отмечают некоторые ограничения предлагаемой методики. Так, тест валидирован только с использованием образцов мочи и спиномозговой жидкости (при менингитах). Другие биологические среды, которые могут содержать антиген S.pneumoniae, не оценивались, вследствие чего отрицательный результат, полученный в экспресс-тесте, не исключает наличия пневмококковой инфекции. Поэтому для постановки точного диагноза необходимо, опираясь на клинические проявления заболевания, использовать иммунохроматографический тест в сочетании с культуральными исследованиями [15]. Кроме этого, ложноположительные результаты экспресс-теста можно получить в первые 48 часов после введения пневмококковой вакцины, вследствие чего не рекомендуется назначать данную методику обследования в течение 5 дней после осуществления специфической профилактики [20]. Л ИТЕРАТУРА
×

Об авторах

В. В. Николенко

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

И. В Фельдблюм

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

Н. Н Воробьева

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

С. О. Голоднова

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

В. В Семериков

Пермская государственная фармацевтическая академия

Пермь

А. В Полушкина

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

К. А Павроз

Пермская государственная медицинская академия

Пермь

Список литературы

  1. Артемова Л.В. Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями. Автореф. дисс.канд. мед. наук. М., 2005.
  2. Баранов А.А., Брико Н.И., Намазова-Баранова Л.С. Современная клиникоэпидемиологическая характеристика пневмококковых инфекций. Лечащий врач. 2012, 4: 79-84.
  3. Биличенко Т.Н., Аргунова А.Н., Антонова О.А., Соловьев К.И., Гладин С.А., Никитина Н.Н., Лямин А.В., Чигищев А.П., Пучкина Н.Е. Частота пневмококковой пневмонии у взрослых больных терапевтических стационаров на трех территориях Российской Федерации. Пульмонология. 2013, 4: 29-36.
  4. Бисенова Н.М., Абжалова А.Б. Микробный пейзаж мокроты больных с респираторными инфекциями. Национальный приоритеты России. 2009, 2: 236-237.
  5. Брико Н.И. Бремя пневмококковых инфекций и направления совершенствования эпидемиологического надзора в России. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013, 6: 4-9.
  6. Козлов Р. С. Пневмококки: уроки прошлого - взгляд в будущее. Смоленск, МАКМАХ, 2010.
  7. Кречикова О.И., Козлов Р.С., Катосонова Л.К. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniaе. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000, 1: 88-98.
  8. Николенко В.В., Фельдблюм И.В., Воробьева Н.Н., Молчанова Л.А. Распространенность пневмококковой инфекции в крупном промышленном регионе и пецифическая профилактика у лиц с поражением респираторного тракта. Врач. 2010,4: 33-35.
  9. Николенко В.В., Воробьева Н.Н., Фельдблюм И.В., Голоднова С.О. Иммунохроматографический метод в диагностике пневмококковых заболеваний респираторного тракта. Журн. инфектологии. 2011, 3: 102-104.
  10. Покровский В.И., Брико Н.И. Общая эпидемиология с основами доказательной медицины: руководство к практическим занятиям. М., ГЭОТАР-Медиа, 2012.
  11. Чучалин А.Г., Синкопальников А.И., Страчунский Л.С. Внебольничная пневмония у взрослых. Практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике у взрослых. М., Атмосфера, 2006.
  12. Butler J.C., Hofmann J, Cetron M.S. The continued emergence ofdrug-resistant Streptococcus pneumonia in the United States: an update from the Centers for Disease Control and Preventions Sentinel Surveillance System. J. Infect. Dis. 1996, 174: 986-993.
  13. Catterall J. R. Streptococcus pneumoniae. Thorax. 1999, 54: 929-937.
  14. Dominguez J., Gali N., Blanco S. et al. Detection of Streptococcus pneumoniaе antigen by a rapid immunochromatographic assay in urine samples. Chest. 2001, 119: 243-249.
  15. Holmberg H., Krook A., Sjorgen A. Determination of antibodies to pneumococcal C polysaccharide in patients with community-acquired pneumonia. J. Clin. Microbiol. 1985, 22: 808814.
  16. Kellogg J.A., Bankert D.A., Elder C.J. Identification of Streptococcus pneumonia. J. Clin. Microbiol. 2001, 39: 3373-3379.
  17. Lim WS., Baudouin S.V., George R.S. et al. British Thoracic Society guidelines for the management of community-acguired pneumonia in adults - update 2009. Thorax. 2009, 64 (Suppl. III): 1-55.
  18. Metlay J.P., Fine M.J. Testing strategiens in the initial management of patients with community-acguired pneumonia. Ann. Intern. Med. 2003, 138: 109-118.
  19. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization. Weekly Epidemiological Record. 2007, 82 (12): 93-104.
  20. Robbins, J.B., Austrian R., Lee C.J. et al. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. J. Infect. Diseases. 1983, 148: 1136-1159.
  21. Shirin H., Brack R., Kenet G. et al. Evaluation of a new immunochromatographic test for Helicobacter pylori IgG antibodies in elderly symptomatic patients [see comments]. J. Gastroenterol. 1999, 34: 7-10.
  22. Sinclair A., Xie X., Teltscher M., Dendukuri N. Systematicreview and metaanalysis of a urine-based pneumococcal antigen test for diagnosis of communityacquired pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 2013, 51 (7): 2303-2310. DOI: 10.1128/ JCM.00137-13.
  23. Wennig R., Moeller M.R., Haguenoer J.M. et al. Development and evaluation of immuno-chromatographic rapid tests for screening of cannabinoids, cocaine, and opiates in urine. J. Anal. Toxicol. 1998, 22: 148-155.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Николенко В.В., Фельдблюм И.В., Воробьева Н.Н., Голоднова С.О., Семериков В.В., Полушкина А.В., Павроз К.А., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах