GRIPPOL, VAXIGRIP AND INFLUVAC VACCINES - INDUCTORS OF INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY FACTOR GENES IN HUMAN BLOOD CELLS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вакцины «Гриппол», «Ваксигрип» и «Инфлювак» находятся в арсенале основных медицинских препаратов, применяемых в настоящее время в России для защиты населения от заболеваемости гриппом [1, 2, 4, 5]. Они приготовлены из актуальных штаммов вируса гриппа, рекомендуемых ВОЗ на основании анализа эпидемической ситуации 2012 - 2013 гг. Исследованные инактивированные вакцины эффективно защищают людей от заболевания. Информация о развитии ими протективного иммунного ответа получена, главным образом, в серологических исследованиях специфического гуморального ответа. В меньшей степени изучались вызываемые ими реакции клеточного иммунитета. Сравнительный анализ действия вакцин «Гриппол», «Ваксигрип» и «Инфлювак» на генном уровне ранее не проводился. Вместе с тем, сегодня появилась возможность оценивать вакцинные препараты, применяя методы количественного анализа экспрессии генов и секретируемых клетками цитокинов [8]. Субъединичные вакцины представляют удобную модель для выяснения роли очищенных поверхностных гликопротеинов (гемагглютининов и нейраминидаза) вирусов гриппа в вызываемых ими реакциях клеточного иммунитета. В своей работе мы сравнили действие субъединичных вакцин со сплит-вакциной, приготовленной из разрушенных вирионов. Такой анализ имеет важное значение, т.к. высокопатогенный инфекционный вирус гриппа А вызывает в организме сильный воспалительный ответ, осложняющий течение заболевания. Важными составляющими врожденного и адаптивного иммунитета являются системы интерферона (ИФН) и РНК-интерференции [6]. Многофакторный иммунный ответ организма осуществляется с участием большой группы рецепторов врожденного иммунитета [11]. Регуляция их активности осуществляется сетью взаимодействий на транскрипционном и постранскрипционных уровне [15]. В нашей работе с гриппозными вакцинами изучена активность генов рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета TLR3 и TLR4 и корецептора Т-лимфоцитов - В2М (бета2-микроглобулина). Именно эти виды TLR узнают структуры вирусных РНК и гликолипротеидов. Через них происходит внутриклеточная передача сигналов на гены интерферонов и интерлейкинов - регуляторов Т- и В-клеточного иммунитета [14]. Активированные иммунокомпетентные клетки крови продуцируют антивирусные, иммунорегуляторные и провоспалительные цитокины, направляющие дифференцировку субпопуляций Т-лимфоцитов на распознавание ими вирусных антигенов. Активность корецептора В2М комплекса гистосоместимости 2 типа характеризует состояние адаптивного иммунитета и влияет на специфический гуморальный ответ антител. Имеются данные, что активность Dicer1 - ключевого фермента РНК-интерференции - также влияет на этот процесс [13]. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ «Гриппол» (Микроген, Россия) - гриппозная тривалентная полимер-субъ-единичная вакцина, жидкая [5]. Представляет собой высокоочищенный белковый препарат, содержащий только поверхностные антигены вирусов гриппа (гемагглюти-нин и нейраминидаза) типов A и В, связанные водорастворимым высокомолекулярным N-оксидированным производным поли-1,4-этиленпиперазина (иммуномодулятор полиоксидоний). В одной дозе вакцины содержится по 5 мкг гемагглютининов (ГА) 2 вирусов типа А (подтипы H1N1 и H2N2) и 11 мкг ГА вируса гриппа типа В, 500 мкг полиоксидония и консервант мертиолят. «Инфлювак» (Эбботт, Нидерланды) - тривалентная субъединичная вакцина, содержащая очищенные поверхностные протективные антигены гемагглютининов вирусов гриппа А/Калифорния/7/2009/NYMC X-181, A/Виктория/361/2011IVR-165 и В/Хубей-Вуджиаганг/156/2009 NYMCBX-39, прошла регистрационные испытания в России [1]. В одной прививочной дозе (0,5 мл) вакцины содержится по 15 мкг ге-магглютининов каждого вируса и вспомогательные вещества солей. «Ваксигрип» (Франция) - инактивированная высокоочищенная расщепленная (сплит) вакцина, применяется в России с 1992 г. [2]. Активный компонент - вирусы гриппа, выращенные в куриных эмбрионах, расщепленные и инактивированные. В одной дозе (0,5 мл) тривалентной вакцины содержится по 15 мкг ГА вирусов гриппа А/Калифорния/7/2009 NYMC X-ША (H1N1), А/Виктория/361/2011 IVR-165 (H3N2) и В/Хубей-Вуджиаганг/156/2009 NYMCBX-39, не более 0,05 мкг овальбумина и добавочные соли. Свежевзятую венозную кровь доноров разводили в отношении 1:3 в питательной среде RPMI-1640 с глютамином, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят и антибиотик гентамицин. Разведенную кровь разливали по 1 мл в культуральные стерильные пробирки с герметичными пробками. К ней добавляли препараты вакцин по 10 мкл из 1 дозы и по 10 мкл из разведений в 10 раз и 100 раз. В результате концентрация вакцин в 1 мл разведенной крови составила 1/100, 1/1000 и 1/10000 выпускаемой дозы. Расчет применяемых доз является приблизительным и сделан, исходя из объема крови в организме взрослого человека (в среднем 5 л). Инкубацию клеток крови с вакцинами проводили 24 ч при 37°С в термостате, затем клетки осаждали при 1000 об/мин на центрифуге и надосадочную культуральную жидкость собирали для тестирования цитокинов в ИФА. Осадки клеток лизировали в 0,5 мл буфера Тризол (Invitrogen, США) согласно инструкции и использовали для выделения и количественного анализа мРНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Подробное описание процедуры выделения РНК и обработки препарата ДНКзой, получения кДНК и проведения количественного ПЦР-анализа на приборе CFX-96 фирмы «Био-Рад» (США) приведены в [7]. Структура рассчитанных нами олигону-клеотидных праймеров приведена в табл. 1. Все праймеры были синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Полученный ПЦР-продукт соответствовал расчетному по f-плавления и подвижности в агарозном геле. Относительная оценка экспрессии ПЦР-продукт. Размер и t° плавления Последовательность 5'...................3' Ген/мРНК TLR3 П - AGT GCC GTC TAT TTG CCA CA О - GCA TCC CAA AGG GCA AAA GG П - GTC AGA CGG TGA TAG CGA GC О - TTA GGA ACC ACC TCC ACG CA П - ACT GAA TTC ACC CCC ACT GA О - CCT CCA TGA TGC TGC TTA CA П - CAG TTC AGA CAA GAG CAA CAC О - GTC TTC CCT GAG CCA GTG TTT 149 н.п. 80,5°С 177 н.п. 86,5°С 114 н.п. 80,5°С 300 н.п. 81°С TLR4 B2M DICER1 Стимуляция гриппозными вакцинами экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета в клетках крови. По оси ординат - кратность стимуляции активности генов. По оси абсцисс - TLR3 (1), TLR4 (2), B2M (3), Dicer1 (4), контроль клеток = 1. Приведены результаты действия 3 доз вакцин в разведениях (см. Материалы и методы). генов (дельта Cq) сделана в Таблица 1. Структура олигонуклеотидных ПЦР-праймеров программе CFX Manager «Gene expression analysis» в автоматическом режиме. Иммуноферментный анализ цитокинов ИФН-альфа, ИФН-гамма, ИЛ1-бета, ИЛ10, ИЛ17 и ФНО-альфа в культуральной жидкости выполнен с помощью ИФА-наборов фирмы «Вектор-бест» согласно прилагаемой инструкции. Количественное измерение оптической плотности и расчет концентрации в пг/мл выполнен на микропланшетном фотометре модели «Anthos 2010» в программе ADAP+. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Изучена экспрессия генов рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета TLR3 , TLR4 и B2M, играющих ведущую роль в антивирусной и антибактериальной защите. Особый интерес представляло выяснение участия систем ИФН и РНК-интерференции (РНК-и) в реализации протективных свойств вакцин. Обе системы работают в клетках одновременно и осуществляют неспецифическую и специфическую защиту от патогенов [6, 13]. Исследования проведены методом количественной ОТ-ПЦР и ИФА. Сопоставлен конститутивный уровень 4 исследованных генов в клетках крови здоровых доноров. Для этого был использован суммарный образец кДНК контрольных клеток и проведены 3 повторных ПЦР-определения в реальном времени. Значения пороговых циклов начала логарифмической фазы амплификации (Cq) значительно отличались и составили для мРНК TLR3=34,1±0,9; мРНК TLR4=26,3±0,2; мРНК B2M=20,8±0,8 и мРНК Dicer1=35,1±1,1. Наиболее низкие показатели Cq и, следовательно, самый высокий уровень транскрипции в клетках крови имеет ген В2М, который часто используется в качестве референс-гена. Однако этот ген является ИФН-зависимым и поэтому в исследованиях с ИФН и их ИФН-индукторами не пригоден как нормализатор [7]. Представленность мРНК 2 ТLR-рецепторов отличается в 64 раза, вероятно, отражая большую представленность и значимость мембранного TLR4 перед эндо-сомальным рецептором TLR3 в клетках крови. Уровень экспрессии фермента Dicer1 сравним с TLR3 и характеризирует участие обоих генов в сохранении клеточного гомеостаза. Эффект препаратов вакцин «Гриппол», «Инфлювак» и «Ваксигрип» на транскрипцию генов представлен на рис. Каждая вакцина имеет характерные особенности действия на генном уровне. Так, стимулирующие эффекты вакцины «Гриппол» на гены TLR3, TLR4, B2M и Dicer1 проявляются при максимальной дозе и затем исчезают, за исключением гена TLR4. Он оказался наиболее восприимчив к действию вакцины «Гриппол» (рис., а). Следует отметить выраженную активацию отечественной вакциной гена Dicer1. Вакцина «Инфлювак» в 3 дозах преимущественно активирует только ген рецептора TLR3 и в разведении 1/10 - ген TLR4. При этом вакцина подавляет экспрессию генов Dicer1, существенно не влияя активность гена В2М (рис., б). Наиболее сильным стимулятором генной транскрипции показала себя вакцина «Ваксигрип». Ее выраженные эффекты на исследованные гены проявляются при сниженных дозах в разведениях 1/10 и 1/100. В минимальной дозе вакцина в 8 раз активирует эндосомальный рецептор TLR3 и в 7 раз корецептор Т-лимфоцитов - B2M, имеющий значение для формирования адаптивного иммунного ответа (рис., в). Ген Dicer1 негативно регулируется сплит-вакциной в разведениях. На основании полученных данных мы можем заключить, что наличие в составе сплит-вакцины «Ваксигрип» вирионных РНК и внутренних белков существенно повышает ее иммуногенную активность. Преимущественными мишенями сплит-вакцины «Ваксигрип» являются гены TLR3 и В2М и в меньшей степени - Dicer1. Вместе с тем, ингибирующее действие на транскрипцию высоких доз может быть вызвано вирусными компонентами (белки полимеразы и М2). В культуральной жидкости клеток крови определены спонтанные и индуцированные вакцинами цитокины, имеющие сигнальное значение (ИЛ1-бета), антивирусное действие - ИФН-альфа и ИФН-гамма, связанный с воспалением, цитотоксический ФНО-альфа и иммуносупрессорный ИЛ 10, необходимый для дифференцировки Т-хелперов типа 2 и переключения на гуморальный ответ ответ В-лимфоцитов. Иммунный ответ Т- и В-лимфоцитов характеризуется образованием разных видов цитокинов. Активированные Т-хелперы типа 1 секретируют гамма-ИФН и ИЛ2, а Т-хелперы типа 2 - ИЛ4 и ИЛ10 [8]. Дифференцировка Т-клеток в Т-хелперы типа 17 сопровождается продукцией ИЛ17. Индукция цитокинов 3 исследованными дозами гриппозных вакцин суммирована в табл. 2. В процессе культивирования клеток крови здорового донора в среду спонтанно освобождались ИЛ 1-бета в количестве до 24 пг/мл и ФНО-альфа - до 6 пг/мл. Содержание ИФН-альфа и ИФН-гамма в среде культивирования клеток крови было низким, на пределе чувствительности Таблица 2. Продукция цигокитш клеткат крови в используемых ИФА-тест систем. ответ та вакцинные препараты J Timn Секретируемое количество ИЛ 10 Препараты вакцинРазведения вакцинЦитокины(пг/мл) альфа- ИФНгамма- ИФНФНОальфаИЛ1бетаИЛ10 было не выявляемым без индукции. Содержание в среде ИЛ17 до и после добавления гриппозных вакцин оставалось на нулевом уровне. «Гриппол»11,083,421,325,87,6 1/101,139,16,7123,80 1/1001,34,25,924,30 «Инфлювак»11,5226,615,625,66,9 1/101,366,711,611,10 1/1002,013,54,49,90 «Ваксигрип»110,5300,436,19,20 1/100,978,413,223,40 1/1001,93,43,97,40 Контроль*10,252,24,623,70 1/101,12,56,214,50 1/1001,20,93,69,40 Индуцированный уровень цито-кинов во многом характеризует формирование клеточного иммунитета. Прежде всего, это относится к продукции и секреции ИФН-альфа и ИФН-гамма [3, 14]. Выраженная ИФН-альфа индуцирующая активность присуща только сплит-вакцине «Ваксигрип» в максимальной дозе. Субъединичные вакцины «Гриппол» Примечание* Спо^™ продукция цто- и «Инфлювак» не являются индукто-кинов клетками крови без добавления вакцин. Выде- тягыи ленные числовые значения в опытах достоверно отли- рами ИФН-альфа. чаются от контроля (P<0,05). Все 3 вида исследованных вакцин индуцируют значительное количество ИФН-гамма. Ответ является зависимым от дозы. Максимально высокое количество гамма-ИФН дает сплит-вакцина «Ваксигрип», немного ниже - вакцина «Инфлювак». Действие вакцины «Гриппол» на синтез гамма-ИФН слабее. Полученные результаты убедительно демонстрируют участие Т-хелперов типа 1 в реализации антивирусного действия вакцин. Это согласуются с данными, полученными при испытаниях гриппозной вакцины к пандемическому вирусу H1N1/09 на свиньях [12]. Наблюдается позитивная корреляция в действии вакцин на гамма-ИФН и ФНО-альфа. Следует отметить, что этот воспалительный фактор, по сравнению с гамма-ИФН, индуцируется вакцинами в 10-кратно более низком количестве, несмотря на его спонтанную секрецию. «Гриппол», в отличие от «Ваксигрип» и «Инфлювак», стимулирует секрецию сигнального ИЛ1-бета. Вероятно, это обусловлено наличием в составе вакцины иммуномодулятора полиоксидония. При добавлении к клеткам крови максимальных доз субъединичных вакцин «Гриппол» и «Инфлювак» происходит индукция ИЛ10, который активирует Т-хелперы типа 2. Возможно, это ответная иммуносупрессорная реакция на синтез избыточного количества гамма-ИФН. Есть данные, что образование ИФН-гамма и продукция ИЛ10 находятся в антагонистических отношениях [10]. ОБСУЖДЕНИЕ В настоящее время наши знания о влиянии применяемых отечественных и зарубежных вакцинных препаратов на активность генов клеточного иммунитета и ИФН-гены крайне ограничены. При создании гриппозных вакцин не учитывалось их действие на экспрессию TLR-генов сигнальных рецепторов, ассоциированных с синтезом ИФН, гена B2M-корецептора и гена Dicer1 - фермента РНК-интерферен-ции. Все они имеют важное значение для формирования неспецифического и специфического иммунного ответа. В нашей работе с вакцинами «Гриппол», «Инфлювак» и «Ваксигрип» [4] получены новые результаты в отношении этих генов и группы цитокинов, секретируемых Т-хелперами 1 и 2 типов. Наряду с общими для 3 вакцин реакциями клеток крови человека выявлены и особенности как в уровне, так и в спектре индуцируемых генов и цитокинов. Наиболее ярко это проявляется при сравнении сплит-вакцины «Ваксигрип», содержащей структурные компоненты разрушенного вируса (фрагменты РНК и белки) с субъединичными вакцинами, в состав которых входят преимущественно очищенные ГА. Отечественная субъеди-ничная вакцина «Гриппол», по сравнению с импортной субъединичной вакциной «Инфлювак», содержит в 3 раза сниженные дозы ГА гриппа А, но дополнительно включает иммуномодулятор полиоксидоний [5]. Наличие в составе вакцины «Гриппол» иммуномодулятора, по нашим данным, усиливает индуцирующие эффекты очищенных ГА на гены Dicer1 и B2M. Кроме того, вакцина «Гриппол» с полиок-сидонием выделяется выраженной секрецией ИЛ1-бета клетками крови. Следует отметить способность сплит-вакцины, в отличие от субъединичных, проявлять обратный дозовый эффект на генном уровне. Вероятно, это обусловлено наличием в составе неразведенного препарата полного набора инактивированных формалином структур вирусов гриппа, которые в высоких дозах могут оказывать цитотоксический эффект.

About the authors

T. M Sokolova

Ivanovsky Research Institute of Virology, Moscow, Russia

A. N Shuvalov

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

V. V Poloskov

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

I. M Shapoval

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

M. P Kostinov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

References

Supplementary files