MALDI-TOF MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF CELL PROTEINS DURING IDENTIFICATION OF LEPTOSPIRA GENUS MEMBERS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Лептоспирозы остаются актуальной патологией в мире и в России [1], ежегодно выделяются уникальные культуры, идентификация которых затруднена в связи с усложненной систематикой лептоспир, их удивительной гетерогенностью, а также постоянным появлением новых сероваров. В последнем издании определителя Берджи 2010 г. на основании анализа ДНК и 16S рРНК род Leptospira подразделяется на 19 видов [10], из них 8 патогенных, 6 промежуточных и 5 сапрофитических. Недавно классифицирован еще один патогенный вид L. kmetyi [12]. Основной таксономической единицей по-прежнему остается серовар, среди патогенных лептоспир насчитывается более 250 сероваров, сапрофитических - 65. По гомологии поверхностного О-антигена серовары объединены в 25 и 38 серогрупп соответственно. Причем штаммы одной серогруппы и даже одного серовара могут относиться к разным видам лептоспир. Времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ ионизацией (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight, MALDI-TOF) - новый метод в диагностике инфекционных заболеваний и изучения их возбудителей, отличающийся высокой чувствительностью, скоростью, низкой стоимостью расходных материалов, а также широкими возможностями анализа белков, липидов, нуклеиновых кислот и других соединений. Наибольшее применение получил анализ клеточных белков (прямое белковое профилирование) как в идентификации микроорганизмов [4], так и в протеомном анализе [8, 13]. За рубежом появились первые публикации по MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации представителей рода Leptospira [7, 11], однако метод окончательно не разработан. Классическая идентификация включает дифференциацию патогенных и непатогенных лептоспир с помощью длительных по времени бактериологических тестов, определение серогруппы в реакции микроагглютинации (РМА) с групповыми сыворотками, определение серовара в РМА с панелью моноклональных антител или в перекрестной РМА с гипериммунными сыворотками. Коммерческие групповые сыворотки для ветеринарного применения выпускает единственное предприятие в России, а моноклональные антитела - единственное учреждение в мире [14]. Определение вида лептоспир требует наличия высокотехнологичного оборудования и специальных дорогостоящих реактивов для мультило-кусного секвенирования (MLST) или мультиплексной лигазной реакции с гибридизацией Название штамма Biw Серо вар Серогруппа Место и год выделения М20 1 L. interrogans copenliageni Референтные штаммы Icterohaemorrhagiae Дания, 1938 Moskva V1 L. kirschneri grippotyphosa Grippotyphosa Россия, 1928 Каширский 1 L. interrogans canicola Canicola Россия, 1939 Pomona 1 L. interrogans pomona Pomona Австралия, 1937 Перепелицин1 L. borgpetersenii tarassovi Tarassovi Россия, 1938 ВаШсо 2 L. interrogans australis Australis Австралия, 1934 Patoc 11 L.biflexa patoc Semaranga Италия, 1961 ЁЖ-12 L. interrogans bratislava Australis Россия, 1954 3705 2 L. interrogans woffii Sejroe Индонезия, 1924 М84 L. borgpetersenii sejroe Sejroe Дания, 1937 Akiyami А2 L. interrogans autumnalis Autumnalis Япония, 1922 HS 26 2 L. kirschneri djatzi Bataviae Пуэрто-Рико, 1950 Castellon 3 1 L. borgpetersenii castellonis Ballum Испания, 1955 Vleermuis 3868 L. kirschneri cynopteri Cynopteri Индонезия, 1938 Salinem2 L. interrogans pyrogenes Pyrogenes Индонезия, 1923 Veldrat L. borgpetersenii javanica Javanica Индонезия, 1938 Batavia 46 2 Kabura L. kirschneri kabura Hebdomadis Конго, 1958 Hebdomadis L. interrogans hebdomadis Hebdomadis Япония, 1916 Djasiman L. interrogans djasiman Djasiman Индонезия, 1938 RGA2 L. interrogans icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Бельгия, 1915 LSU 1945 L. noguchii louisiana Louisiana США, 1945 102 L. inadai lyme Lyme Великобритания, 1986 Sari L. borgpetersenii mini Mini Италия, 1940 CZ 214 2 L. noguchii panama Panama Панама, 1962 5621 L. interrogans mozdok Pomona Россия, 1965 Sarmin2 L. weilii sarmin Sarmin Индонезия, 1939 Автор Источник Откуда получен, год Borg-Petersen Человек Тарасов Человек НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2010 Терских Человек Clayton Человек Тарасов Человек Cotter, Sawers Человек Babudieri Вода Ананьин Ёж европейский НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 1983 Wolff Человек Borg-Petersen Человек Koshima Человек Alexander Apodemus sylvaticus Babudieri Apodemus sylvaticus Collier, Machtar Летучая мышь Baerman Человек Esseveld-Mochtar Черная крыса ВГНКИ, 2013 Van Riel Человек Ido, Ito, Wani Человек НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2013 («удаленный» анализ) Kotter Человек Uhlenhuth, Fromme Человек Roth et al. Броненосец Schmid et al. Человек Mino Человек Gale et al. Опоссум Семенова Microtus arvalis Wolff, Broom Человек ^ u (MLPA) [5, 6]. Имеющиеся трудности в К ^ | Ц диагностике лептоспирозов диктуют не- Продолжение таблицы 1 G S g к обходимость разработки и внедрения - щ ^ | современных лабораторных методов, в JS « том числе для идентификации патоген- 11 " ных лептоспир. ° 5© & ^ §©! S Цель исследования - разработка S4ft^ 54;^ п 3 методологических подходов идентифи- J3 |з кации лептоспир с использованием С технологии прямого белкового профилирования MALDI-TOF. О g VC | МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ § |з |з (Э (Э м § Использовали34штаммалептоспир £ & | £ g (табл. 1): 25 референтных патогенных, 1 референтный непатогенный (Patoc-I), выделенные в России из различных объектов, 6 патогенных и 1 промежуточный, а также 1 непатогенный, выделенный из воды в Туркмении (Байрам Али). Все культуры инкубировали в течение й 8§ к йй|дк^ семи-девяти дней при 28°С на среде ,S О ие S „ „ S g EMJH (Ellinghausen-McCullough-Johnб с с I son-Harris, Becton Dickinson, USA), g после чего проверяли рост микроско- 5 пированием в темном поле. Культуры ^ | концентрировали в микропробирках н Eppendorf 1,5 мл центрифугированием при 12 - 17 000 g в течение 5 - 15 минут о до получения видимого осадка диаме- 0009 5^ О О О g OOOO [h тром 2 - 5 мм. рн рн | Концентраты культур (осадки) от - _ _ _ oooo и W О О О к OOOO * Г\ . Г\ . Г\ . [Л, г, . г, . . л . мывали два-три раза стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) или забуференным физиологическим рас-Ц я | | | -е твором (ЗФР), для этого к осадку до- ‘й ннн к !-i !-i !- 2 о о с ВВ£ о о Q о о о й Л Л Л бавляли1,5млбуфера,встряхивалина ^ 'Й 'Й § OOOuS J -г г > г £ £ £ g g. вортексе и центрифугировали при 12 О ^ ^ п || - 17 000 g в течение 5 - 15 минут. Экстракция белка из отмытых концен-g g- тратов и нанесение образцов на MSP-о -д -д чип осуществлялись по протоколу для OJ 0J ЛЕЙ <->,•-<-> г/м g ^ ^ ^ gi изолированныхколонийбактерий[9]. 13 u ||* Метод «прямого нанесения» заключалй о о I ся в суспендировании осадка культуры ^ ОС'-О.^ ОЯ Vn к в зависимости от его величины в 20 - 60 мкл бидистиллированной воды и нанесении на MSP-чип 1 мкл суспензии с а и н ° последующим наслаиванием 1 мкл ма- •1 трицы (а-циано-4-гидроксикоричная .5 ^ 5 кислота в 50% ацетонитрила и 2,5% hJ ^ Ц трифторуксусной кислоты). При экс- ^ тракции муравьиной кислотой (formic g, acid - FA) и ацетонитрилом количество •е добавляемых реактивов рассчитыва- G лось также исходя из величины осадка РЗ 2 2^53 S культуры. о ft -V Ijy Ijy со О 3 -Й & ft й й5 § сс к t о с S л1 На базе НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи подготовку образцов к исследованию осуществляли двумя способами: нанесение на MSP-чип под матрицу и приготовление спиртовых препаратов. MSP-чипы с нанесенными белками хранили и транспортировали при комнатной температуре в течение четырех дней. Спиртовые препараты получали добавлением к концентратам культур 300 мкл стерильной бидистиллированной воды и после перемешивания - 900 мкл перегнанного спирта, хранили при температуре не выше минус 20°C и транспортировали по «холодовой цепи», непосредственно перед исследованием завершали экстракцию белка по стандартному протоколу [9]. Для получения библиотек спектров образцы исследовались в 10 - 12 повторах на масс-спектрометре Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) с использованием программы Flex Control 3.3. Параметры работы прибора были оптимизированы для диапазона отношения массы иона к его заряду (m/z) от 2000 до 20 000. Спектры снимали при напряжении Ion Source 1 (IS1) 20,0 кВ, Ion Source 2 (IS2) 18,05 кВ, напряжении на фокусирующей линзе - 6,00 кВ, частоте азотного лазера - 60 Гц. Каждый спектр получался путем суммирования 6 одиночных спектров (240 импульсов лазера). В качестве калибровочного стандарта и положительного контроля анализа использовался белковый экстракт штамма Escherichia coli DH5a (ref. № 255343; Bruker Daltonics, Германия). Анализ спектров, построение дендрограмм, генерацию референсных библиотек и идентификацию выполняли с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0. Для получения референсных спектров семидневные культуры концентрировали при 17 000 g и экстрагировали белки муравьиной кислотой [11]. При идентификации заключение о таксономической принадлежности осуществлялось на основании значения индекса совпадения (score value - SV): SV >2,3 - достоверная идентификация до вида; SV менее 2,299, но более 2,000 - достоверная идентификация до рода, вероятная идентификация до вида; SV в диапазоне 1,7 - 1,999 - вероятная идентификация до рода и менее 1,7 - недостоверный результат [9]. Для оценки достоверности различий значений SV применялся U-критерий Уилкоксона для независимых выборок (ранговый критерий Манна и Уитни) [2]. РЕЗУЛЬТАТЫ Для первичной апробации метода идентификации представителей рода Leptospira в базу данных MALDI Biotyper 3.0 были импортированы 7 референсных спектров, сгенерированных при анализе белковых экстрактов референтных штаммов лептоспир разных видов (табл. 1). Полученные белковые спектры лептоспир обладали абсолютной специфичностью по сравнению со спектрами 4127 микроорганизмов из базы данных. Результаты идентификации референтных штаммов соответствовали виду, значения SV приведены в табл. 2. Штамм Vleermuis 3668 некорректно идентифицировался как L. interrogans с SV до 2,6. Возможно, при длительном хранении и частых пересевах на жидких питательных средах произошли значительные изменения свойств штамма, кроме того, на дендрограмме L. interrogans и L. kirschneri не обнаруживают больших отличий. Апробированы различные варианты и выбраны оптимальные методы подготовки культур лептоспир для масс-спектрометрического анализа. Идентификация прошла до вида как при «прямом нанесении» культур лептоспир на MSP-чип, так и после экстракции белка муравьиной кислотой, в то же время SV в большинстве случаев был достоверно выше при методе белковой экстракции (табл. 2). После сравнения методов пробоподготов-ки в базу данных были добавлены еще 12 референсных спектров, в том числе L. inadai и L. weilii (табл. 1). Идентификация свежевыделенной в 2012 г. от бурозубки в г. Иркутск культуры 5-И серогруппы Javanica была успешной только после второго пассажа на EMJH (табл. 2), при этом вероятная идентификация до вида прошла в одном из 12 повторов, в десяти повторах - вероятная идентификация до рода и в одном случае SV составил менее 1,7. Рост штаммов 4-И и 5-И при первичных пассажах был скудным, но при удлинении сроков инкубации для накопления биомассы был получен недостоверный результат. В дальнейшем при пассировании на EMJH в течение нескольких месяцев удалось достичь как массивного роста, так и достоверной идентификации штаммов 4-И и 5-И до вида L. borgpetersenii. Подобную картину наблюдали при исследовании двух поступивших в 2012 г. референтных штаммов, хранившихся на среде ВГНКИ без доступа воздуха. SV был достоверно выше Таблица 2. Результаты идентификации штаммов лептоспир в зависимости от хранения образцов для «удаленного» анализа, методов пробоподготовки и нанесения на MSP-чип Название штамма Диапазон SV SV ср. Диапазон SV SV ср. Хранение на MSP-чипе (4 дня) Хранение спиртовых препаратов (до двух недель) p Djasiman 1.729 - 1.928 1.821 2.040 - 2.401 2.265 <0,001 Hebdomadis 1.884 - 2.162 1.995 2.011 - 2.492 2.276 <0,001 M20-11 1.768 - 1.786 1.777 2.011 - 2.328 2.180 <0,001 Sari 1.5 - 1.898 1.671 1.687 - 2.112 1.945 <0,001 М20-17 Не идентиф. 1.694 - 2.151 1.819 493 Не идентиф. 1.862 - 2.097 1.942 «Прямое нанесение» FA HS-26 1.199 - 2.404 2.128 1.812 - 2.310 2.153 >0,1 Salinem 2.086 - 2.414 2.312 2.320 - 2.483 2.419 <0,01 3705 2.301 - 2.566 2.427 2.485 - 2.669 2.545 <0,001 Akiyami A 2.325 - 2.490 2.398 2.555 - 2.685 2.597 <0,001 Ёж-1 2.154 - 2.436 2.324 2.409 - 2.605 2.528 <0,001 Ballico 2.177 - 2.45 2.336 2.283 - 2.585 2.483 <0,001 Цф 12 100 g 5 мин, FA Цф 17 000 g 10 мин, FA M 84 1.704 - 2.264 2.074 1.998 - 2.328 2.129 >0,1 Ballico 2.041 - 2.295 2.211 2.177 - 2.45 2.336 <0,01 Первый пассаж на EMJH Второй пассаж на EMJH 5-И Не идентиф. 1.756 - 2.159 2.026 Kabura 1.348 - 2.069 1.769 1.819 - 2.214 2.138 < 0,001 VB 46 1.662 - 2.420 1.994 2.050 - 2.430 2.284 < 0,001 Инкубация 8 суток, ЗФР, Цф 12 100 g 15 мин Инкубация 2-3 недели, Цф 17 000 g 10 мин 4-И 2.328 - 2.536 2.446 Не идентиф. 5-И 2.112 - 2.466 2.297 Не идентиф. П римечание. FA - экстракция муравьиной кислотой; Цф - центрифугирование, ЗФР - отмывка за-буференным физиологическим раствором. при втором пассаже на EMJH, чем при первом, однако в обоих случаях прошла вероятная идентификация штамма Kabura до вида L. kirschneri и достоверная идентификация штамма Veldrat Batavia 46 до вида L. borgpetersenii. Следовательно, при масс-спектрометрическом анализе клеточных белков лептоспир необходимо обязательно учитывать адаптацию к питательным средам. Выделенный в 2010 г. от рыжей полевки в Пермской области штамм 1322 П идентифицирован как L. kirschneri с диапазоном SV от 1,877 до 2,195. Выделенный из воды штамм Байрам Али идентифицирован с недостоверным результатом, на дендрограмме он находится на одной ветке с непатогенным штаммом вида L. biflexa. Субкультура М20-17 и штамм 493 определены до вида L. interrogans ориентировочно, а субкультура М20-11 - достоверно с индексом соответствия более 2,3 в трех из двенадцати повторов. При сопоставлении результатов исследования образцов с использованием разных методов пробоподготовки в большинстве случаев выявлена значимая зависимость SV от метода (табл. 2). При хранении образцов в течение нескольких дней на MSP-чипе идентификация прошла только до уровня рода. Концентрирование культур при 12 100 g в течение 5 минут дало сопоставимые результаты с предложенным ранее методом [7, 11], удлинение времени центрифугирования до 15 минут позволило улучшить качество анализа. Более эффективно концентрирование культур при 17000 g в комплексе с экстракцией белка муравьиной кислотой и хранение образцов в виде спиртовых препаратов при минус 20°C в случае «удаленного» анализа. В то же время, необходимо отметить, что выполнить идентификацию удалось при широком варьировании метода пробоподготовки: возраст культуры 7 - 9 дней соответствует стационарной фазе роста лептоспир на альбуминовых средах, после 10 дня начинается отмирание бактериальной популяции [3]; для отмывки подходит любой буфер с оптимальным рН 7,0 - 7,4; центрифугирование при 12 100 - 17 000 g в течение 5 - 15 минут способствует удалению примесей питательных сред. На построенной нами дендрограмме строго дифференцировались непатогенные, промежуточные и патогенные лептоспиры, а также другие представители порядка Spiro-chaetales семейств Spirochaetaceae (рода Borrelia) и Brachyspiraceae (рода Brachyspira). Отдельный кластер формировал патогенный вид лептоспир L. borgpetersenii, к которому были отнесены свежевыделенные культуры 4-И и 5-И. В серогруппе Javanica известно 17 сероваров, из которых восемь принадлежат к виду L. borgpetersenii, что сужает поиск при дальнейшем определении серовара изучаемой культуры. ОБСУЖДЕНИ Е Предлагаемая методика идентификации представителей рода Leptospira с использованием технологии MALDI-TOF масс-спектрометрического белкового профилирования дает возможность: 1. Дифференцировать патогенные, промежуточные и сапрофитические виды лептоспир. 2. Определять вид лептоспир. 3. Достоверность определения таксономической принадлежности представителей рода Leptospira зависит от условий культивирования, методики пробоподготовки и видовых отличий клеточных белков лептоспир. Минимальные видовые отличия наблюдаются у L. interrorgans и L. kirschneri. 4. Идентифицировать свежевыделенные культуры лептоспир при условии приспособления их к питательным средам. Метод «прямого нанесения» по эффективности в отдельных случаях не уступает методу экстракции муравьиной кислотой, достоверная идентификация до вида проходит в обоих случаях. Стандартный протокол экстракции белка муравьиной кислотой обязателен при получении референсных спектров, при идентификации культур можно ограничиться методом «прямого нанесения». Для «удаленного» анализа предпочтительно транспортировать образцы не нанесенными на MSP-чип (не подлежат хранению вне вакуума), а в виде спиртовых препаратов по «холодовой цепи» (хранение при минус 20°C). Таким образом, результаты исследования позволяют рассматривать методику идентификации лептоспир с использованием технологии прямого белкового профилирования MALDI-TOF как альтернативную MLST и MLPA. Значительная стоимость оборудования компенсируется высокой производительностью, быстротой и простотой метода, а также низкой стоимостью расходных материалов. Необходима стандартизация метода, особенно в отношении свежевыделенных культур.

About the authors

N. V Breneva

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

M. V Afanasiev

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

M. B Sharakshanov

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

A. S Ostyak

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

E. Yu Kiseleva

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

A. P Samsonova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russia

E. M Petrov

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russia

E. V Viktorova

Russian State Centre of Quality and Standardization of Medicinal Agents for Animals and Forage, Moscow, Russia

S. V Balakhonov

Irkutsk Research Institute of Plague Control, Russia

References

Supplementary files