IMMUNOGENICITY AND SAFETY OF VACCINE PREPARATIONS BASED ON CIRCULATING BORDETELLA PERTUSSIS STRAINS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Эпидемический процесс коклюшной инфекции продолжается, в том числе, в странах с высоким уровнем противококлюшной вакцинации. Одной из причин поддержания эпидемического процесса коклюшной инфекции является изменчивость B. pertussis, лежащая в основе его адаптация к меняющимся условиям внешней среды. Генетическая структура современных штаммов B. pertussis с аллельными вариациями генов, кодирующих основные патогенные факторы коклюшного микроба, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов. Среди циркулирующих в настоящее время штаммов B.pertus-sis наблюдается доминирование аллельной вариации по генам коклюшного токсина и пертактина ptxA1 - prn2, отличающихся по нуклеотидному составу от соответствующих аллелей вакцинных штаммов (ptxA2 и ptxA4; prn1), выделенных от больных коклюшем в 50 - 60 гг. ХХ века [6]. Одной из вероятных причин эпидемических вспышек коклюша в старших возрастных группах может быть циркуляция вирулентных штаммов возбудителя на фоне возрастного снижения противококлюшного иммунитета. Имеющиеся генетические различия между вакцинными и циркулирующими штаммами коклюшного микроба указывают на необходимость совершенствования средств вак-цинопрофилактики коклюша. Цель работы - исследование специфической активности и безопасности вакцинных препаратов, приготовленных из штаммов B. рertussis с характерной для современной популяции возбудителя генотипической характеристикой субъединиц ptxA коклюшного токсина (ptxA1) и пертактина (prn2). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использовали штаммы B. pertussis, выделенные от больных в 2001 - 2010 гг. в Москва. Питательные среды: среда Борде-Жангу с кровью, казеиново-угольный агар (КУА), жидкие питательные среды. Животные: мыши-гибриды линии Б^СВАх^^^). Обезвреженные корпускулярные препараты из свежевыделенных штаммов B. рertussis готовили в соответствии с [2]. Бесклеточные коклюшные вакцины получали в соответствии с [1]. Содержание отдельных антигенов в среде культивирования коклюшных микробов определяли в ИФА, который проводили в 96-луночных полистироловых планшетах производства фирмы «Nunc» (Дания) и «Биомедикал» (Россия). Оптическую плотность субстратной смеси измеряли с помощью многоканального спектрофотометра вертикального сканирования «Униплан» («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Для адсорбции на полистероле и в составе пероксидазных конъюгатов использовали гамма-глобулиновые фракции антисывороток к коклюшному токсину, филаментозному гемагглютинину и агглютиногенам 1, 2 и 3. Иммунобиологические свойства вакцин определяли в соответствии с [2, 3], а специфическую активность - с помощью протективного теста на мышах при внутримозговом введении заражающей дозы нейротропного штамма B. рertussis 18323. Специфическую токсичность определяли с помощью теста увеличения массы тела мышей путем введения животным внутрибрюшинно дозы цельноклеточной вакцины, рекомендованной для человека (10 МОЕ в объеме 0,5 мл) или дозы бесклеточной коклюшной вакцины, предполагаемой для введения человеку (25 мкг в объеме 0,5 мл). Остаточную токсичность определяли в тесте отека лапки мыши (ОЛ). Группе из 10 мышей в подушечку задней правой лапки вводили 0,05 мл (1 МОЕ) вакцины, в подушечку задней левой лапки - апирогенный р-р NaCl в том же объеме. Через 5 - 6 часов задние конечности предварительно получивших Рауш-наркоз животных ампутировали по голеностопному суставу и взвешивали. Вычисление остаточной токсичности вакцины проводили согласно [4]. Лейкоцитозстимулирующую активность (ЛСА) вакцин определяли путем подсчета количества лейкоцитов в 1 мм3 периферической крови опытных и контрольных (получивших инъекцию р-р NaCl) животных через 3 суток после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 2,5 МОЕ в объеме 0,5 мл. Хроническую токсичность определяли в группах опытных и контрольных мышей в соответствии с [4]. В опытных группах мышей иммунизировали внутрибрюшинно в течение 10 дней. За курс иммунизации была введена доза вакцины, эквивалентная человеческой. Мыши в контрольной группе получали инъекцию раствора натрия хлорида. Во время курса прививок и в течение последующих 7 сут регистрировали массу тела мышей. После окончания наблюдения по 5 особей из каждой группы (иммунизированных и контрольных мышей) были препарированы, и их органы (легкие, печень, почки, селезенка) подвергнуты осмотру и взвешиванию. Определение гистаминсенсибилизирующей активности (ГСА) вакцин проводили согласно [2]. Индекс ГСА рассчитывали как отношение ГСД50 осо5 к ГСД50 вакц , где ОСО 5 - отраслевой стандартный образец. РЕЗУЛЬТАТЫ На плотных питательных средах (среде Борде-Жангу и казеиново-угольном агаре) микробные клетки штаммов образовывали типичные для B. pertussis колонии. Все исследованные штаммы имели характерные признаки гладкой формы (фаза I) бактерий. Ранее было установлено [5], что из 35 исследованных штаммов 32 штамма относились к серовару 1.0.3, 2 штамма - к серовару 1.2.3 и 1 штамм к серовару 1.2.0, а по структуре гена ptхА все изученные штаммы (35) относились к аллельной вариации ptхА1. Нуклеотидная последовательность гена prn у большинства штаммов характеризовалась как prn 2, два штамма имели аллели prn3 и prn1, соответственно. На основании иммуноферментного анализа было установлено, что все штаммы экспрессировали коклюшный токсин, ФГА и соответствующие серовару штамма агглютино-гены. Содержание коклюшного токсина в современных штаммах варьировало в широких пределах (от 3 нг до 68 нг/МОЕ/мл) и в среднем соответствовало количеству КТ в вакцинных штаммах (МЕ=16,3±3,4 и 13,6+3,2 нг/МОЕ/мл, соответственно), т.е. не зависело от генотипической характеристики ptхА штаммов. Вместе с тем, 24% изученных свежевыделенных штаммов по уровню токсинообразования достоверно превышали средний показатель и содержали от 20 до 80 нг/МОЕ/мл КТ. Содержание филаментозного гемагглютинина и агглютиногенов 1, 2, 3 в свежевыделенных штаммах не отличалось от их содержания в вакцинных штаммах. На основе циркулирующих штаммов изготовлены цельноклеточные вакцинные препараты (ЦКВ). В качестве препаратов сравнения были использованы вакцины ЦКВ из трех вакцинных штаммов (№ 305, № 267 и № 475). В протективном тесте было установлено, что из 14 препаратов достаточный уровень защиты в тесте на выживаемость (от 60 до 90%) обеспечивали цельноклеточные препараты, приготовленные из 7 штаммов. Остальные цельноклеточные препараты были неим- Токсические и сенсибилизирующие свойства иммуногенных цельноклеточных вакцин из свежевыделенных штаммов B.pertussis Хроническая токсичность № штаммов Защитная активность (% выжив.) Тест на увеличение массы мышей (%) Тест ОЛ (%) к контролю Печень Почки Селезенка А .) Индекс ГСА к контролю Весовой индекс Р Весовой индекс Р Весовой индекс Р 162-01 89 74,2 17,8 0,075 >0,2 0,017 >0,05 0,009 >0,2 0,88 0,36 186-01 60 71,1 20,8 0,055 <0,001 0,014 <0,02 0,006 <0,01 0,67 7,63 151-03 70 9,5 25,0 0,052 <0,001 0,013 <0,02 0,007 <0,05 1,32 1,72 11-04 75 <10,0 38,7 0,06 <0,005 0,015 >0,1 0,008 >0,1 1,09 3/05 6-05 90 35,9 23,2 0,07 < 0,005 0,015 <0,02 0,007 <0,02 0,87 0,32 15-05 62 74,7 24,7 0,07 >0,1 0,017 >0,2 0,009 >0,5 0,90 2,25 19-05 65 100 29,4 0,06 <0,002 0,014 <0,001 0,008 <0,05 1,72 1,32 475 82 62,7 37,6 0,066 >0,05 0,019 >0,2 0,007 <0,05 0,43 1,44 305 86 50,2 66,6 0,078 >0,5 0,016 >0,05 0,008 >0,2 0,58 1,1 267 контроль (физ/р-р) 20 74 77,2 38,5 0,068 0,076 <0,02 0,03 0,017 <0,001 0,007 0,01 <0,02 0,54 6,7 муногенны, т.к. после введения разрешающей дозы вирулентного штамма 18323 выживаемость подопытных животных составляла от 20 до 50% . Цельноклеточные коклюшные препараты, приготовленные из вакцинных штаммов, защищали 74 - 86 % животных от заражающей дозы вирулентного штамма B.pertussis 18323. В табл. представлены результаты оценки токсических и сенсибилизирующих свойств иммуногенных цельноклеточных вакцин, приготовленных из свежевыделенных и вакцинных штаммов. Общепринятым критерием безопасности коклюшных препаратов [4] является тест на увеличение массы тела животных. Как следует из табл., вакцины из 4 циркулирующих штаммов отвечали установленным требованиям, т.к. увеличение массы тела животных превышало 60% по сравнению с контролем, вакцины из производственных штаммов (№ 475 и № 267) также отвечали этому тесту. При определении токсичности по тесту отека лапки мыши вакцины из циркулирующих штаммов, кроме штамма № 11-04, оценивались как слаботоксичные. Вакцины из производственных штаммов № 475, № 267 и из циркулирующего штамма № 11-04 являлись среднетоксичными. Вакцины из производственного штамма № 305 обладали выраженной токсичностью. Безопасность вакцин из циркулирующих штаммов была также оценена в тесте хронической токсичности. Одним из критериев, отражающих влияние вводимой вакцины на организм животных является весовой индекс, т.е. отношение массы органа к массе тела. Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что хроническое введение большинства вакцин оказывает негативное влияние на 1, 2 или 3 органа животного, вызывая уменьшение массы, наименее уязвимыми оказались легкие животных: в табл. не приводится, т.к. только одна вакцина из производственного штамма № 475 вызывала достоверное снижение массы легких. Наиболее уязвимой оказалась печень (у 7 групп из 11), затем почки и селезенка (у 5 групп). Введение препаратов из штаммов 305, 162-01 и 15-05 не оказало влияния на органы мышей. Выраженными лейкоцитозстимулирующими свойствами обладали вакцины из циркулирующих штаммов 151-03, 11-04 и 19-05 (ЛС-активность >1). При оценке сенсибилизирующих свойств было установлено, что большинство препаратов обладало выраженными гистаминсенсибилизирующими свойствами независимо от генотипической принадлежности штаммов B. pertussis, т.к. индекс гистаминсенсиби-лизирующей активности превышал 1,0. Таким образом, только одна из иммуногенных вакцин, приготовленная из циркулирующего штамма № 162-01, оказалась специфически безопасна и не обладала выраженной ГС-активностью. ОБСУЖДЕНИ Е Разработана технология получения бесклеточных коклюшных вакцин (БКВ) из свежевыделенных штаммов B. pertussis, соответствующих по структуре гена коклюшного токсина ptхА и гена пертактина prn циркулирующим штаммам возбудителя и адаптированных к росту в жидких питательных средах. Полученные препараты обладали выраженной протективной активностью и содержали не менее 4 МЗЕ в дозе 25 мкг белка, предполагаемой для введения человеку, что соответствует требованиям ВОЗ [4]. Полученные препараты были специфически безопасны, увеличение массы тела составляло 72 - 77% по сравнению с контролем и не сенсибилизировали животных к гистамину гидрохлориду в дозе, четырехкратно превышающей иммунизирующую дозу для человека. Полученные нами [5] и другими исследователями ранее [7] результаты свидетельствуют о наличии в популяции свежевыделенных штаммов В. pertussis штаммов с повышенным уровнем токсинообразования. Имеющиеся генетические отличия между вакцинными и циркулирующими в настоящее время штаммами, а также наличие в популяции возбудителя коклюша штаммов с повышенным уровнем токсинообразования и высокой вирулентностью диктует необходимость исследования возможности создания на их основе вакцинных препаратов. Ведущим фактором патогенеза коклюшной инфекции является коклюшный токсин. В связи с этим, важное практическое значение имеет отбор циркулирующих штаммов с высоким уровнем токсинопродукции. Способность к росту в культуре также является важной характеристикой штаммов. В результате проведенных исследований был отобран циркулирующий штамм серо-вара 1.0.3., имеющий типичные для циркулирующих штаммов генотипические характеристики, но отличающийся высоким уровнем токсинообразования. Штамм № 162-01 депонирован в коллекции штаммов ГИСК им. Л.А.Тарасевича, получен патент на изобретение № 2407788, 2009 г. «Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина». Штамм перспективен для включения в состав корпускулярных и бесклеточных коклюшных вакцин.

About the authors

E. M Zaitsev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

N. U Mertsalova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

M. V Britsina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

M. N Ozeretskovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

I. G Bazhanova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

A. S Shinkarev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

A. V Poddubikov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

References

Supplementary files