SORPTION PROPERTIES OF VARIOUS POLYSACCHARIDE MATRIXES TO LACTOBACILLUS PLANTARUM 8RA-3 BACTERIA

Full Text

В 2009 году во всем мире произошло глобальное распространение штамма вируса гриппа А(ШШ) свиного происхождения, беспрепятственно передающегося от человека к человеку, в связи с чем Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) был объявлен наивысший (6) уровень пандемической угрозы. В условиях циркуляции пандемического гриппа до проведения массовой вакцинации штаммом с антигенно актуальным гемаг-глютинином (HA) наличие у части людей перекрестно-реагирующих антител к нейраминидазе (NA), приобретенных после иммунизации сезонными гриппозными вакцинами или в результате естественной инфекции, может оказаться значимым в снижении тяжести заболевания и смертности. Европейский комитет по контролю медицинских препаратов установил сле- дующие критерии иммуногенности вакцин: кратность прироста среднегеометрического титра (СГТ) антител к гемаг-глютинину не менее 2,5 для лиц 18 - 60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых. В отношении живых гриппозных вакцин (ЖГВ) прямой связи серологической эффективности, оцениваемой по приростам антигемагглютинирующих антител с высоким уровнем защитной эффективности, до сих пор не показано. В связи с этим, актуальна разработка дополнительных критериев иммуногенности, таких как выявление антител к нейраминидазе. Кроме того, на совещаниях ВОЗ в 2005 и 2008 гг. ведущими экспертами было отмечено возрастающее значение разработки и усовершенствования методик для выявления антител к нейраминидазе вируса гриппа [3]. Целью настоящего исследования было изучение формирования антител к нейраминидазе пандемического штамма А(ШШ) после иммунизации моновалентной ЖГВ. Реассортантный штамм A(H7N1) RN1/09-swine A(H7N1), унаследовавший ген НА от родительского вируса А/ло-шадь/Прага/1/56(ШШ), а nA - от пандемического штамма А/Калифорния/ 07/09(H1N1), был подготовлен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах. Вакцинный штамм А/17/Калифорния/ 09/38(H1N1) [1], послуживший источником NA, был получен из коллекции штаммов отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Использовавшийся в качестве источника НА вирус А/лошадь/ Прага/1/56Щ7^), полученный из коллекции Центра по контролю и предупреждению заболеваний США, не проявлял перекрестного реагирования в РТГА с сыворотками крови волонтеров, иммунизированных тривалентной сезонной ЖГВ, а также привитых моновалентной ЖГВ подтипа A(H5N2), серопозитивных к соответствующим вакцинным компонентам. Все вирусы культивировали в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов при оптимальной температуре (+33°C) в течение 48 ч. Вирусный материал очищали и концентрировали. Концентрацию антигена выражали в гемагглютинирующих единицах, а также в единицах сиалидазной активности, измеренной по методу C.R.Lambre [5]. Нейраминидазу штамма А/Калифорния/07/09(ШШ) получали из разрушенных детергентом вирусных частиц по ранее описанной методике [7]. Степень чистоты препарата нейра-минидазы определяли методом SDS-электрофореза в 12% акриламидном разделяющем геле [4] с последующим анализом на денситометре GS-800 (Bio-Rad). Чистота конечного препарата по данным денситометрии составила 95%. В исследовании использовали сыворотки крови волонтеров 18 - 20 лет, привитых моновалентной ЖГВ A/17/Кали-форния/09/38(НШ1) осенью 2009 г. двукратно с интервалом 10 дней. Образцы капиллярной крови были получены на 21 день после второй вакцинации. Дополнительно тестировали сыворотки крови невакцинированных волонтеров, собранные осенью 2005 г. В качестве положительного контроля в исследовании использовали сыворотки лиц, перенесших естественную инфекцию пандемическим вирусом A(H1N1), предоставленные лабораторией биотехнологии и диагностических препаратов Научно-исследовательского института гриппа СЗО РАМН. Антитела к нейраминидазе штамма А/Калифорния/07/09(ШШ) определяли в тесте ингибирования сиалидазной активности нейраминидазы [5] с использованием диагностического реас-сортантного штамма RN1/09-swine A(H7N1), предварительно определив оптимальные условия ферментативной реакции для NA свиного происхождения. Титр сывороточных антинейрами-нидазных антител рассчитывали как величину, обратную разведению образца, дающего 50% подавление активности NA, т.е. двукратное снижение оптической плотности по сравнению с вирусным контролем при считывании результатов на спектрофотометре (Universal microplate reader ELx800, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.). Дополнительным тестом послужил иммуноферментный анализ (ИФА), выполненный по описанной ранее методике [6] с некоторыми модификациями: контакт с сывороткой был сокращен до 2 ч при комнатной температуре. В качестве подложки использовали реассортантный вирус RN1/09-swine A(H7N1) или очищенную нейраминидазу штамма А/ Калифорния/07/09(ШШ) в концентрации 100 АЕ/0,1 мкл и 1 мкг/мл, соответственно. РТГА выполняли c 0,75% взвесью куриных эритроцитов в 96-лу-ночных полимерных планшетах для иммунологических реакции с «Ш-дном с использованием в качестве антигена вакцинного штамма A/17/Калифор-ния/09/38(НШ1). Для всех серологических методик, за исключением теста ингибирования сиалидазной активности, использовались обработанные RDE (receptor destroying enzyme, Denka Seiken CO) сыворотки крови. Результаты обрабатывали с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0). Фоновая картина уровня антител к нейраминидазе вируса А/Калифорния/ 07/09(H1N1) среди обследованных волонтеров была сходной как до появления пандемического штамма А(ШШ), так и в начале его циркуляции. Осенью 2009 г., то есть в период циркуляции гриппа А/ Калифорния/07/09(ШШ), 30% непривитых волонтеров имели титры антител к нейраминидазе >1:20, при этом серопозитивными по отношению к гемагглюти-нину пандемического штамма были 5% лиц, а у 1,7% волонтеров были выявлены антигемагглютинирующие антитела в титре >1:40, что может свидетельствовать о перенесенном контакте с новым вариантом вируса частью обследованных. Осенью 2005 г., то есть задолго до появления в циркуляции гриппа А/Калифор-ния/07/09(ШШ), у значительной части обследованных волонтеров (32,2%) также были выявлены антитела к нейрамини-дазе N1 пандемического штамма 2009 г. в титрах >1:20. При этом перекрестнореагирующих антигемагглютинирующих сывороточных антител в титрах >1:20 у исследованного контингента обнаружено не было. После двукратной прививки ЖГВ А(ШШ) нового подтипа наблюдался статистически значимый прирост антител как к нейраминидазе, так и к гемаг-глютинину пандемического штамма; в группе плацебо такого прироста не отмечалось. Процент совпадения результатов реакций торможения гемагглютина-ции и ингибирования сиалидазной активности NA в отношении выявления/не выявления сероконверсий к поверхностным антигенам вируса A(H1N1) в одних и тех же парах сывороток крови волонтеров составил 64,7%. Сероконверсии к HA при отсутствии сероконверсий к NA выявлены у 29,4% вакцинированных волонтеров; 5,9% приходилось на долю лиц, положительно ответивших выработкой антинейраминидазных, но не антигемагглютинирующих антител. Двусторонний вариант точного критерия Фишера связи между сероконверсиями антител к двум поверхностным антигенам вируса у одних и тех же лиц не выявил (p=0,24). Формирование антител к нейраминидазе у лиц, привитых ЖГВ или перенесших естественную инфекцию, было подтверждено в ИФА с очищенным вирусом RN1/09-swine A(H7N1). Наиболее высокие уровни антител к нейраминидазе, превышающие таковые после вакцинации ЖГВ в среднем в 8,7 (p<0,001) и 31,6 (p=0,003) раза по данным теста ингибирования сиалидазной активности и ИФА, соответственно, были выявлены у лиц, перенесших естественную инфекцию. Применение цельного вируса на основе лошадиного штамма подтипа А(Ш^) для выявления антинейраминидазных антител в ИФА оправдано тем, что данные ИФА, полученные на всех имевшихся в наличии образцах сывороток крови из клинических испытаний моновалентной пандемической ЖГВ с использованием в качестве антигена очищенного белка и реассортантного диагностического штамма, хорошо коррелировали между собой. Полученные данные об уровне антител к поверхностным антигенам вируса А/Калифорния/07/09(ШШ) среди обследованных волонтеров до и после начала циркуляции указанного штамма позволяют предположить, что антитела к нейраминидазе отличаются более широким спектром взаимодействия по сравнению с антигемагглютинирующими антителами. Это также подтверждается данными других исследований. Двукратная иммунизация ЖГВ нового подтипа эффективно стимулировала выработку как антинейраминидазных антител, так и антител к гемагглютинину пандемического штамма, не всегда, однако, согласованную. Превосходство титров антинейраминидазных антител у переболевших над соответствующими показателями для волонтеров, привитых ЖГВ, также согласуется с ранее полученными данными о более интенсивном приросте антител к нейраминидазе у лиц, перенесших клинически выраженные заболевания по сравнению с бессимптомной инфекцией. Традиционная методика выявления антинейраминидазных антител, стандартизованный протокол которой опубликован в бюллетене ВОЗ 1973 года [2], является многоступенчатой и трудоемкой и требует использования таких токсичных реагентов, как соли мышьяка и тио-барбитуровой кислоты, вследствие чего широкое ее применение для оценки антинейраминидазных антител после иммунизации гриппозными вакцинами весьма затруднительно. В нашем исследовании мы следовали протоколу C.R.Lambre [5], лишенному перечисленных недостатков и позволяющему инструментально учитывать результаты, что обеспечивает высокую степень стандартизации. Модифицированный метод ингибирования сиалидазной активности с использованием подготовленного реас-сортантного диагностического штамма, содержащего нейраминидазу пандемического штамма А/Калифорния/07/09 (H1N1), позволил выявить антитела к нейраминидазе у лиц, привитых ЖГВ или перенесших естественную инфекцию. Кроме того, показано, что RN1/09-swine A(H7N1) может быть также использован для обнаружения антинейраминидазных IgG в ИФА в качестве антигена вместо очищенной нейраминидазы, получение которой является трудоемким. Это обстоятельство значительно упрощает данный вид анализа при массовом обследовании.

About the authors

T. A Smolonogina

Research Institute of Experimental Medicine

St. Petersburg, Russia

Yu. A Desheva

Research Institute of Experimental Medicine

St. Petersburg, Russia

A. A Shaldzhyan

Research Institute of Influenza

St. Petersburg, Russia

M. P Grudinin

Research Institute of Influenza

St. Petersburg, Russia

L. G Rudenko

Research Institute of Experimental Medicine

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files