ОБРАЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ К НЕЙРАМИ-НИДАЗЕ ВИРУСА ГРИППА А/КАЛИФОР-НИЯ/07/2009 (H1N1) ПОСЛЕ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ МОНОВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНОЙ


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Выявление антител к нейраминидазе (NA) вируса гриппа А/Калифор-ния/07/2009 (НШ1) в сыворотках крови волонтеров после иммунизации живой гриппозной моновалентной вакциной (ЖГВ). Материалы и методы. Использовали тест ингибирования антителами ферментативной активности нейраминидазы реассортантного вируса A(H7N1), содержащего NA пандемического штамма. В иммуноферментном анализе (ИФА) определяли антинейраминидазные IgG к цельному реассортантному вирусу A (H7N1) и очищенной NA штамма А/ Калифорния/07/2009 (Н1Ш). Результаты. После двукратного введения ЖГВ серонегативным лицам у них выявляли (в реакции торможения гемагглютинации) прирост антител к гомологичной нейраминидазе в среднем в 1,5 раза. Наиболее высокий уровень антинейраминидазных антител выявлен у лиц, перенесших естественную инфекцию. Показана корреляция между титрами антинейраминидазных IgG, полученными в ИФА с цельным реассортантным вирусом A(H7N1) и очищенным белком. Заключение. Модифицированный метод ингибирования сиалидазной активности и ИФА с реассортантным диагностическим штаммом применимы для оценки антинейраминидазных антител.

Полный текст

В 2009 году во всем мире произошло глобальное распространение штамма вируса гриппа А(ШШ) свиного происхождения, беспрепятственно передающегося от человека к человеку, в связи с чем Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) был объявлен наивысший (6) уровень пандемической угрозы. В условиях циркуляции пандемического гриппа до проведения массовой вакцинации штаммом с антигенно актуальным гемаг-глютинином (HA) наличие у части людей перекрестно-реагирующих антител к нейраминидазе (NA), приобретенных после иммунизации сезонными гриппозными вакцинами или в результате естественной инфекции, может оказаться значимым в снижении тяжести заболевания и смертности. Европейский комитет по контролю медицинских препаратов установил сле- дующие критерии иммуногенности вакцин: кратность прироста среднегеометрического титра (СГТ) антител к гемаг-глютинину не менее 2,5 для лиц 18 - 60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых. В отношении живых гриппозных вакцин (ЖГВ) прямой связи серологической эффективности, оцениваемой по приростам антигемагглютинирующих антител с высоким уровнем защитной эффективности, до сих пор не показано. В связи с этим, актуальна разработка дополнительных критериев иммуногенности, таких как выявление антител к нейраминидазе. Кроме того, на совещаниях ВОЗ в 2005 и 2008 гг. ведущими экспертами было отмечено возрастающее значение разработки и усовершенствования методик для выявления антител к нейраминидазе вируса гриппа [3]. Целью настоящего исследования было изучение формирования антител к нейраминидазе пандемического штамма А(ШШ) после иммунизации моновалентной ЖГВ. Реассортантный штамм A(H7N1) RN1/09-swine A(H7N1), унаследовавший ген НА от родительского вируса А/ло-шадь/Прага/1/56(ШШ), а nA - от пандемического штамма А/Калифорния/ 07/09(H1N1), был подготовлен методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах. Вакцинный штамм А/17/Калифорния/ 09/38(H1N1) [1], послуживший источником NA, был получен из коллекции штаммов отдела вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Использовавшийся в качестве источника НА вирус А/лошадь/ Прага/1/56Щ7^), полученный из коллекции Центра по контролю и предупреждению заболеваний США, не проявлял перекрестного реагирования в РТГА с сыворотками крови волонтеров, иммунизированных тривалентной сезонной ЖГВ, а также привитых моновалентной ЖГВ подтипа A(H5N2), серопозитивных к соответствующим вакцинным компонентам. Все вирусы культивировали в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов при оптимальной температуре (+33°C) в течение 48 ч. Вирусный материал очищали и концентрировали. Концентрацию антигена выражали в гемагглютинирующих единицах, а также в единицах сиалидазной активности, измеренной по методу C.R.Lambre [5]. Нейраминидазу штамма А/Калифорния/07/09(ШШ) получали из разрушенных детергентом вирусных частиц по ранее описанной методике [7]. Степень чистоты препарата нейра-минидазы определяли методом SDS-электрофореза в 12% акриламидном разделяющем геле [4] с последующим анализом на денситометре GS-800 (Bio-Rad). Чистота конечного препарата по данным денситометрии составила 95%. В исследовании использовали сыворотки крови волонтеров 18 - 20 лет, привитых моновалентной ЖГВ A/17/Кали-форния/09/38(НШ1) осенью 2009 г. двукратно с интервалом 10 дней. Образцы капиллярной крови были получены на 21 день после второй вакцинации. Дополнительно тестировали сыворотки крови невакцинированных волонтеров, собранные осенью 2005 г. В качестве положительного контроля в исследовании использовали сыворотки лиц, перенесших естественную инфекцию пандемическим вирусом A(H1N1), предоставленные лабораторией биотехнологии и диагностических препаратов Научно-исследовательского института гриппа СЗО РАМН. Антитела к нейраминидазе штамма А/Калифорния/07/09(ШШ) определяли в тесте ингибирования сиалидазной активности нейраминидазы [5] с использованием диагностического реас-сортантного штамма RN1/09-swine A(H7N1), предварительно определив оптимальные условия ферментативной реакции для NA свиного происхождения. Титр сывороточных антинейрами-нидазных антител рассчитывали как величину, обратную разведению образца, дающего 50% подавление активности NA, т.е. двукратное снижение оптической плотности по сравнению с вирусным контролем при считывании результатов на спектрофотометре (Universal microplate reader ELx800, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.). Дополнительным тестом послужил иммуноферментный анализ (ИФА), выполненный по описанной ранее методике [6] с некоторыми модификациями: контакт с сывороткой был сокращен до 2 ч при комнатной температуре. В качестве подложки использовали реассортантный вирус RN1/09-swine A(H7N1) или очищенную нейраминидазу штамма А/ Калифорния/07/09(ШШ) в концентрации 100 АЕ/0,1 мкл и 1 мкг/мл, соответственно. РТГА выполняли c 0,75% взвесью куриных эритроцитов в 96-лу-ночных полимерных планшетах для иммунологических реакции с «Ш-дном с использованием в качестве антигена вакцинного штамма A/17/Калифор-ния/09/38(НШ1). Для всех серологических методик, за исключением теста ингибирования сиалидазной активности, использовались обработанные RDE (receptor destroying enzyme, Denka Seiken CO) сыворотки крови. Результаты обрабатывали с помощью статистического пакета «Statistica» (версия 6,0). Фоновая картина уровня антител к нейраминидазе вируса А/Калифорния/ 07/09(H1N1) среди обследованных волонтеров была сходной как до появления пандемического штамма А(ШШ), так и в начале его циркуляции. Осенью 2009 г., то есть в период циркуляции гриппа А/ Калифорния/07/09(ШШ), 30% непривитых волонтеров имели титры антител к нейраминидазе >1:20, при этом серопозитивными по отношению к гемагглюти-нину пандемического штамма были 5% лиц, а у 1,7% волонтеров были выявлены антигемагглютинирующие антитела в титре >1:40, что может свидетельствовать о перенесенном контакте с новым вариантом вируса частью обследованных. Осенью 2005 г., то есть задолго до появления в циркуляции гриппа А/Калифор-ния/07/09(ШШ), у значительной части обследованных волонтеров (32,2%) также были выявлены антитела к нейрамини-дазе N1 пандемического штамма 2009 г. в титрах >1:20. При этом перекрестнореагирующих антигемагглютинирующих сывороточных антител в титрах >1:20 у исследованного контингента обнаружено не было. После двукратной прививки ЖГВ А(ШШ) нового подтипа наблюдался статистически значимый прирост антител как к нейраминидазе, так и к гемаг-глютинину пандемического штамма; в группе плацебо такого прироста не отмечалось. Процент совпадения результатов реакций торможения гемагглютина-ции и ингибирования сиалидазной активности NA в отношении выявления/не выявления сероконверсий к поверхностным антигенам вируса A(H1N1) в одних и тех же парах сывороток крови волонтеров составил 64,7%. Сероконверсии к HA при отсутствии сероконверсий к NA выявлены у 29,4% вакцинированных волонтеров; 5,9% приходилось на долю лиц, положительно ответивших выработкой антинейраминидазных, но не антигемагглютинирующих антител. Двусторонний вариант точного критерия Фишера связи между сероконверсиями антител к двум поверхностным антигенам вируса у одних и тех же лиц не выявил (p=0,24). Формирование антител к нейраминидазе у лиц, привитых ЖГВ или перенесших естественную инфекцию, было подтверждено в ИФА с очищенным вирусом RN1/09-swine A(H7N1). Наиболее высокие уровни антител к нейраминидазе, превышающие таковые после вакцинации ЖГВ в среднем в 8,7 (p<0,001) и 31,6 (p=0,003) раза по данным теста ингибирования сиалидазной активности и ИФА, соответственно, были выявлены у лиц, перенесших естественную инфекцию. Применение цельного вируса на основе лошадиного штамма подтипа А(Ш^) для выявления антинейраминидазных антител в ИФА оправдано тем, что данные ИФА, полученные на всех имевшихся в наличии образцах сывороток крови из клинических испытаний моновалентной пандемической ЖГВ с использованием в качестве антигена очищенного белка и реассортантного диагностического штамма, хорошо коррелировали между собой. Полученные данные об уровне антител к поверхностным антигенам вируса А/Калифорния/07/09(ШШ) среди обследованных волонтеров до и после начала циркуляции указанного штамма позволяют предположить, что антитела к нейраминидазе отличаются более широким спектром взаимодействия по сравнению с антигемагглютинирующими антителами. Это также подтверждается данными других исследований. Двукратная иммунизация ЖГВ нового подтипа эффективно стимулировала выработку как антинейраминидазных антител, так и антител к гемагглютинину пандемического штамма, не всегда, однако, согласованную. Превосходство титров антинейраминидазных антител у переболевших над соответствующими показателями для волонтеров, привитых ЖГВ, также согласуется с ранее полученными данными о более интенсивном приросте антител к нейраминидазе у лиц, перенесших клинически выраженные заболевания по сравнению с бессимптомной инфекцией. Традиционная методика выявления антинейраминидазных антител, стандартизованный протокол которой опубликован в бюллетене ВОЗ 1973 года [2], является многоступенчатой и трудоемкой и требует использования таких токсичных реагентов, как соли мышьяка и тио-барбитуровой кислоты, вследствие чего широкое ее применение для оценки антинейраминидазных антител после иммунизации гриппозными вакцинами весьма затруднительно. В нашем исследовании мы следовали протоколу C.R.Lambre [5], лишенному перечисленных недостатков и позволяющему инструментально учитывать результаты, что обеспечивает высокую степень стандартизации. Модифицированный метод ингибирования сиалидазной активности с использованием подготовленного реас-сортантного диагностического штамма, содержащего нейраминидазу пандемического штамма А/Калифорния/07/09 (H1N1), позволил выявить антитела к нейраминидазе у лиц, привитых ЖГВ или перенесших естественную инфекцию. Кроме того, показано, что RN1/09-swine A(H7N1) может быть также использован для обнаружения антинейраминидазных IgG в ИФА в качестве антигена вместо очищенной нейраминидазы, получение которой является трудоемким. Это обстоятельство значительно упрощает данный вид анализа при массовом обследовании.
×

Об авторах

Т. А Смолоногина

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

Ю. А Дешева

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

А. А Шалджян

НИИ гриппа

Санкт-Петербург

М. П Грудинин

НИИ гриппа

Санкт-Петербург

Л. Г Руденко

НИИ экспериментальной медицины

Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. и др. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. Заявка на изобретение № 2009 134 769, дата приема 16.09.09.
  2. Aymard-Henry M., Coleman M.T., Dowdle WR. et al. Influenza virus neuraminidase and neuraminidase-inhibition test procedures. Bull. World Health Organ. 1973,48: 199-202.
  3. Bright R.A., Neuzil K.M., Pervikov Y et al. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 2009, 27: 6366-6369.
  4. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, 227 (5259): 680-685.
  5. Lambre C.R., Terzidis H., Greffard A. Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates. J. Immunol. Methods. 1990,135: 49-57.
  6. Sandbulte M.R., Jimenez G.S., Boon A.C. et al. Cross-reactive neuraminidase antibodies afford partial protection against H5N1 in mice and are present in unexposed humans. PLoS Medicine. 2007, 4 (2): 265-272.
  7. Shirvan A.N., Moradi M., Aminian M. et al. Preparation of neuraminidase-specific antiserum from the H9N2 subtype of avian influenza virus. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2007, 31 (4): 219-223.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Смолоногина Т.А., Дешева Ю.А., Шалджян А.А., Грудинин М.П., Руденко Л.Г., 2011

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах