EFFECT OF PHENOL ON YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS BACTERIA CULTIVATED IN VARIOUS MEDIA

Full Text

Антисептики и дезинфектанты широко применяются для борьбы с бактериальным загрязнением. Одним из биоцидов, используемых в течение длительного времени и до сих пор не потерявших своего значения, является фенол. Однако антимикробная активность фенольных соединений значительно варьирует для различных видов микроорганизмов. В связи с этим, одной из проблем, имеющих фундаментальное и прикладное значение, является выяснение влияния фено- типической адаптации бактерий к различным внешним условиям на их устойчивость к биоцидам. Y. pseudotuberculosis - грамотрица-тельные бактерии, обладающие высоким адаптивным потенциалом, что делает их удобной моделью для изучения регуляции факторами внешней среды устойчивости микроорганизмов к биоцидам. В работе использовали штамм KS 3058 этих бактерий серовара О:1Ь, полученный как описано в работе [1]. Бактерии выращивали в аэробных условиях в колбах на качалке (180 об/мин) на питательном бульоне (ПБ, Оболенск) и питательном бульоне с добавлением 0,5% глюкозы (ПБ+Гл) или 0,5% галактозы (ПБ+Гал) в течение 6 сут при 8°С до достижения стационарной фазы. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) фенола определяли методом серийных разведений. О росте тест-культур судили по изменению оптической плотности суспензий и численности жизнеспособных клеток (КОЕ) методом высева на плотные питательные среды. Количество мертвых клеток в культурах бактерий определяли с помощью флуоресцентного красителя бромистого этидия [10]. Анализ проводили в лунках 96-луночного планшета. Изменения флуоресценции (возбуждение при 530 нм, испускание при 590 нм) регистрировали на спектрофлуориметре FL-600 («Bio-Tek», США). Для каждой концентрации фенола рассчитывали интенсивность флуоресценции бромистого этидия в относительных единицах, принимая за максимальную величину флуоресценцию клеток, лизированных многократным замораживанием-оттаиванием. В качестве нулевого контроля использовали нативные бактерии без добавления фенола. Концентрацию фенола, при которой происходила гибель 50% клеток для каждой культуры Y. pseudotuberculosis, определяли из графиков зависимости относительной флуоресценции бромистого этидия в клетках от концентрации фенола через 30 мин после его внесения. ДСН-ПААГ-электрофорез лизатов клеток и окрашивание ЛПС ионами серебра выполняли по методике [6]. Липидные экстракты получали двукратной обработкой клеток смесью хлороформ:метанол (2:1, по объему) в течение 2 ч при 8°С. Полярные липиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией в системах, описанных в работе [7]. Фосфолипиды идентифицировали сравнением с заведомыми образцами с использованием специфических реагентов [8]. Количество индивидуальных фосфолипидов (в % от суммы фосфолипидов) определяли по содержанию фосфора в липидных экстрактах методом, описанным в работе [9]. Жирные кислоты получали гидролизом суммарных липидов 6 М NaOH (100°С, 4 ч) и анализировали в виде метиловых эфиров с помощью газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, как описано в работе [2]. Для дифференциальной сканирующей калориметрии использовали прибор ДСМ-2М (НПО «Биоприбор», Пущино, Россия). Образцы нагревали/охлаждали со скоростью сканирования 16°С/мин в интервале температур от -100°С до 60°С при чувствительности 40 мВт. Положение максимума теплопоглощения на температурной шкале определяли как температуру фазового перехода. Температурную шкалу калибровали по стандартным образцам нафталина, ртути и индия. Диапазон экспериментальных ошибок не превышал 5%. Методом серийных разведений в жидких средах было установлено, что бактерии псевдотуберкулеза, культивированные на 3 разных питательных средах: ПБ, ПБ+Гл и ПБ+Гал прекращают рост при концентрации фенола в среде 1 мг/мл. Количество жизнеспособных клеток, высеваемых после обработки бактериальной культуры фенолом в МПК, существенно зависит от состава питательной среды. В культуре, выращенной на ПБ, их количество составляло не более 2% клеток, тогда как в культурах, выращенных на средах с углеводами, оно было более чем на порядок выше. Окрашивание клеток бромистым этидием подтверждает эти результаты. Экспозиция бактерий с фенолом (1 мг/мл) в течение 5 ч приводит к полной гибели клеток в культуре, растущей на ПБ, тогда как в популяциях, культивируемых в ПБ+Гл и ПБ+Гал, число мертвых клеток составило только 30%. Используя метод окрашивания клеток бромистым этидием, мы изучили влияние концентрации (0,5 - 8 мг/мл) фенола и продолжительности обработки (0,5 - 5 ч) на выживаемость бактерий псевдотуберкулеза. Увеличение концентрации фенола и времени обработки сопровождается увеличением числа погибших клеток. Практически для всех концентраций фенола, проверенных в данной работе, процесс завершается в течение 5 ч: количество погибших клеток достигает постоянной величины. Концентрация фенола, вызывающая гибель 50% клеток в популяции, значительно варьировала в зависимости от состава среды культивирования: у клеток, выращенных в ПБ+ГЛ или ПБ+Гал, она выше, чем у клеток, культивированных в ПБ (3,0 - 3,4 мг/мл и 1,4 мг/мл, соответственно). Бактерицидный эффект фенола проявляется при его концентрации (МПК) 0,5 мг/мл для клеток, культивируемых на ПБ, мг/мл для клеток, растущих в присутствии сахаров. Минимальная бактерицидная концентрация фенола для исследованных культур изменялась от 1 до 8 мг/мл. Для полной инактивации бактерий псевдотуберкулеза, независимо от присутствия углеводов в ростовой среде, требуется их обработка 8 мг/мл фенола продолжительностью не менее 1 ч. В культуре, растущей на ПБ, можно выявить по меньшей мере 2 субпопуляции, чувствительные к фенолу в концентрации 0,5 мг/мл и 1 мг/мл; в бактериях, культивируемых на ПБ+Гл - 3 субпопуляции: устойчивы к концентрациям фенола 1 мг/мл (небольшая популяция), 2 мг/мл (основная) и 4 мг/мл; в культуре, растущей в ПБ+Гал, наряду с субпопуляциями, чувствительными к 1 мг/мл и 2 мг/мл фенола, появляется дополнительная - устойчивая к 4 мг/мл биоцида, инактивируемая при концентрации фенола 8 мг/мл. Таким образом, степень устойчивости Y. pseudotuberculosis к фенолу не является постоянной характеристикой, а может изменяться под действием внешних факторов, в частности, от состава среды для культивирования. Она растет в ряду: бактерии, культивированные на ПБ<бакте-рии на ПБ+Гл<бактерии на ПБ+Гал. Из бактерий, культивируемых на 3 разных средах и обработанных в течение 2 ч фенолом в бактерицидной концентрации 8 мг/мл или не обработанных (нативных), были выделены фосфолипиды. Согласно данным фосфолипидного анализа содержание лизофосфатидилэтано-ламина (ЛФЭ) в клетках, обработанных биоцидом, в сравнении с нативными, возрастает в 4 раза (с 3,9 до 16,7%). Напротив, уровень фосфатидилэтанола-мина (ФЭ) в таких клетках резко (в 1,6 раза) уменьшается (с 76,8 до 48,2%). Кроме этого, при обработке фенолом уменьшается общее количество экстрагируемых липидов, увеличивается уровень анионных фосфолипидов - фосфатидил-глицерина (ФГ) и дифосфатидилглице-рина (ДФГ), дополнительно появляются монометиловый эфир фосфатидилэтано-ламина (МеФЭ) и незначительное количество трех фосфолипидов-Х не установленной структуры. Как известно, такой состав липидов характерен для бактерий, находящихся в стрессовых условиях [3]. При этом надо отметить, что выдержка изолированных из бактерий фосфолипидов с фенолом в течение 24 ч к изменениям в их составе не привела. Был установлен качественный состав жирных кислот бактерий, культивированных на ПБ и обработанных и не обработанных фенолом. Обработка клеток фенолом изменение в качественный состав жирных кислот не вносит. Клетки содержат следующие кислоты: 14:0, 14:lw7, 15:0, 15:1, 16:0, 16:lw9, 16:lw7, 17:0, 17:1, 17:0су, 18:0, 18:lw9, 18:lw7, 22:0. Тем не менее, в ответ на введение биоцида уровень кислот 16:lw7, 18:lw7 и 17:0су снижается, a 18:lw9 и насыщенных жирных кислот - возрастает. В результате этого уменьшается отношение количества ненасыщенных жирных кислот к насыщенным (Хненас/Хнас=0,5 против 0,7 в контроле). Термотропное поведение фосфолипидов, выделенных из клеток, выращенных на ПБ и обработанных и не обработанных фенолом, было исследовано методом сканирующей микрокалориметрии. Термопереход фосфолипидов нативных клеток происходит в области температур от -13 до +25°С с максимумом при +5°С. Тепловой переход фосфолипидов клеток, обработанных фенолом, осуществляется в температурном интервале от +3 до +39°С с температурой максимума при +20°С. По данным ДСН-ПААГ электрофореза после обработки клеточных суспензий фенолом во всех образцах культуральных жидкостей, в отличие от контрольных, появляется значительное количество ЛПС. По результатам электрофореза ЛПС показывали бимодальное распределение, типичное для ЛПС S-формы и подобное таковому ЛПС клеточных лизатов нативных клеток. Фенол, вероятно, взаимодействует с наружной мембраной Y pseudotuberculosis и, более того, нарушает ее целостность, в пользу чего свидетельствует появление в культуральной жидкости после контакта клеток с фенолом липополисахарида и активация мембранной фосфолипазы А (обнаруживается по накоплению в клетках ЛФЭ) [5]. В клетках, обработанных биоцидом, увеличивается содержание насыщенных и уменьшается количество ненасыщенных жирных кислот. По-видимому, это объясняется влиянием фенола на активность десатураз либо в результате их прямой денатурации, либо за счет снижения их активности из-за изменений в составе фосфолипидов. Кроме того, обработка клеток фенолом приводит к повышению температуры максимума теплопоглощения фазового перехода их липидов - с 8 до 19°С. Это позволяет говорить о повышении стабильности мембраны бактерий в ответ на стрессорное воздействие фенола. Поддержанию высокой температуры фазового перехода и большей стабилизации липидного бислоя у бактерий, подвергшихся воздействию фенола, может способствовать повышение суммарного содержания кислых фосфолипидов, ФГ и ДФГ, а также увеличению содержания насыщенных ЖК. Кроме того, накопление в таких клетках ЛФЭ может стабилизировать бислой и привести к более плотной упаковке липидов, а следовательно, повысить температуру их фазового перехода [4]. Образование в липидной фракции МеФЭ в результате метилирования ФЭ и частичной потери у него заряда полярной головки, тоже можно рассматривать в качестве одного из факторов стабилизации мембраны бактерий под действием биоцида. Полученные данные позволяют предполагать, что гибели клетки под действием фенола в бактерицидной концентрации предшествует период, когда она в ответ на фенол-индуцированный стресс пытается стабилизировать мембрану путем модификации ФЛ и ЖК состава. Полученные результаты свидетельствуют о том, что необходимо с осторожностью использовать клетки, убитые фенолом, для характеристики липидного состава бактерий, а также о том, что в случае немутантных штаммов отклонение ФЛ состава от нормального (высокое содержание ЛФЭ и низкий уровень ФЭ) может быть показателем действия на клетку повреждающего фактора. Данные о факторах внешней среды, способствующих повышению устойчивости бактерий к фенольным биоцидам, могут быть полезными для более эффективного использования этих агентов при проведении дезинфекционных мероприятий, направленных на уничтожение возбудителей на объектах окружающей среды, являющихся факторами их передачи. Работа выполнена при поддержке Президиума РАН, программа «Молекулярная и клеточная биология», грант № 051-1-510-018.

About the authors

S. I Bakholdina

Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

Vladivostok, Russia

F. N Shubin

Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Vladivostok, Russia

N. M Sanina

Far Eastern Federal University

Vladivostok, Russia

T. F Solovyeva

Pacific Institute of Bioorganic Chemistry

Vladivostok, Russia

References

Supplementary files