INFLUENCE OF ELECTROMAGNETIC EMISSION AT THE FREQUENCIES OF MOLECULAR ABSORPTION AND EMISSION SPECTRA OF OXYGEN AND NITROGEN OXIDE ON THE ADHESION AND FORMATION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA BIOFILM

Full Text

Микроорганизмы образуют на объектах окружающей среды, в том числе медицинском оборудовании, и тканях макроорганизма биологические пленки - многоуровневые структуры, поддерживаемые организованной бактериальной массой за счет сложной системы межклеточных взаимодействий, объединенных в понятие Quorum Sensing [6]. Пусковым механизмом формирования биопленок является процесс адгезии, особенно специфической, обусловленной наличием на клетках макроорганизма рецепторов к бактериальным адгезинам. Объединение бактерий в биопленки повышает их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, в том числе к действию специфических и неспецифических механизмов противомикробной резистентности и антимикробных препаратов [1]. Именно поэтому поиск путей предотвращения формирования биопленок и их дезинтеграции является актуальной задачей. Не исключено, что одним их предполагаемых способов подобного влияния может быть применение ЭМИ, механизмы действия которого интенсивно исследуются в настоящее время. Возможно его влияние на индукцию реактивных форм кислорода, генерируемых как бактериальными клетками, так и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [3]. Исходя из этого цель настоящей работы - оценка влияния ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO на адгезию, развитие популяции и образование биопленок Pseudomonas aeruginosa. Использован клинический штамм P. aeruginosa 123. Адгезивную активность штамма до и после воздействия ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO оценивали по способности бактериальных клеток адсорбироваться на поверхности эритроцитов человека 0(I) группы, рассчитывая средний показатель адгезии (СПА). При СПА=1,01-2,0 бактерии считали низкоадгезивными, при СПА=2,01-4,0 - среднеадгезивными и при СПА >4,0 - высокоадгезивными [4]. Для изучения влияния ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO на динамику популяций штамма из суточной агаровой культуры готовили суспензию концентрацией 105 КОЕ/мл, по 0,1 мл которой засевали в 100 мл мясо-пептонного бульона в колбах Эрленмейера. На спектрофотометре СФ-26 при длине волны 560 нм определяли оптическую плотность (ОП) полученных взвесей. Посевы помещали в термостат при 37°С и выращивали в металлическом контейнере, экранировавшем бактериальные клетки от облучения. Для обеспечения одинаковых условий развития на протяжении 24 ч внутри контейнера и внутри рабочей камеры поддерживалась постоянная температура 37°С. Через 6 и 12 ч после посева одну из опытных колб извлекали из контейнера и в том же термостате подвергали облучению ЭМИ на частоте МСПИ О2 и МСПИ NO в течение 15 или 30 мин при плотности мощности 0,3 мВт/см2, после чего вновь помещали в контейнер и продолжали культивировать до конца суток. Измерение ОП всех исследуемых образцов проводили через 8, 14 и 24 ч после посева. Образование биопленок изучали по способности клеток P. aeruginosa адге-зировать на поверхности 96-луночного полистеролового планшета [7]. Источником ЭМИ был квазиоптический генератор, разработанный в ОАО «Центральный НИИ измерительной аппаратуры» (Саратов), в котором возбуждались электромагнитные колебания частотой 129 ГГц и 150 ГГц, имитирующие структуру молекулярного спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота [5]. Точное значение заданной частоты определяли в соответствии с международной базой данных молекулярных спектров высокого разрешения HITRAN с учетом поправок на атмосферное давление и температуру окружающей среды [2]. Бактерии P. aeruginosa 123 обладали высокой адгезивной активностью - СПА=5,32±0,06. При воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O2 в течение 15 мин этот показатель увеличился до 6,08±0,08 (p<0,05), в течение 30 мин - до 6,56 ±0,02 (p<0,05). Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO на адгезивную активность штамма P. aeruginosa не влияло: при облучении в течение 15 мин СПА=5,08±0,05 (p>0,05), 30 мин - 5,02±0,05 (p>0,05). Влияние ЭМИ на частоте МСПИ O2 на развитие популяции P. aeruginosa оказалось стимулирующим при воздействии в lag-фазу роста: через 8 ч ОП бульонной культуры контрольного штамма составила 0,44±0,03, а у варианта, облученного на 6 часу культивирования в течение 15 мин - 0,59±0,03 (p<0,05), 30 мин - 0,68±0,05 (p<0,05). Значение ОП культур, облученных на 12 часу при 15 мин воздействия ЭМИ, достигло 1, 16 ±0,0 8 (p>0,05), при облучении в течение 30 мин - 1,18±0,07 (p>0,05); соответствующий показатель в контрольном варианте составлял 1,14±0,07. Через 24 ч значение ОП у вариантов, облученных через 6 ч после посева в течение 15 мин, составило 2,53±0,09 (p<0,05), в течение 30 мин - 2,62±0,1 (p<0,05), что существенно превышало показатель контроля (1,95±0,08). ОП культур, подвергнутых воздействию ЭМИ через 12 ч после посева суточных культур, не отличалась от таковой в контроле (1,98±0,08) и составила: при 15 мин экспозиции - 2,1±0,08 (p>0,05), 30 мин - 2,15±0,09 (p>0,05). Облучение бактериальной культуры ЭМИ на частоте МСПИ NO на развитие популяции не влияло. Так, показатели оптической плотности бактерий, облученных в течение 15 и 30 мин на 6 часу культивирования, составили 0,46±0,01 (p>0,05) и 0,47±0,01 (p>0,05), соответственно, и от контрольных значений (0,44±0,03) не отличались. Подобные результаты были получены и при облучении на 12 часу культивирования: оптическая плотность культур, облученных в течение 15 мин, составила 1,17±0,06 (p>0,05), а в течение 30 мин - 1,18±0,09 (p>0,05), при значении в контроле 1,14±0,07. При изучении биопленкообразования облучение псевдомонад проводили через 6 и 12 ч с момента внесения инокулята в лунки планшета. Экспозиция облучения составляла 15 и 30 мин. ОП биопленок при облучении культуры ЭМИ на частоте МСПИ O2 достоверно увеличивалась при 30 мин экспозиции: на 6 часу - в 1,26 раза; на 12 часу - в 1,31 раза. При облучении ЭМИ на частоте МСПИ NO через 6 ч с момента внесения инокулята интенсивность образования биопленок по сравнению с необлученной культурой достоверно уменьшилась при 30 мин экспозиции в 1,25 раза. Воздействие на 6 часу культивирования ЭМИ на частоте МСПИ NO в течение 15 мин на процесс пленкообразования практически не влияло. При воздействии ЭМИ на частоте МСПИ NO на 12 часу культивирования ОП биопленок достоверно уменьшалась при 15 и 30 мин облучения: в 1,28 и в 1,67 раза, соответственно. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии ЭМИ на частоте МСПИ O2 длительностью 15 и 30 мин на адгезивную активность, формирование биопленок P. aeruginosa, а также развитие популяции при воздействии в логарифмическую фазу роста. Это можно объяснить активацией образования в клетке под действием ЭМИ на частоте МСПИ O2 собственных реактивных форм кислорода (помимо активации O2, содержащегося в питательной среде), существенно ускоряющих процессы метаболизма, рост и деление клеток. Облучение культуры бактерий P. aeruginosa ЭМИ на частоте МСПИ NO приводит к снижению интенсивности пленкообразования. Это согласуется с данными работ, в которых показано, что сигналом для перехода от биопленки к планктонной форме служит образование NO, который в сублетальных концентрациях индуцирует дисперсию биопленок [7]. Гидрофобные взаимодействия между молекулами, как наиболее сильные из нековалентных, являются определяющими в адгезии бактерий к поверхности. Именно поэтому можно предположить, что облучение ЭМИ на частотах МСПИ O2 приведет к изменению уровня гидро-фобности клеток, что, в свою очередь, вызовет изменение адгезивных свойств бактерий. В заключение следует подчеркнуть, что облучение P. aeruginosa ЭМИ на частоте МСПИ O2 повышает адгезивные свойства бактериальных клеток, ускоряет пленкообразование и развитие популяции, в то время как облучение культуры ЭМИ на частоте МСПИ NO снижает и адгезию, и образование биопленок, но не влияет на рост бактерий.

About the authors

E. A Pronina

Saratov State University

Saratov, Russia

I. G Shvidenko

Saratov State University

Saratov, Russia

G. M Shub

Saratov State University

Saratov, Russia

O. G Shapoval

Saratov State University

Saratov, Russia

References

Supplementary files