ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТАХ МОЛЕКУЛЯРНОГО СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА НА АДГЕЗИЮ И ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Полный текст

Микроорганизмы образуют на объектах окружающей среды, в том числе медицинском оборудовании, и тканях макроорганизма биологические пленки - многоуровневые структуры, поддерживаемые организованной бактериальной массой за счет сложной системы межклеточных взаимодействий, объединенных в понятие Quorum Sensing [6]. Пусковым механизмом формирования биопленок является процесс адгезии, особенно специфической, обусловленной наличием на клетках макроорганизма рецепторов к бактериальным адгезинам. Объединение бактерий в биопленки повышает их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, в том числе к действию специфических и неспецифических механизмов противомикробной резистентности и антимикробных препаратов [1]. Именно поэтому поиск путей предотвращения формирования биопленок и их дезинтеграции является актуальной задачей. Не исключено, что одним их предполагаемых способов подобного влияния может быть применение ЭМИ, механизмы действия которого интенсивно исследуются в настоящее время. Возможно его влияние на индукцию реактивных форм кислорода, генерируемых как бактериальными клетками, так и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [3]. Исходя из этого цель настоящей работы - оценка влияния ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO на адгезию, развитие популяции и образование биопленок Pseudomonas aeruginosa. Использован клинический штамм P. aeruginosa 123. Адгезивную активность штамма до и после воздействия ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO оценивали по способности бактериальных клеток адсорбироваться на поверхности эритроцитов человека 0(I) группы, рассчитывая средний показатель адгезии (СПА). При СПА=1,01-2,0 бактерии считали низкоадгезивными, при СПА=2,01-4,0 - среднеадгезивными и при СПА >4,0 - высокоадгезивными [4]. Для изучения влияния ЭМИ на частотах МСПИ О2 и МСПИ NO на динамику популяций штамма из суточной агаровой культуры готовили суспензию концентрацией 105 КОЕ/мл, по 0,1 мл которой засевали в 100 мл мясо-пептонного бульона в колбах Эрленмейера. На спектрофотометре СФ-26 при длине волны 560 нм определяли оптическую плотность (ОП) полученных взвесей. Посевы помещали в термостат при 37°С и выращивали в металлическом контейнере, экранировавшем бактериальные клетки от облучения. Для обеспечения одинаковых условий развития на протяжении 24 ч внутри контейнера и внутри рабочей камеры поддерживалась постоянная температура 37°С. Через 6 и 12 ч после посева одну из опытных колб извлекали из контейнера и в том же термостате подвергали облучению ЭМИ на частоте МСПИ О2 и МСПИ NO в течение 15 или 30 мин при плотности мощности 0,3 мВт/см2, после чего вновь помещали в контейнер и продолжали культивировать до конца суток. Измерение ОП всех исследуемых образцов проводили через 8, 14 и 24 ч после посева. Образование биопленок изучали по способности клеток P. aeruginosa адге-зировать на поверхности 96-луночного полистеролового планшета [7]. Источником ЭМИ был квазиоптический генератор, разработанный в ОАО «Центральный НИИ измерительной аппаратуры» (Саратов), в котором возбуждались электромагнитные колебания частотой 129 ГГц и 150 ГГц, имитирующие структуру молекулярного спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота [5]. Точное значение заданной частоты определяли в соответствии с международной базой данных молекулярных спектров высокого разрешения HITRAN с учетом поправок на атмосферное давление и температуру окружающей среды [2]. Бактерии P. aeruginosa 123 обладали высокой адгезивной активностью - СПА=5,32±0,06. При воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O2 в течение 15 мин этот показатель увеличился до 6,08±0,08 (p<0,05), в течение 30 мин - до 6,56 ±0,02 (p<0,05). Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO на адгезивную активность штамма P. aeruginosa не влияло: при облучении в течение 15 мин СПА=5,08±0,05 (p>0,05), 30 мин - 5,02±0,05 (p>0,05). Влияние ЭМИ на частоте МСПИ O2 на развитие популяции P. aeruginosa оказалось стимулирующим при воздействии в lag-фазу роста: через 8 ч ОП бульонной культуры контрольного штамма составила 0,44±0,03, а у варианта, облученного на 6 часу культивирования в течение 15 мин - 0,59±0,03 (p<0,05), 30 мин - 0,68±0,05 (p<0,05). Значение ОП культур, облученных на 12 часу при 15 мин воздействия ЭМИ, достигло 1, 16 ±0,0 8 (p>0,05), при облучении в течение 30 мин - 1,18±0,07 (p>0,05); соответствующий показатель в контрольном варианте составлял 1,14±0,07. Через 24 ч значение ОП у вариантов, облученных через 6 ч после посева в течение 15 мин, составило 2,53±0,09 (p<0,05), в течение 30 мин - 2,62±0,1 (p<0,05), что существенно превышало показатель контроля (1,95±0,08). ОП культур, подвергнутых воздействию ЭМИ через 12 ч после посева суточных культур, не отличалась от таковой в контроле (1,98±0,08) и составила: при 15 мин экспозиции - 2,1±0,08 (p>0,05), 30 мин - 2,15±0,09 (p>0,05). Облучение бактериальной культуры ЭМИ на частоте МСПИ NO на развитие популяции не влияло. Так, показатели оптической плотности бактерий, облученных в течение 15 и 30 мин на 6 часу культивирования, составили 0,46±0,01 (p>0,05) и 0,47±0,01 (p>0,05), соответственно, и от контрольных значений (0,44±0,03) не отличались. Подобные результаты были получены и при облучении на 12 часу культивирования: оптическая плотность культур, облученных в течение 15 мин, составила 1,17±0,06 (p>0,05), а в течение 30 мин - 1,18±0,09 (p>0,05), при значении в контроле 1,14±0,07. При изучении биопленкообразования облучение псевдомонад проводили через 6 и 12 ч с момента внесения инокулята в лунки планшета. Экспозиция облучения составляла 15 и 30 мин. ОП биопленок при облучении культуры ЭМИ на частоте МСПИ O2 достоверно увеличивалась при 30 мин экспозиции: на 6 часу - в 1,26 раза; на 12 часу - в 1,31 раза. При облучении ЭМИ на частоте МСПИ NO через 6 ч с момента внесения инокулята интенсивность образования биопленок по сравнению с необлученной культурой достоверно уменьшилась при 30 мин экспозиции в 1,25 раза. Воздействие на 6 часу культивирования ЭМИ на частоте МСПИ NO в течение 15 мин на процесс пленкообразования практически не влияло. При воздействии ЭМИ на частоте МСПИ NO на 12 часу культивирования ОП биопленок достоверно уменьшалась при 15 и 30 мин облучения: в 1,28 и в 1,67 раза, соответственно. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии ЭМИ на частоте МСПИ O2 длительностью 15 и 30 мин на адгезивную активность, формирование биопленок P. aeruginosa, а также развитие популяции при воздействии в логарифмическую фазу роста. Это можно объяснить активацией образования в клетке под действием ЭМИ на частоте МСПИ O2 собственных реактивных форм кислорода (помимо активации O2, содержащегося в питательной среде), существенно ускоряющих процессы метаболизма, рост и деление клеток. Облучение культуры бактерий P. aeruginosa ЭМИ на частоте МСПИ NO приводит к снижению интенсивности пленкообразования. Это согласуется с данными работ, в которых показано, что сигналом для перехода от биопленки к планктонной форме служит образование NO, который в сублетальных концентрациях индуцирует дисперсию биопленок [7]. Гидрофобные взаимодействия между молекулами, как наиболее сильные из нековалентных, являются определяющими в адгезии бактерий к поверхности. Именно поэтому можно предположить, что облучение ЭМИ на частотах МСПИ O2 приведет к изменению уровня гидро-фобности клеток, что, в свою очередь, вызовет изменение адгезивных свойств бактерий. В заключение следует подчеркнуть, что облучение P. aeruginosa ЭМИ на частоте МСПИ O2 повышает адгезивные свойства бактериальных клеток, ускоряет пленкообразование и развитие популяции, в то время как облучение культуры ЭМИ на частоте МСПИ NO снижает и адгезию, и образование биопленок, но не влияет на рост бактерий.

Об авторах

Е. А Пронина

Саратовский государственный университет

Саратов

И. Г Швиденко

Саратовский государственный университет

Саратов

Г. М Шуб

Саратовский государственный университет

Саратов

О. Г Шаповал

Саратовский государственный университет

Саратов

Список литературы

Дополнительные файлы