Virulence determinants and genotypes of Helicobacter pylori clinical isolates

Full Text

Введение

Helicobacter pylori — микроаэрофильные грамотрицательные бактерии спиралевидной формы, которые являются основными возбудителями гастродуоденальных заболеваний человека (хронический гастрит, пептическая язва, аденокарцинома, лимфома желудка). Развитие и степень тяжести поражений у инфицированных лиц зависят от вирулентности штаммов H. pylori, факторов окружающей среды и восприимчивости организма-хозяина [1].

Многочисленные факторы вирулентности обеспечивают адаптацию H. pylori к агрессивным условиям среды обитания, способствуя выживанию и размножению в организме хозяина. Описаны гены, ассоциированные с вирулентностью H. pylori, которые играют ключевую роль в развитии инфекционного процесса [1, 2].

Основной детерминантой вирулентности H. pylori является остров патогенности cagPAI (Cytotoxin-associated Antigen Pathogenesis Island) — протяжённый участок генома (40 kb), включающий семейство генов cag (более 30). Гены cagPAI кодируют белки системы секреции IV типа, которые обеспечивают транспорт иммуногенного белка CagA в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию протеинкиназами. Это приводит к морфологическим изменениям эпителиальных клеток, стимулируя развитие таких патологических процессов, как язвообразование и рак желудка [2]. Ген cagA является маркером присутствия cagPAI и обнаружен в геноме 25–99% штаммов H. pylori в зависимости от их географического происхождения [3].

Полагают, что ген iceA (Induced by Contact with Epithelium) также может служить «маркером» патогенности H. pylori. Ген iceA имеет 2 аллельных варианта: iceA1 и iceA2. Экспрессия гена iceA активируется при контакте H. pylori с эпителиоцитами человека. По данным ряда авторов, генотип iceA1 стимулирует адгезию к эпителиальным клеткам желудка и связан с повышенным уровнем индукции интерлейкина-8, стимулируя развитие язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБДК) [4].

Ген vacA (Vacuolating-Associated Cytotoxin) присутствует в геноме всех штаммов H. pylori и кодирует цитотоксин (~140 кД), индуцирующий вакуолизацию эпителиальных клеток желудка, что в конечном счёте приводит к их апоптозу [5]. Установлено, что цитотоксичность белка связана с мозаичностью структуры гена vacA (s-, m-, i-регионы) [6]. Рядом зарубежных авторов выявлена зависимость между генотипом и вирулентностью возбудителя: штаммы H. pylori генотипа s1/m1 обладают наибольшей цитотоксической активностью белка — продукта vacA — по сравнению со штаммами генотипа s2/m2, а коэкспрессия генов cagA и vacA генотипа s1/m1 способствует прогрессированию язвенной болезни и карциномы желудка [7]. В российской литературе имеется ограниченное число публикаций, посвящённых изучению генетического разнообразия H. pylori в России.

Целью настоящего исследования являлось выявление детерминант вирулентности и сравнительный анализ генотипов H. pylori у пациентов с хроническим гастритом (ХГ) и ЯБДК.

Материалы и методы

Изучены 53 штамма H. pylori, выделенные от 34 взрослых пациентов с ХГ и 19 пациентов с ЯБДК за 2014–2019 гг. в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Исследуемая группа включала 28 (52,8%) женщин и 25 (47,2%) мужчин в возрасте 17–88 лет (средний возраст 44 года). Исследование одобрено независимым локальным этическим комитетом СПбНИИЭМ им. Пастера (протокол № 50/04-2019 от 22.06.2020).

Бактериологическому исследованию подлежали биоптаты слизистой оболочки антрального отдела желудка, которые были взяты во время эндоскопии в асептических условиях. Биопсийный материал помещали в пробирку типа «эппендорф» с тиоглеколевой средой для контроля стерильности. Культивирование H. pylori осуществляли на селективной среде на основе Колумбийского агара (с добавлением 5–7% дефибринированной лошадиной крови и 1% раствора IsoVitalex) при 37ºС. Посевы инкубировали в микроаэрофильных условиях (содержание кислорода ~5%) с использованием анаэростатов системы «GasPak 100». Для создания микроаэробной атмосферы использовали газогенерирующие пакеты. Видимый рост культур бактерий наблюдали в течение 5–7 дней. Для первичной идентификации мазки культур окрашивали по Граму. Видовую идентификацию клинических изолятов проводили с использованием биохимических тестов (уреазный, каталазный, оксидазный). При положительном результате 3 тестов культуру идентифицировали как H. pylori.

Хромосомную ДНК из чистых культур H. pylori выделяли с помощью набора «Хеликопол II» (НПФ «Литех») и использовали для постановки ПЦР с целью детекции гена cagA и типирования генов vacA и iceA. Амплификацию осуществляли в термоциклере «Bio-Rad С1000 Thermal Cycler» («Bio-Rad»). Нуклеотидные последовательности праймеров, температура отжига и характеристика продуктов амплификации приведены в табл. 1. Условия проведения ПЦР: 95°С — 3 мин; 35 циклов: 94°С — 35 с, температура отжига — 35 с, 72°С — 45 с; 72°С — 5 мин. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Длину продуктов амплификации определяли с использованием маркеров молекулярной массы 50 bp и 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис»). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» («BioRad»).

 

Таблица 1. Праймеры, используемые для ПЦР-детекции гена cagA и типирования генов iceA и vacA / Table 1. Oligonucleotide primers used in PCR detection of cagA gene and typing iceA и vacA genes

Гены Genes	Наименование праймеров Primer designation	Последовательности праймеров Primer sequence	Температура отжига праймеров, °С Annealing temperature, °C	Длина ПЦР продукта, п.н. Size and location of PCR product, bp	Ссылка Reference
iceA1	iceA1F iceA1R	GTGTTTTTAACCAAAGTATC CTATAGCCACTYTCTTTGCA	43	247	[10]
iceA2	iceA2F iceA2R	GTTGGGTATATCACAATTTAT TTRCCCTATTTTCTAGTAGGT	45	229/334	[10]
cagA	CagA_F CagA_R	GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA	56	349	[8]
vacA s1/s2	VAI-F VAI-R	ATGGAAATACAACAAACACAC CTGCTTGAATGCGCCAAAC	53	259/286	[6]
vacA m1/m2	VAG-F VAG-R	CAATCTGTCCAATCAAGCGAG GCGTCAAAATAATTCCAAGG	52	570/645	[9]

 

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ «SPSS Statistics v. 12» («StatSoft Inc.») и ресур- са «Медицинская статистика»¹, вычисляя значения критерия χ² Пирсона и отношения шансов (ОШ) с помощью четырехпольных таблиц. Различия между группами считали статистически значимыми при 95% доверительном интервале (ДИ) и p < 0,05.

Результаты

В результате культивирования образцов исследуемого материала на селективной среде в течение 7 дней при 37ºС в микроаэрофильных условиях был получен видимый рост гладких, круглых, прозрач-

ных колоний бактерий. При окраске по Граму обнаружены грамотрицательные палочки изогнутой формы. Положительные результаты биохимических тестов (каталаза/уреаза/цитохромоксидаза) позволили отнести 53 культуры бактерий к виду H. pylori.

Исследование образцов ДНК выявило неоднородность штаммов H. pylori данной выборки. Присутствие гена cagA, а также распределение аллельных вариантов генов iceA и vacA у клинических изолятов H. pylori, полученных от двух групп больных, представлено в табл. 2. Ген cagA был обнаружен у 64,1% (34 из 53) клинических изолятов. Анализ распределения cagA-позитивных штаммов H. pylori не выявил статистически значимых различий между группами пациентов с ХГ и ЯБДК (ОШ 2,96 [0, 81–10, 80]; р > 0,05).

 

Таблица 2. Генотипы штаммов H. pylori при различных формах инфекции / Table 2. H. pylori genotypes distribution in patients with different forms of infection

Гены и генотипы Genes and genotypes	ХГ, n (%) | CG, n (%) (n = 34)	ЯБДК, n (%) | DU, n (%) (n = 19)	χ2	р	ОШ | OR	95% ДИ | 95% CI
cagA +	19 (55,8)	15 (78,9)	2,82	0,09	2,96	0,81–10,80
iceA1	12 (35,3)	9 (47,4)	0,74	0,39	1,65	0,52–5,17
iceA2	16 (47,1)	7 (36,8)	0,52	0,47	0,66	0,21–2,07
iceA1A2	6 (17,6)	3 (15,8)	0,04*	0,83	0,87	0,19–3,99
vacAs1	24 (70,6)	18 (94,7)	4,32	0,04	7,50	0,88–64,04
vacAs2	10 (29,4)	1 (5,3)	4,32	0,04	0,13	0,02–1,14
vacAm1	17 (50,0)	8 (42,1)	0,30	0,58	0,73	0,23–2,26
vacAm2	17 (50,0)	11 (57,9)	0,30	0,58	1,38	0,44–4,27
vacA s1/m1	17 (50,0)	8 (42,1)	0,30	0,58	0,73	0,23–2,26
vacA s1/m2	7 (20,6)	10 (52,6)	5,74	0,02	4,29	1,26–14,60
vacA s2/m2	10 (29,4)	1 (5,3)	4,32	0,04	0,13	0,02–1,14

Примечание. *С учётом поправки Йейтса.

Note. *With the Yates's correction.

 

Гены iceA и vасА в различных аллельных вариантах выявлены у всех штаммов H. pylori (табл. 2). Доли аллельных вариантов iceA1 и iceA2 штаммов H. pylori различались у пациентов с ХГ и ЯБДК: аллельный вариант iceA1 штаммов H. pylori преобладал у пациентов с ЯБДК (47,4%), тогда как iceA2 — у пациентов с ХГ (47,1%). Однако данное различие было статистически не значимо (р > 0,05). В 9 (17%) случаях обнаружены смешанные варианты гена iceA штаммов возбудителя, которые характеризовались присутствием как A1, так и A2 аллелей.

Среди аллелей гена vacA штаммов H. pylori доминировал s1 (79,2%). Как видно из табл. 2, доли аллеля vacAs1 существенно различались у штаммов, выделенных от больных ХГ и ЯБДК: 70,6 и 94,7% соответственно (критерий χ² 4,32 превышал критическое значение 3,84; уровень значимости данной связи р < 0,05). Напротив, аллель vacAs2 H. pylori преобладал в группе больных ХГ (р = 0,04). Существенной разницы в распределении вариантов m1 и m2 гена vacA H. pylori между группами пациентов не выявлено (р = 0,58).

Аллельные варианты s и m гена vacA группировались в три генотипа: s1/m1, s1/m2 и s2/m2. Редкий генотип vacA s2/m1 в нашем исследовании не обнаружен. Все штаммы аллеля vacAs2 являлись носителями аллеля m2 в обеих группах пациентов, однако статистически значимо были ассоциированы с ХГ (р = 0,04; табл. 2). Доля штаммов H. pylori генотипа s1/m2 у пациентов с ЯБДК (52,6%) значимо превышала таковую у пациентов с ХГ (20,6%); р = 0,02. Наблюдаемая зависимость являлась статистически значимой (ОШ = 4,29 [1, 26–14, 60]; p < 0,05).

Анализ сочетаний генов vacA, cagA и iceA позволил выявить взаимосвязь между статусом cagA+ и аллельным вариантом s1 гена vacA у клинических изолятов H. pylori: все cagA-позитивные штаммы являлись носителями аллеля vacAs1, тогда как ни один штамм аллеля s2 cagA-позитивным не был (табл. 3). При этом доля штаммов генотипа cagA+/vacAs1 H. pylori у больных ЯБДК составляла 78,9% (15 из 19) против 55,9% (19 из 34) у больных ХГ (p = 0,09). Подавляющее большинство штаммов (10 из 11) генотипа cagA–/vacAs2 выделены от больных ХГ.

 

Таблица 3. Аллельные варианты генов vacA и iceA у cagA+ и cagA– штаммов H. pylori, n / Table 3. Allelic variants of the vacA and iceA genes in cagA+ and cagA– H. pylori strains, n

Генотипы Genotypes	cagA+ (n = 34)	cagA– (n = 19)
vacAs1	34	8
vacAs2	–	11
vacAm1	20	5
vacAm2	14	14
vacA s1/m1	20	5
vacA s1/m2	14	3
vacA s2/m2	–	11
iceA1	14	7
iceA2	14	9
ice A1A2	6	3

 

Ассоциации генотипов iceA1 и iceA2 с присутствием гена cagA и/или аллельными вариантами гена vacA не выявлено (табл. 3).

Суммарные результаты генотипирования по трем детерминантам вирулентности cagA, iceA и vacA в настоящем исследовании позволили выявить 14 вариантов профилей (комбинированных генотипов) у 53 штаммов H. pylori (табл. 4). Среди вариантов превалировали генотипы cagA+/iceA2/vacAs1/m1 и cagA+/iceA1/vacAs1/m1, которые объединяли 9 (17%) и 8 (15%) штаммов соответственно. Остальные генотипы были представлены группами от 1 до 6 штаммов. Таким образом, явно доминирующего комбинированного генотипа в нашем исследовании не выявлено.

 

Таблица 4. Комбинированные генотипы штаммов H. pylori при различных формах инфекции, n (%) / Table 4. Combined genotypes of H. pylori strains in different forms of infection, n (%)

Комбинированные генотипы H. pylori Combined genotypes	ХГ | CG (n = 34)	ЯБДК | DU (n = 19)	Всего | Total (n = 53)
cagA–/iceA1/vacA s1/m1	1 (2,9)	–	1 (1,9)
cagA–/iceA1/vacA s1/m2	–	1 (5,3)	1 (1,9)
cagA–/iceA1/vacA s2/m2	4 (11,8)	1 (5,3)	5 (9,4)
cagA–/iceA1A2/vacA s1/m1	2 (5,9)	–	2 (3,8)
cagA–/iceA1A2/vacA s2/m2	1 (2,9)	–	1 (1,9)
cagA–/iceA2/vacA s1/m1	1 (2,9)	1 (5,3)	2 (3,8)
cagA–/iceA2/vacA s1/m2	1 (2,9)	1 (5,3)	2 (3,8)
cagA–/iceA2/vacA s2/m2	5 (14,7)	–	5 (9,4)
cagA+/iceA1/vacA s1/m1	5 (14,7)	3 (15,8)	8 (15,1)
cagA+/iceA1/vacA s1/m2	2 (5,9)	4 (21,1)	6 (11,3)
cagA+/iceA1A2/vacA s1/m1	3 (8,8)	–	3 (5,7)
cagA+/iceA1A2/vacA s1/m2	–	3 (15,8)	3 (5,7)
cagA+/iceA2/vacA s1/m1	5 (14,7)	4 (21,1)	9 (16,9)
cagA+/iceA2/vacA s1/m2	4 (11,8)	1 (5,3)	5 (9,4)

 

Обсуждение

Ген cagA, являясь наиболее информативной детерминантой вирулентности, широко используется для генотипирования H. pylori. Гетерогенность клинических изолятов H. pylori в разных странах обусловлена этническими, социоэкономическими и экологическими особенностями. Так, многочисленные исследования, проведённые в странах Европы и США, показали, что CagA-продуцирующие штаммы H. pylori более вирулентны, нежели CagA-негативные, и вызывают тяжёлые поражения желудочно-кишечного тракта человека: от больных с пептической язвой и раком желудка cagA-позитивные штаммы выделяли в 80–100% случаев [11, 12]. Известно, что практически все штаммы восточноазиатской популяции являются носителями гена cagA независимо от степени тяжести инфекционного процесса [13, 14].

В российской литературе имеется ограниченное число публикаций, посвящённых генетическому разнообразию H. pylori, причём сведения о роли различных генотипов в развитии гастродуоденальной патологии противоречивы. Согласно результатам исследований, проведённых в Москве [15], ген cagA был обнаружен у 100% клинических изолятов H. pylori, тогда как в Ярославле — территориально близком городе — доля cagA+ штаммов составляла лишь 43% [16]. В городах южного региона — Астрахани и Ростове — cagA+ штаммы выявлены в 71 и 81% случаев соответственно [17, 18]. В нашем исследовании ген вирулентности cagA был обнаружен у 64,1% клинических изолятов. Несмотря на преобладание штаммов cagA+ у больных ЯБДК (78,9% против 55,8% с ХГ), статистически значимых различий между группами пациентов не выявлено. Полученные результаты указывают на роль белка CagA как фактора вирулентности возбудителя, однако вместе с тем свидетельствуют о необходимости проведения масштабной оценки перспективности гена cagA в качестве генетического маркера тяжести поражений при инфекции H. pylori.

Роль гена iceA H. pylori в развитии гастродуоденальной инфекции до сих пор не определена, а данные, полученные в разных странах, противоречивы. Принято считать, что генотип iceA1 является «маркером» язвенного поражения гастродуоденальной системы. Исследования, проведённые в Нидерландах [10], Египте [19] и Китае [20], демонстрируют связь генотипа iceA1 H. pylori не только с язвенной болезнью, но и раком желудка. Однако в ряде других исследований (США, Колумбия, Япония, Корея, Болгария, Таиланд, Португалия) сообщается об отсутствии ассоциации iceA1 с тяжестью клинических проявлений инфекции H. pylori [9, 12, 13, 20, 22]. В разных регионах России выявляют в среднем от 46% (Москва) до 60% (Казань, Ростов-на-Дону) штаммов H. pylori генотипа iceA1 [15, 17, 23]. Ряд авторов указывают на характерный для российских регионов высокий уровень встречаемости смешанных генотипов iceA1A2 (20–40%), что может свидетельствовать о присутствии в организме человека нескольких штаммов микроорганизма. Более того, К. Momynaliev и соавт. сообщают об отсутствии выявляемости генотипа iceA2 у клинических изолятов H. pylori (только в составе смешанного генотипа iceA1A2) [24].

Несмотря на то что в нашем исследовании генотип iceA1 штаммов H. pylori преобладал у пациентов с ЯБДК (47,4%), а генотип iceA2 — у пациентов с ХГ (47,1%), статистически значимой разницы между группами не выявлено. Возможно, одной из причин являлось наличие смешанных вариантов iceA1A2 (17%), которые могут скрывать потенциальную связь между генотипами iceA возбудителя и клиническими проявлениями инфекции H. pylori. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о нецелесообразности использования аллелей гена iceA в качестве генетических маркеров тяжести инфекции H. pylori.

Разнообразие аллельных вариантов s- и m-областей гена vacA обусловливает разную степень цитотоксической активности кодируемого ими белка, которая определяет тяжесть поражений при инфекции H. pylori [5, 6].

В нашем исследовании среди аллелей гена vacA штаммов H. pylori доминировал s1 (79,2%), что согласуется с результатами исследований, проведённых в Москве, Ростове-на-Дону, Казани [15, 17, 23]. Нами также установлено, что штаммы H. pylori генотипа vacAs1 статистически значимо ассоциированы с ЯБДК (лишь 1 из 19 штаммов относился к альтернативному аллелю vacAs2). Таким образом, тяжесть поражения зависела от присутствия аллеля vacAs1.

Вопреки распространённому мнению о роли генотипа vacA s1/m1 H. pylori в развитии язвенной болезни, в нашем исследовании значимых различий в распределении штаммов данного генотипа возбудителя между группами пациентов не выявлено. Напротив, доля штаммов H. pylori генотипа s1/m2 у пациентов с ЯБДК значимо превышала таковую у пациентов с ХГ (р = 0,02). Таким образом, штаммы H. pylori генотипа s1/m2 достоверно чаще встречаются в группе ЯБДК. Полученные данные согласуются с исследованиями в Китае [20], Иране [25], Тунисе [26], Бразилии [27], Тайване [28] и Турции [29]. Генотип vacA s2/m2 H. pylori встречался преимущественно у больных ХГ (p = 0,04), что не противоречит общепринятому мнению об отсутствии цитотоксической активности штаммов H. pylori генотипа s2/m2.

Анализ комбинированных генов vacA, cagA и iceA позволил выявить взаимосвязь между статусом cagA+ и аллельным вариантом s1 гена vacA. Кроме того, доля штаммов генотипа cagA+/vacAs1 H. pylori у больных ЯБДК составляла 78,9%, тогда как подавляющее большинство штаммов (90,9%) генотипа cagA–/vacAs2 были выделены от больных ХГ. Полученные данные согласуются с представлением об ассоциации генотипа cagA+/vacAs1 штаммов с риском развития язвенной болезни, тогда как штаммы cagA–/vacAs2 считаются менее вирулентными и редко связаны с прогрессирующим течением инфекции H. pylori [10, 11, 22, 30].

Заключение

Анализ генетического полиморфизма клинических штаммов H. pylori выявил неоднородность популяции возбудителя хеликобактериоза в Санкт-Петербурге. Показано, что частота встречаемости генов cagA, iceA и vacA, а также их комбинированных генотипов различается у штаммов H. pylori, выделенных от больных ХГ и ЯБДК. Установлена статистически значимая ассоциация аллельных вариантов vacAs1 и vacAs2, а также генотипов vacA s1/m2 и vacA s2/m2 возбудителя с клиническими проявлениями инфекции H. pylori. Генотипы vacAs1 и vacA s1/m2 возбудителя ассоциированы с ЯБДК. Полученные результаты вносят существенный вклад в характеристику глобальной популяции данного возбудителя, а также свидетельствуют о необходимости поиска надёжных генетических маркеров клинических проявлений инфекции H. pylori.

 

¹ URL: https://medstatistic.ru/calculators.html

About the authors

Alena V. Svarval

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: dariastarkova13@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9340-4132

Cand. Sci. (Med.), Head, Department for identification of pathogens

Россия, St. Petersburg

Daria A. Starkova

St. Petersburg Pasteur Institute

Author for correspondence.
Email: dariastarkova13@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3199-8689

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department for identification of pathogens, Department of molecular epidemiology and evolutionary genetics

Россия, St. Petersburg

Raisa S. Ferman

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: dariastarkova13@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7661-3725

researcher, Department for identification of pathogens

Россия, St. Petersburg

References

Supplementary files