DEVELOPMENT OF STREPTOCOCCUS PYOGENES CELLS INACTIVATION FOR TURBI-DIMETRIC DETERMINATION OF BACTERIOLYTIC ACTIVITY OF PHAGE-ASSOCIATED ENZYME

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Противомикробное действие бакте-риолитических ферментов или, как принято говорить в последние годы, фаг-ассоциированных пептидогликанлизи-рующих ферментов (ПЛФ), или энзи-биотиков, может, по-видимому, быть использовано в качестве одного из новых способов профилактики и лечения заболеваний инфекционной природы, вызванных грамположительными бактериями и, в частности, стрептококками [1, 3]. Привлекательность использования ПЛФ связана с тем, что мишенью их действия является пептидогликан - биополимер, содержащийся только в клеточных стенках бактерий, причем в отличие от Р-лак-тамных антибиотиков, блокирующих синтез пептидогликана и, следовательно, действующих только на растущие клетки, ПЛФ гидролизуют непосредственно пептидогликан, что приводит к гибели клеток грамположительных бактерий в результате осмотического лизиса. Фаг-ассоции-рованные ПЛФ, как правило, родо- или видоспецифичны, что может позволить при их использовании сохранять полезную микрофлору в биотопах, подвергаемых действию препаратов [1, 6]. В данной работе испытания ПЛФ проводили на клетках Streptococcus pyogenes, относящихся к группе А, которые являются возбудителями большой группы инфекционных заболеваний, характеризующихся поражением верхних дыхательных путей, кожных покровов, развитием постстрептококковых аутоиммунных и токсико- септических осложнений у человека [4]. Создание лекарственных препаратов на основе ПЛФ включает их испытание на тест-культурах. Цель - разработка метода инактивации S. pyogenes, не нарушающего целостность поверхностной структуры клеток и, как следствие, не искажающего кинетику их лизиса в сравнении с исходными живыми культурами, обеспечивающего оптимальную воспроизводимость результатов испытаний активности фаг-ассоциированных ферментов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве тест-культур использовали 3 штамма гемолитического стрептококка группы А: S. pyogenes M29, штамм D-28/11 N 62/59 (Пражская коллекция); S. pyogenes T1, штамм 1295 (коллекция НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи); S. pyogenes T5, штамм 12344 (коллекция ATCC). Ампульные культуры, предварительно пассированные по Беккеру и хранившиеся при -20°С, адаптировали к жидкой питательной среде. В качестве посевного материала использовали суточную культуру, которую вносили в количестве 0,5% или 1% при посеве на бульон Todd-Hewitt. Культуру бактерий выращивали при 37°С, затем осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 5 - 25 мин (в зависимости от возраста культуры), отмывали дважды стерильным забуференным фи-зиологичеким раствором (ЗФР) или 20 iM фосфатным буферным раствором (pH 6,3). Для инактивации клеток стрептококков выбрали 3 способа их обработки: инкубациию с хлороформом, различные режимы термического воздействия, использование антибиотиков. Хлороформ добавляли к отмытым от питательной среды клеткам стрептококка (5% v/v). После перемешивания на вортексе клетки с хлороформом выдерживали 3 ч в термостате при 37°С, затем хлороформ декантировали и отмывали клетки 20 мM фосфатным буферным раствором (pH 6,3). Термическую обработку проводили нагреванием культуры клеток в жидкой питательной среде или суспензии клеток в 0,1 M фосфатном буферном растворе, содержащем 0,9% NaCl, pH 7,2 на водяной бане при температуре 80°С в течение 60 мин или на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Антибиотики вносили в среду при выращивании стрептококков, а также инкубировали с антибиотиками клетки. отмытые от питательной среды. Рифампицин (150 мг порошка в ампуле) смешивали с 15 мл 0,1 M фосфатного буферного раствора, содержащего 0,9% NaCl, (pH 7,2). Раствор хранили в холодильнике. Препарат гентамицина - стерильный водный раствор, содержащий 40 мг/мл антибиотика. Гентамицин добавляли к отмытой культуре стрептококков из расчета его минимальной бактерицидной концентрации (МБК), определенной в предварительном опыте для данной культуры: 6,25 мкг/мл взвеси стрептококков, содержащих 109 микробных тел в 1 мл. Культуру с гентамицином выдерживали 30 мин в термостате при 37°С, осаждали центрифугированием и отмывали стерильным буферным раствором. Рабочие растворы для рифампицина и ампициллина готовили в концентрации 1 мг/ мл. При двуступенчатой обработке антибиотиками в колбу с 15 - 18-часовой культурой стрептококка (концентрация 10 - 30х105 КОЕ/мл), находящейся в термостате при 37°С, вносили гентамицин или рифампицин в концентрации, равной или несколько превышающей МБК. После инкубации в течение 1,5 ч в эту же колбу вносили рабочий раствор ампициллина до конечной концентрации, рассчитанной на основании МПК и МБК. Культуру стрептококков выращивали в колбе на жидкой питательной среде, из которой брали пробы для проверки на отсутствие роста бактерий через 24 и 48 ч при 37°С. После окончания инкубации клетки стрептококков осаждали центрифугированием и отмывали от питательной среды и антибиотиков фосфатным буферным раствором. Ресуспендирование проводили в том же буферном растворе, который использовали при проверке литической активности фермента, создавая при этом оптимальную для начала фотометрической регистрации (А=0,3-0,6 при 650 нм) концентрацию клеток. Разлитые на аликвоты пробы, предварительно стабилизированные добавлением 10% раствора сахарозы в том же буферном растворе до конечной концентрации 2 - 3%, лиофильно высушивали. Рекомбинантный и фаг-ассоции-рованные препараты фермента PlyC были предоставлены компанией New Horizons Diagnostics (США): E1 и Е2 - выделенные из фага С1, Е3 - рекомбинантный фермент, полученный клонированием ДНК фага С1. Препараты фермента, разведенного в 1,5 мл 20 iM фосфатного буферного раствора с pH 6,3, добавляли к 1,5 мл суспензии клеток стрептококков (А=0,3 - 0,6 при 650 нм), помещенных в термостатированные кюветы спектрофотометра «Perkin-Elmer» (США). Следует отметить, что субстратом для препаратов фермента служит компонент клеточной стенки стрептококка - пептидогликан, концентрацию которого спектрофотометрически определить невозможно. В связи с этим, концентрацию субстрата выражали в единицах поглощения, характеризующих мутность суспензий клеток, а скорость реакции определяли как изменение оптической плотности в единицу времени и выражали в ед. погл./мин. Оценивали скорость и характер снижения оптической плотности суспензии клеток стрептококка. Из прямолинейных начальных участков кинетических кривых в координатах оптическая плотность (А) - время (t) определяли скорость реакций (по тангенсу угла наклона начального участка), которые характеризовали каталитическую активность препаратов фермента. Эффективность действия PlyC тестировали также на культурах стрептококков, выращенных в жидкой питательной среде, с последующим высевом через кратные промежутки времени на твердую питательную среду, где проводили учет выросших, т.е. не лизированных ферментом бактерий. Параллельно проводили фотометрическое измерение лизиса тех же культур стрептококков. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Испытание литического действия фермента на S. pyogenes разного возраста выявило существенную зависимость его активности от возраста культуры. Литическая активность фермента при испытаниях на культурах ранней логарифмической фазы роста оказалась в несколько раз выше, чем на разных точках стационарной фазы роста (рис. 1). В опытах на живой культуре S. pyogenes при использовании бактериологического и спектрофотометрического методов время, необходимое для выхода кривой на горизонталь, приближающуюся к нулевой линии, соответствовало продолжительности инкубации той же культуры стрептококков с ферментом, необходимым для полного лизиса бактерий, когда при высеве на чашки Петри число выросших колоний равнялось нулю. Это позволило использовать автоматически воспроизводимые на спектрофотометре кинетические кривые процесса как для определения активности энзи-биотиков, так и в качестве контроля эффективности лизиса стрептококков. Для подбора безопасных условий ин- Рис. 1. Зависимость активности фермента (образец Е3) от возраста клеточной культуры М29. Рис. 2. А. Кривые лизиса живых (сплошная линия) и термически обработанных клеток М29 (пунктирная линия) образцом фермента Е2. Б. Зависимость мутности суспензии термически обработанных клеток стрептококка от времени: 1. Фоновый лизис; 2. Лизис при добавлении 0,1 мл образца фермента Е1 к 2 мл суспензии клеток; 3. Лизис при добавлении еще одной порции образца фермента Е1; 4. Лизис при добавлении еще одной порции клеточной суспензии. Аб50-значение мутности суспензии клеток при 650 нм. струментальной проверки активности ферментных препаратов на тест-культурах испытывали несколько способов воздействия на клетки стрептококков: термическую обработку, инкубацию с антибиотиками, инкубацию с хлороформом. Клетки, подвергшиеся термической обработке, существенно изменили свои свойства. Сравнение кинетических кривых лизиса стрептококков, убитых нагреванием, с кривыми лизиса живых культур одним и тем же препаратом фермента в одинаковых условиях, показало их значительные различия: уменьшение глубины лизиса и снижение выявляемой активности фермента (рис. 2, А). При этом полного лизиса, регистрируемого при использовании живых бактериальных клеток, не выявлено даже при введении новых порций фермента (рис. 2, Б-3). Отсутствие инактивации фаг-ассоцииро- Рис. 3. Лизис клеток М29 образцом фермента Е3, обработанных гентамицином (линия с квадратами) и без него (пунктирная линия). ванного фермента подтверждается возобновлением процесса при добавлении новой порции бактериальных клеток (рис. 2, Б-4). Сравнение кинетических кривых лизиса стрептококков, проинкубированных с гентамицином, с кривыми лизиса живых культур, полученных при действии одного и того же препарата фермента в одинаковых условиях, продемонстрировало фактическое отсутствие различий (рис. 3). Характер и эффективность лизиса клеток, проинкубированных с хлороформом или подвергнутых двуступенчатой обработке антибиотиками, в выбранных условиях эксперимента приближается к представленной кривой лизиса после инкубации с гентамицином. ОБСУЖДЕНИЕ Широкое применение в медицинской практике антибиотиков приводит к формированию возрастающего числа резистентных к ним штаммов возбудителей, угнетению иммунитета и возникновению дисбиотического состояния макроорганизма, что диктует необходимость поиска альтернативных средств защиты от инфекций. В связи с этим, создание лекарственных препаратов, действующим началом которых являются литические ферменты бактериофагов, проявляющие активность в отношении устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий [1, 6] и, в то же время, обладающие узким спектром специфичности, представляется перспективным направлением. ПЛФ PlyC по типу действия относят к амидазам (Nelson D. et al., 2006). Он способен эффективно лизировать стрептококки групп А, С и Е [4, 8]. Препараты ПЛФ PlyC, выделенные из фага С1 и полученные методами генной инженерии, предстояло испытывать на тест-культуре вирулентного штамма S. pyogenes. В связи с необходимостью исключить использование инфекционного материала в условиях химической лаборатории, была поставлена задача специальной подготовки тест-культуры стрептококка: бактерии должны потерять способность к росту и размножению, но пептидогли-кан клеточных стенок не должен быть разрушен. Использование методов тепловой обработки клеток приводило к значительному уменьшению глубины лизиса и снижению значения активности фермента. В то же время, результаты проведенных исследований показали, что инкубацию как с хлороформом, так и с препаратами антибиотиков можно применять для целей нашей работы. Поскольку в некоторых исследованиях наблюдали искажение активности энзибиотиков при их испытаниях на бактериальных клетках, обработанных хлороформом [1, 2], а также в связи с тем, что использование хлороформа связано с дополнительными требованиями при выполнении работ (усиленная вытяжная вентиляция), была выбрана инкубация с антибиотиками, предложенная сотрудниками НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Для оперативной и объективной количественной оценки активности ПЛФ применяли регистрацию изменений в оптической плотности суспензий клеток стрептококков за определенное время. Активность ПЛФ PlyC была в несколько раз выше при ее испытаниях на культурах S. pyogenes логарифмической фазы роста, поэтому в опытах использовали молодую культуру. Чтобы исключить возможность сохранения отдельных живых клеток стрептококков, способных к размножению, была предпринята двухступенчатая обработка культур антибиотиками с разным механизмом действия на бактериальную клетку. В качестве первого антибиотика использовали рифампицин или гентамицин, т.е. препараты, не нарушающие целостность клеточной стенки бактерий, а на втором этапе добавляли ампициллин, вызывающий полный лизис только растущих бактериальных клеток. При обработке клеток антибиотиками с разным механизмом действия, видимо, удается сохранить интактной клеточную стенку бактерий и, в то же время, более надежно обеспечить безопасность использования бактериальных клеток. Предлагаемый способ подготовки тест-культур стрептококков позволяет длительно хранить образцы и проводить исследования энзибиотиков в лабораториях химического профиля, не приспособленных для работы с вирулентными культурами бактерий. Клетки S. pyogenes, подготовленные по описанной методике, можно использовать для одновременного турбидиметрического определения активности энзибиотиков и эффективности лизиса стрептококков. Использование стандартных препаратов клеток стрептококков обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов испытаний активности препаратов ферментов, что позволяет объективно оценивать как методики их получения, так и способы стабилизации.

About the authors

N. F Dmitrieva

Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, Russia

N. L Klyachko

Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

V. M Bondarenko

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

N. A Shabanova

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. S Eschina

Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, Russia

L. Yu Filatova

Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

N. I Morozova

Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, Russia

Yu. M Timofeev

Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, Russia

A. V Kabanov

Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

N. I Briko

Sechenov First Moscow State Medical University

Moscow, Russia

References

Supplementary files