PLASMID DNA COPY NUMBER INCREASE AS A POSSIBLE MECHANISM OF ANTI-LYSOZYME FEATURE ENCHANTMENT OF BACTERIA UNDER THE INFLUENСЕ OF CHLORAMPHENICOL

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Начало изучения молекулярногенетических механизмов проблемы устойчивости бактерий к действию лизоцима датируется 2001 г., когда был выявлен первый специфичный белок-ингибитор лизоцима позвоночных, названный Ivy [8, 14]. К настоящему времени изучены механизмы лизоцимрезистентности, детерминируемые хромосомными генами: известно два семейства специфических и один неспецифический ингибитор лизоцима [10], выявлен механизм сочетанной индукции специфических ингибиторов обоих семейств специфических ингибиторов через бактериальную внутриклеточную регуляторную систему Res в ответ на пептидогликановый стресс независимо от его природы [11]. Вместе с тем, широкая вариабельность антилизоцимного признака среди различных штаммов внутри одного вида труднообъяснима только с позиций горизонтального переноса генов хромосомной локализации. С другой стороны, значительное увеличение антили-зоцимной активности под действием бактериостатического антибиотика хлорамфеникола [5] не очевидно и даже противоречиво с точки зрения регуляции на уровне фенотипа, если принять во внимание белковую природу фактора антилизоцимной активности [7]. В то же время, установлено, что хлорам-феникол, блокируя синтез белка, не только не оказывает прямого влияния на синтез нуклеиновых кислот [9], но и опосредованно вызывает некоторое усиление синтеза всех типов клеточной РНК [13], что, в свою очередь, может приводить к ослаблению блокирования инициации репликации плазмидной ДНК [15]. Также накоплены данные о наличии факторов антилизоцимной активности, кодируемых плазмидами и их сцепленности с генами множественной антибиотикорезистентности на примере бактерий родов Klebsiella [1, 2] и Bacillus [4]. В связи с этим, цель данного исследования - определение динамики числа копий плазмидной ДНК и антилизоцим-ной активности под воздействием хло-рамфеникола в клетках пары штаммов Е. coli 252 и 242, принадлежащих к одному биовару и отличающихся по антибиотикорезистентности, плазмидному профилю и уровню антилизоцимной активности, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для исследования послужил выделенный из кишечного биотопа человека штамм Е. coli 252, отобранный ранее при скрининговом выделении антибиотикорезистентных энтеробактерий по наличию антилизоцимной активности (более 1 мкг/млхОП). У данного штамма проведено определение биохимического профиля (биовара) с помощью тест-системы «ЭНТЕРО-тест 24» (PLIVA-LaChema, Чехия), профиля резистентности (рези-стовара) к 5 стандартно используемым антибиоткам для культивирования плазмидосодержащих штаммов (ампициллину, канамицину, стрептомицину, тетрациклину и хлорамфениколу) с определением минимальной подавляющей концентрации и установлено наличие двух плазмид длиной приблизительно 4,3 и 7 kb, названных pS252 и pL252, соответственно. В качестве контрольного штамма был использован также выделенный из кишечного биотопа человека штамм Е. coli 242, имеющий идентичный биохимический профиль, резистентность к 3 из 5 использованных антибиотиков (ампициллину, стрептомицину и хлорамфени-колу) и не содержащий плазмид, идентифицируемых стандартным методом щелочного выделения плазмидной ДНК и агарозного гель-электрофореза. Для изучения влияния хлорамфени-кола на число копий плазмидной ДНК исследуемого штамма был использован препарат (pharm. grade, Panreac, Испания) в концентрации 34 мг/мл в растворе в этиловом спирте [6], применявшийся в концентрациях 68, 204, 408 и 612 мкг/мл для Е. coli 252 и 34, 102, 204 и 306 мкг/мл - для Е. coli 242. Данные концентрации с учетом выявленного в процессе пилотных экспериментов инокулюм-эффекта (в виде шестикратного различия между исходно измеренной и действительной МПК хлорамфеникола) составили 0,17; 0,5; 1 и 1,5-кратные МПК для исследуемых штаммов Е. coli. Культивирование и инкубация в среде с хлорамфениколом исследуемого штамма проводили по методике неспецифической амплификации плазмидной ДНК в богатой среде с хлорамфениколом по Т. Маниатис и др. [6] с изменениями: объемы сред уменьшены на порядок, время первого культивирования сокращено до 2.5 ч. С целью предварительного нормирования итоговых значений микробного числа непосредственно перед внесением антибиотика в культуры добавляли стерильный бульон Лурия-Бертани (LB) в объемах, определенных эмпирически в пилотных экспериментах и составивших 3 и 1 мл для проб с 0,17- и 0,5-кратными МПК хлорамфеникола, соответственно. В качестве контроля использовали среду LB без добавления антибиотика в объеме 8.5 мл. После завершения инкубации проводили верификацию и заключительное нормирование бактериальных культур по плотности с применением абсорбционного спектрофотометра «ELx808-I (BioTek, США)» при 630 нм до концентрации 0,5х109 КОЕ/мл для дальнейших количественных анализов. Определение числа копий плазмид в клетках нормированных бактериальных культур исследуемого штамма Е. coli 252 проводили путем выделения плазмидной ДНК методом щелочного лизиса клеток из 2 мл культуры с последующей экстракцией пДНК с помощью наборов «GeneJET miniprep» (Fermentas, Евросоюз). Полученные растворы плазмидной ДНК подвергались электрофорезу в агарозном геле [13]. С этой целью 20 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК, смешивали с 5 мкл 10-кратного буфера для внесения и вносили в лунки 0,75% агарозного геля. Электрофорез проводили в ТВЕ-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида в качестве люминесцентного красителя при напряженности поля 5 В/см в течение 1,5 ч. Визуализацию результатов электрофоретического разделения нуклеиновых кислот проводили на установке гель-документирования «Vilber Lour-mat» (Франция). В качестве маркеров молекулярной массы и количества молекул нуклеиновых кислот использовали линейный маркер «1 kb» (OOO «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 0,75; 1 и 1,5 мкг. Количество молекул плазмид-ной ДНК оценивали путем сравнения интенсивности полос люминесценции маркерных и опытных проб ДНК с использованием программного обеспечения TotalLab 2.01 (Nonlinear Dynamics, Ltd, Великобритания). Для определения антилизоцимной активности также использовали 2 мл нормированных бактериальных культур, которые затем подвергали троекратному промыванию стерильным 0,9% раствором натрия хлорида от остатков среды с антибиотиком и дополнительной инкубации бактериальной массы в течение 2,5 ч в шейкер-инкубаторе «ES-20» при 37°С в 2 мл свежего LB-бульона. Анализ антилизоцимной активности полученных культур проводили фотометрическим методом по О.В. Бухарину и др. [3]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Исследование динамики накопления копий плазмид штамма Е. coli 252 (рис. 1) показало достоверное нарастание копий-ности с увеличением концентрации хло-рамфеникола до бактериостатической в 1,5 раза (от 62,6±0,21 до 97,2±0,915 копий/ клетку pS252 и от 43,1±0,13 до 64,6±1,65 копий/клетку pL252) и отсутствие эффекта при дальнейшем повышении концентрации антибиотика до 1,5-кратной подавляющей (р<0,05) (рис. 2). Изучение динамики антилизоцимной активности данного штамма выявило аналогичную картину: нарастание уровня антилизоцимной активности с ростом концентрации антибиотика до бактериостатической (от 0,84±0,04 до 2,1=1=0,1 мкг/мл*ОП) и неизменное сохранение Рис. 1. Фореграмма плазмид, выделенных из клеток E.coli 252, инкубированных при различных концентрациях хлорамфеникола. Маркеры молекулярной массы и количества молекул нуклеиновых кислот: pC1301 - плазмидный вектор pCambia 1301 11849 н.п.; 1kb - маркер «1kb» в количестве 1,5 мкг; pL252+pS242 - плазмиды, выделенные из клеток штамма E. coli 252 (справа налево): K2 - плазмиды из клеток, инкубированных на среде без антибиотика в течение 15 ч; +0,17 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 0,17-кратной МПК хлорамфеникола; +0,5 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 0,5-кратной МПК хлорамфеникола; +1 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 1-кратной МПК хлорамфеникола; K1 - плазмиды из клеток, инкубированных на среде без антибиотика в течение 6 ч. достигнутых значений антилизоцимной активности при дальнейшем повышении концентрации хлорамфеникола. Рис. 2. Динамика копийности плазмид E.coli 252 при инкубации в среде с различными концентрациями хлорамфеникола. По оси абсцисс - концентрация хлорамфеникола (МПК); по оси ординат - удельное число копий плазмидной ДНК (молекул на клетку); квадрат - pS252, треугольник - pL252. Коэффициент корреляции между концентрацией хлорамфеникола в суббактериостатическом диапазоне и анти-лизоцимной активностью для штамма Е.тоН 252 составил 0,93. У контрольного штамма Е. coli 242 динамика данных параметров выявлена не была (рис. 3). Коэффициент корреляции между копийностью плазмид штамма Е. coli 252 и антилизоцимной активностью, вычисленный для области суббактериостатических концентраций хлорамфе-никола, составил 0,98 для pS252 и 0,97 для pL242. Кроме того, для исключения действия хлорамфеникола как одного из факторов специфической селекции плазмидсодер-жащих клеток на этапе пилотных экспериментов была проведена оценка ко-пийности плазмид и уровня антилизо-цимной активности у штамма Е. coli 252 в условиях воздействия других антибиотиков - ампициллина и канамицина - в суббактериостатических концентрациях. Данные эксперименты достоверных отличий указанных параметров от контроля не выявили. ОБСУЖДЕНИЕ Обнаруженный при пилотных экспериментах инокулюм-эффект в виде шестикратного различия между исходно измеренной МПК хлорамфеникола для исследуемых штаммов Е. coli при внесении хлорамфеникола в 2,5 мл 2,5-часовых бактериальных культур может быть объяснен механизмом действия хлорамфе-никола: необратимым связыванием с большими субъединицами рибосом. Выявленное в результате проведенных экспериментов нарастание анти-лизоцимной активности, реализующееся параллельно увеличению удельного числа копий плазмид на бактериальную клетку в суббактериостатической области концентраций хлорамфеникола у плазмидсодержащего штамма, позволяет предположить, что данный фенотипический эффект реализуется за счет эффекта «дозы генов», локализованных в плазмиде [12], инициация репликации которой находится под ослабленным контролем. Вероятно, обнаруженный эффект реализуется в 2 этапа. Первоначально, при действии хлорамфенико-ла, происходит неспецифическая внутриклеточная амплификация плазмиды с детерминантой антилизоцимной активности: регуляторно - в результате описанного ранее снятия блокирования инициации репликации [15] и ресурсно - за счет возникшего избытка аминосоединений, ресинтезу которых в нуклеотиды хлорамфеникол не препят- Рис. 3. Динамика уровня антилизоцимной активности исследуемых штаммов при инкубации в среде с различными концентрациями хлорамфеникола. По оси абсцисс - концентрация хлорамфеникола (МПК); по оси ординат - уровень антилизоцимной активности (мкг/мл*ОП); квадрат - E. coli 252, ромб - E. coli 242. ствует [9]. После удаления бактерио-статика выявлялась параллельная экспрессия накопленных копий генов антилизоцимной активности. Таким образом, выявлено наличие сильной (г >0,9) корреляции между антилизоцимной активностью и числом копий плазмид на клетку при нарастании концентрации хлорамфеникола в суббактериостатическом диапазоне у плазмидосодержащего штамма Е. coli 252 и отсутствие значимой корреляции концентрации хлорамфеникола и уровня анти-лизоцимной активности у контрольного штамма Е. coli 242 (без идентифицируемых плазмид), что свидетельствует в пользу эффекта «дозы генов» плазмидной локализации как механизма усиления антилизоцимной активности под действием хлорамфеникола.

About the authors

S. V Andryuschenko

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

O. V Bukharin

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

N. B Perunova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

E. V Ivanova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

Orenburg, Russia

References

Supplementary files