УВЕЛИЧЕНИЕ КОПИЙНОСТИ ПЛАЗМИД-НОЙ ДНК КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ УСИЛЕНИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОГО ПРИЗНАКА БАКТЕРИЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ХЛОРАМФЕНИКОЛА


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель. Определить динамику числа копий плазмидной ДНК и антилизоцимной активности под действием хлорамфеникола в клетках пары штаммов Еscherichia coli 252 и 242 (ИКВС), имеющих одинаковый биохимический профиль и отличающихся по антибиотикорезистентности, плазмидному профилю и уровню антилизоцимной активности. Материалы и методы. Исследуемые штаммы Е. coli выделены при скрининге антибиотикорезистентных энтеробактерий кишечного биотопа человека. Отобранные штаммы культивировали в среде с 0,17; 0,5; 1 и 1,5 МПК хлорамфеникола по методике неспецифической амплификации плазмидной ДНК в среде с хлорамфениколом по Т. Маниатису и др. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса с последующим электрофорезом в агарозном геле. Количество плазмидной ДНК оценивали путем сравнения интенсивности полос люминесценции маркерных и опытных проб ДНК. Антилизоцимную активность измеряли фотометрически по О.В. Бухарину и др. Результаты. У штамма Е. coli 252 выявлена высокая прямая корреляция антилизоцимной активности бактерий и ростом числа копий плазмид на клетку (r≥0,9) при нарастании концентрации хлорамфеникола в суббактериостатическом диапазоне. У контрольного штамма Е. coli 242 динамика данных параметров выявлена не была. Заключение. Полученные данные свидетельствуют в пользу действия эффекта «дозы генов» плазмидной локализации как механизма усиления антилизоцимной активности бактерий под действием хлорамфеникола.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Начало изучения молекулярногенетических механизмов проблемы устойчивости бактерий к действию лизоцима датируется 2001 г., когда был выявлен первый специфичный белок-ингибитор лизоцима позвоночных, названный Ivy [8, 14]. К настоящему времени изучены механизмы лизоцимрезистентности, детерминируемые хромосомными генами: известно два семейства специфических и один неспецифический ингибитор лизоцима [10], выявлен механизм сочетанной индукции специфических ингибиторов обоих семейств специфических ингибиторов через бактериальную внутриклеточную регуляторную систему Res в ответ на пептидогликановый стресс независимо от его природы [11]. Вместе с тем, широкая вариабельность антилизоцимного признака среди различных штаммов внутри одного вида труднообъяснима только с позиций горизонтального переноса генов хромосомной локализации. С другой стороны, значительное увеличение антили-зоцимной активности под действием бактериостатического антибиотика хлорамфеникола [5] не очевидно и даже противоречиво с точки зрения регуляции на уровне фенотипа, если принять во внимание белковую природу фактора антилизоцимной активности [7]. В то же время, установлено, что хлорам-феникол, блокируя синтез белка, не только не оказывает прямого влияния на синтез нуклеиновых кислот [9], но и опосредованно вызывает некоторое усиление синтеза всех типов клеточной РНК [13], что, в свою очередь, может приводить к ослаблению блокирования инициации репликации плазмидной ДНК [15]. Также накоплены данные о наличии факторов антилизоцимной активности, кодируемых плазмидами и их сцепленности с генами множественной антибиотикорезистентности на примере бактерий родов Klebsiella [1, 2] и Bacillus [4]. В связи с этим, цель данного исследования - определение динамики числа копий плазмидной ДНК и антилизоцим-ной активности под воздействием хло-рамфеникола в клетках пары штаммов Е. coli 252 и 242, принадлежащих к одному биовару и отличающихся по антибиотикорезистентности, плазмидному профилю и уровню антилизоцимной активности, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для исследования послужил выделенный из кишечного биотопа человека штамм Е. coli 252, отобранный ранее при скрининговом выделении антибиотикорезистентных энтеробактерий по наличию антилизоцимной активности (более 1 мкг/млхОП). У данного штамма проведено определение биохимического профиля (биовара) с помощью тест-системы «ЭНТЕРО-тест 24» (PLIVA-LaChema, Чехия), профиля резистентности (рези-стовара) к 5 стандартно используемым антибиоткам для культивирования плазмидосодержащих штаммов (ампициллину, канамицину, стрептомицину, тетрациклину и хлорамфениколу) с определением минимальной подавляющей концентрации и установлено наличие двух плазмид длиной приблизительно 4,3 и 7 kb, названных pS252 и pL252, соответственно. В качестве контрольного штамма был использован также выделенный из кишечного биотопа человека штамм Е. coli 242, имеющий идентичный биохимический профиль, резистентность к 3 из 5 использованных антибиотиков (ампициллину, стрептомицину и хлорамфени-колу) и не содержащий плазмид, идентифицируемых стандартным методом щелочного выделения плазмидной ДНК и агарозного гель-электрофореза. Для изучения влияния хлорамфени-кола на число копий плазмидной ДНК исследуемого штамма был использован препарат (pharm. grade, Panreac, Испания) в концентрации 34 мг/мл в растворе в этиловом спирте [6], применявшийся в концентрациях 68, 204, 408 и 612 мкг/мл для Е. coli 252 и 34, 102, 204 и 306 мкг/мл - для Е. coli 242. Данные концентрации с учетом выявленного в процессе пилотных экспериментов инокулюм-эффекта (в виде шестикратного различия между исходно измеренной и действительной МПК хлорамфеникола) составили 0,17; 0,5; 1 и 1,5-кратные МПК для исследуемых штаммов Е. coli. Культивирование и инкубация в среде с хлорамфениколом исследуемого штамма проводили по методике неспецифической амплификации плазмидной ДНК в богатой среде с хлорамфениколом по Т. Маниатис и др. [6] с изменениями: объемы сред уменьшены на порядок, время первого культивирования сокращено до 2.5 ч. С целью предварительного нормирования итоговых значений микробного числа непосредственно перед внесением антибиотика в культуры добавляли стерильный бульон Лурия-Бертани (LB) в объемах, определенных эмпирически в пилотных экспериментах и составивших 3 и 1 мл для проб с 0,17- и 0,5-кратными МПК хлорамфеникола, соответственно. В качестве контроля использовали среду LB без добавления антибиотика в объеме 8.5 мл. После завершения инкубации проводили верификацию и заключительное нормирование бактериальных культур по плотности с применением абсорбционного спектрофотометра «ELx808-I (BioTek, США)» при 630 нм до концентрации 0,5х109 КОЕ/мл для дальнейших количественных анализов. Определение числа копий плазмид в клетках нормированных бактериальных культур исследуемого штамма Е. coli 252 проводили путем выделения плазмидной ДНК методом щелочного лизиса клеток из 2 мл культуры с последующей экстракцией пДНК с помощью наборов «GeneJET miniprep» (Fermentas, Евросоюз). Полученные растворы плазмидной ДНК подвергались электрофорезу в агарозном геле [13]. С этой целью 20 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК, смешивали с 5 мкл 10-кратного буфера для внесения и вносили в лунки 0,75% агарозного геля. Электрофорез проводили в ТВЕ-буфере однократной концентрации с 50 мкг/мл этидия бромида в качестве люминесцентного красителя при напряженности поля 5 В/см в течение 1,5 ч. Визуализацию результатов электрофоретического разделения нуклеиновых кислот проводили на установке гель-документирования «Vilber Lour-mat» (Франция). В качестве маркеров молекулярной массы и количества молекул нуклеиновых кислот использовали линейный маркер «1 kb» (OOO «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 0,75; 1 и 1,5 мкг. Количество молекул плазмид-ной ДНК оценивали путем сравнения интенсивности полос люминесценции маркерных и опытных проб ДНК с использованием программного обеспечения TotalLab 2.01 (Nonlinear Dynamics, Ltd, Великобритания). Для определения антилизоцимной активности также использовали 2 мл нормированных бактериальных культур, которые затем подвергали троекратному промыванию стерильным 0,9% раствором натрия хлорида от остатков среды с антибиотиком и дополнительной инкубации бактериальной массы в течение 2,5 ч в шейкер-инкубаторе «ES-20» при 37°С в 2 мл свежего LB-бульона. Анализ антилизоцимной активности полученных культур проводили фотометрическим методом по О.В. Бухарину и др. [3]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Исследование динамики накопления копий плазмид штамма Е. coli 252 (рис. 1) показало достоверное нарастание копий-ности с увеличением концентрации хло-рамфеникола до бактериостатической в 1,5 раза (от 62,6±0,21 до 97,2±0,915 копий/ клетку pS252 и от 43,1±0,13 до 64,6±1,65 копий/клетку pL252) и отсутствие эффекта при дальнейшем повышении концентрации антибиотика до 1,5-кратной подавляющей (р<0,05) (рис. 2). Изучение динамики антилизоцимной активности данного штамма выявило аналогичную картину: нарастание уровня антилизоцимной активности с ростом концентрации антибиотика до бактериостатической (от 0,84±0,04 до 2,1=1=0,1 мкг/мл*ОП) и неизменное сохранение Рис. 1. Фореграмма плазмид, выделенных из клеток E.coli 252, инкубированных при различных концентрациях хлорамфеникола. Маркеры молекулярной массы и количества молекул нуклеиновых кислот: pC1301 - плазмидный вектор pCambia 1301 11849 н.п.; 1kb - маркер «1kb» в количестве 1,5 мкг; pL252+pS242 - плазмиды, выделенные из клеток штамма E. coli 252 (справа налево): K2 - плазмиды из клеток, инкубированных на среде без антибиотика в течение 15 ч; +0,17 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 0,17-кратной МПК хлорамфеникола; +0,5 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 0,5-кратной МПК хлорамфеникола; +1 МПК - плазмиды из клеток, инкубированных на среде с 1-кратной МПК хлорамфеникола; K1 - плазмиды из клеток, инкубированных на среде без антибиотика в течение 6 ч. достигнутых значений антилизоцимной активности при дальнейшем повышении концентрации хлорамфеникола. Рис. 2. Динамика копийности плазмид E.coli 252 при инкубации в среде с различными концентрациями хлорамфеникола. По оси абсцисс - концентрация хлорамфеникола (МПК); по оси ординат - удельное число копий плазмидной ДНК (молекул на клетку); квадрат - pS252, треугольник - pL252. Коэффициент корреляции между концентрацией хлорамфеникола в суббактериостатическом диапазоне и анти-лизоцимной активностью для штамма Е.тоН 252 составил 0,93. У контрольного штамма Е. coli 242 динамика данных параметров выявлена не была (рис. 3). Коэффициент корреляции между копийностью плазмид штамма Е. coli 252 и антилизоцимной активностью, вычисленный для области суббактериостатических концентраций хлорамфе-никола, составил 0,98 для pS252 и 0,97 для pL242. Кроме того, для исключения действия хлорамфеникола как одного из факторов специфической селекции плазмидсодер-жащих клеток на этапе пилотных экспериментов была проведена оценка ко-пийности плазмид и уровня антилизо-цимной активности у штамма Е. coli 252 в условиях воздействия других антибиотиков - ампициллина и канамицина - в суббактериостатических концентрациях. Данные эксперименты достоверных отличий указанных параметров от контроля не выявили. ОБСУЖДЕНИЕ Обнаруженный при пилотных экспериментах инокулюм-эффект в виде шестикратного различия между исходно измеренной МПК хлорамфеникола для исследуемых штаммов Е. coli при внесении хлорамфеникола в 2,5 мл 2,5-часовых бактериальных культур может быть объяснен механизмом действия хлорамфе-никола: необратимым связыванием с большими субъединицами рибосом. Выявленное в результате проведенных экспериментов нарастание анти-лизоцимной активности, реализующееся параллельно увеличению удельного числа копий плазмид на бактериальную клетку в суббактериостатической области концентраций хлорамфеникола у плазмидсодержащего штамма, позволяет предположить, что данный фенотипический эффект реализуется за счет эффекта «дозы генов», локализованных в плазмиде [12], инициация репликации которой находится под ослабленным контролем. Вероятно, обнаруженный эффект реализуется в 2 этапа. Первоначально, при действии хлорамфенико-ла, происходит неспецифическая внутриклеточная амплификация плазмиды с детерминантой антилизоцимной активности: регуляторно - в результате описанного ранее снятия блокирования инициации репликации [15] и ресурсно - за счет возникшего избытка аминосоединений, ресинтезу которых в нуклеотиды хлорамфеникол не препят- Рис. 3. Динамика уровня антилизоцимной активности исследуемых штаммов при инкубации в среде с различными концентрациями хлорамфеникола. По оси абсцисс - концентрация хлорамфеникола (МПК); по оси ординат - уровень антилизоцимной активности (мкг/мл*ОП); квадрат - E. coli 252, ромб - E. coli 242. ствует [9]. После удаления бактерио-статика выявлялась параллельная экспрессия накопленных копий генов антилизоцимной активности. Таким образом, выявлено наличие сильной (г >0,9) корреляции между антилизоцимной активностью и числом копий плазмид на клетку при нарастании концентрации хлорамфеникола в суббактериостатическом диапазоне у плазмидосодержащего штамма Е. coli 252 и отсутствие значимой корреляции концентрации хлорамфеникола и уровня анти-лизоцимной активности у контрольного штамма Е. coli 242 (без идентифицируемых плазмид), что свидетельствует в пользу эффекта «дозы генов» плазмидной локализации как механизма усиления антилизоцимной активности под действием хлорамфеникола.
×

Об авторах

С. В Андрющенко

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Оренбург

О. В Бухарин

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Оренбург

Н. Б Перунова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Оренбург

Е. В Иванова

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза

Оренбург

Список литературы

  1. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Яблочков А.Л. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа, биологические функции и генетический контроль Журн. микробиол., 1994, 1: 22-28.
  2. Бондаренко В.М., Яблочков А.Л., Романова Ю.М., Петровская В.Г. Характеристика плазмиды Klebsiella pneumoniae, несущей маркеры лекарственной устойчивости и антилизоцимной активности. Журн. микробиол., 1988, 3: 28-32.
  3. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., Медицина, 1999.
  4. Бухарин О.В., Кириллов Д.А., Кириллов В.А. Скрининг плазмид у бактерий рода Bacillus, обладающих антилизоцимной активностью. Журн. микробиол., 2006, 1: 3-6.
  5. Зыкова Л.С. Этиологическая характеристика пиелонефрита и её значение для экспериментально-клинического обоснования антибактериальной терапии. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Челябинск, 1986.
  6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.
  7. Соколов В.Ю. Механизм антилизоцимной активности бактерий. Авто-реф. дисс. канд. мед. наук. Челябинск, 1990.
  8. Abergel С., Monchois V, Byrne D. et al. Structure and evolution of the Ivy protein family, unexpected lysozyme inhibitors in gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, 104: 6394-6399.
  9. Brock T.D. Chloramphenicol. Bacteriol. Rev. 1961, 25 (l): 32-48.
  10. Callewaert L., Aertsen A., Deckers D. et al. A new family of lysozyme inhibitors contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria. PLoS Pathog. 2008, 4: el000019.
  11. Callewaert L., Vanoirbeek K.G.A., Lurquin I. et al. The two-component system regulates expression of lysozyme inhibitors and is induced by exposure to lysozyme. J. Bacteriol. 2009, 191 (6): 1979-1981.
  12. Foster TJ. Plasmid-determined resistance to antimicrobial drugs and toxic metal ions in bacteria. Microbiol. Rev. 1983, 47 (3): 361-409.
  13. Midgley J.E.M., Gray W.J.H. The control of ribonucleic acid synthesis in bacteria. The synthesis and stability of ribonucleic acid in chloramphenicol-inhibited cultures of Escherichia coli. Biochem. J. 1971, 122 (2): 149159.
  14. Monchois V., Abergel C., Sturgis J. Escherichia coli ykfE ORFan gene encodes a potent inhibitor of C-type lysozyme. J. Biol. Chem. 2001, 276: 18437-18441.
  15. Weinberger M., Helmstetter С.Е. Inhibition of protein synthesis transiently stimulates initiation ofminichromosome replication in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1989, 171 (7): 3591-3596.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© Андрющенко С.В., Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., 2011

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах