Differentiation of the Francsella tularensis subspecies by the INDEL typing method

Full Text

Введение

Francisella tularensis, этиологический агент туляремии, относится к факультативным внутриклеточным патогенам, вызывающим тяжёлое заболевание у многих видов животных и человека [1], и является агентом биотерроризма категории А [2]. В настоящее время F. tularensis делится на четыре подвида: tularensis (nearctica), holarctica, mediasiatica, novicida, которые различаются по патогенности и географическому распределению [3]. Исторически такое разделение было обусловлено различным ареалом циркуляции штаммов, отличиями в их биохимической активности и патогенности для разных хозяев [4][5]. F. novicida, официально признанная четвёртым подвидом вида F. tularensis, обладает высокой гомологией ДНК с другими подвидами F. tularensis, но не является возбудителем типичной туляремийной инфекции [3]. Высоковирулентные штаммы F. tularensis subsp. tularensis (тип A) распространены только в Северной Америке, а менее патогенные штаммы F. tularensis subsp. holarctica (тип В) циркулируют в основном в Северном полушарии. F. tularensis subsp. mediasiatica по степени вирулентности близка F. tularensis subsp. holarctica, но географически ограничена только Центральной Азией [3]. Однако недавно выявлено расширение ареала её обитания с изоляцией штаммов на территории России [6]. F. tularensis subsp. novicida относится к слабопатогенному для человека подвиду, который редко выделяется в Северной Америке [3] и в одном случае был выделен в Австралии [7].

Все упомянутые подвиды различаются по степени их генетического полиморфизма. Редко встречающиеся подвиды (F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. novicida) проявляют высокий полиморфизм [8], но из-за небольшого количества исследованных штаммов их реальное генетическое разнообразие до сих пор в полной мере не изучено. Доминирующие и высоковирулентные подвиды (F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. holarctica) значительно различаются по уровню генетического полиморфизма. Например, F. tularensis subsp. tularensis представлен двумя генетически различными субпопуляциями (A.I и A.II) с различным географическим распространением [3][8–11]. Это подтверждено с помощью многих молекулярно-генетических методов, включая полногеномный анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) [3], мультилокусное секвенирование-типирование [11], риботипирование [12], пульс-гель-электрофорез (PFGE) [10][12], анализ регионов различия [13], полиморфизма длины амплификационных фрагментов [12][14] и канонических INDEL-маркеров [15], мультилокусный анализ полиморфизма числа тандемных повторов (MLVA) [8][16]. Напротив, с помощью этих же методов было показано, что F. tularensis subsp. holarctica проявляет гораздо меньший генетический полиморфизм, что, наряду с широким географическим распространением, позволяет предположить более позднее происхождение этого подвида с дальнейшим его распространением по Северному полушарию [3][8][9][13][17]. Развитие метода MLVA-типирования позволило создать инструменты для адекватной дифференциации штаммов возбудителя туляремии и упростило межлабораторное сравнение полученных данных [8][16][18][19]. Ранние методы молекулярного генотипирования F. tularensis обладали рядом недостатков: низкими чувствительностью и разрешающей способностью, слабой межлабораторной воспроизводимостью. Современный метод SNP-типирования требует предварительного секвенирования ДНК, что до сих пор не стало рутинным методом исследования вследствие высокой трудоёмкости и затрат. Важное ограничение, присущее MLVA-типированию, — это риск ошибочной оценки родства между штаммами на больших генетических расстояниях. К тому же ни один из этих методов не предусматривает алгоритма дифференциации подвидов F. tularensis.

В последние годы значительно выросло число публикаций, посвящённых как модификации существующих методов дифференциации штаммов F. tularensis, так и их практическому применению для анализа популяций возбудителя туляремии, циркулирующих на различных территориях [20– 28]. Тем не менее до настоящего времени актуальной остаётся разработка методов дифференциации подвидов и отдельных групп F. tularensis [26].

Целью настоящего исследования является разработка способа дифференциации подвидов и отдельных групп F. tularensis на основе INDELтипирования.

Материалы и методы

Локальную базу данных нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis разных подвидов для сравнительного анализа геномов F. tularensis, представленных в базе данных GenBank, создавали с помощью авторского программного обеспечения.

Детекцию всех INDEL-маркеров в геномах штаммов локальной базы данных с предустановленным размером более 7 п.н. осуществляли с помощью программы «GeneExpert». Конструирование праймеров и проведение ПЦР in silico осуществляли при помощи программы «Primer3Plus» и авторской программы «VirtualPCR». Кластерный анализ и построение филогенетического дерева проводили с использованием программы «GrapeTree» (алгоритм NJ) [29]. Для оптимизации набора INDEL-локусов с целью получения максимального числа индивидуальных генотипов была использована программа «Automated Selection of Typing Target Subsets» («AuSeTTS») [30].

Для детекции INDEL-локусов реакцию проводили отдельно для каждого из 5 локусов. Температура отжига — 55ºС для всех локусов: ft263, ft278, ft502, ft1779, ft09. Продукты амплификации анализировали в 8% полиакриламидном геле и определяли размер амплифицированных фрагментов по стандарту молекулярных масс с помощью программы «Quantity One».

Результаты

Для сравнительного анализа геномов F. tularensis, представленных в базе данных GenBank, с помощью авторского программного обеспечения создана локальная база данных нуклеотидных последовательностей 29 штаммов F. tularensis разных подвидов. С помощью программы «GeneExpert» проведено попарное сравнение более 1800 открытых рамок считывания в геномах штаммов локальной базы данных для детекции всех INDEL-маркеров с предустановленным размером более 7 п.н. Обнаружено 13 локусов, содержащих INDEL-маркеры, значимые для дифференциации подвидов возбудителя туляремии. Были сконструированы праймеры, позволяющие детектировать INDEL-маркеры в 13 локусах.

Тестирование результатов ПЦР in silico по 13 локусам с помощью программы «AuSeTTS» позволило обнаружить у 29 изученных штаммов из базы данных GenBank 9 индивидуальных генотипов с высоким индексом разнообразия (DI = 0,85) [36]. Для оптимизации набора INDEL-локусов с целью получения максимального числа индивидуальных генотипов была использована программа «AuSeTTS» [30]. В результате удалось сократить число используемых INDEL-локусов до 5 без потери разрешающей способности метода (9 индивидуальных генотипов с индексом разнообразия DI = 0,85). Все праймеры, использованные в данном исследовании, и размер соответствующих продуктов амплификации приведены в табл. 1.

 

Для каждого локуса разные аллели четко разделяются при использовании электрофореза в 8% полиакриламидном геле и могут быть легко идентифицированы.

Результаты виртуального ПЦР-типирования 29 штаммов F. tularensis из базы данных GenBank разных подвидов по пяти избранным INDEL-локусам представлены в табл. 2.

 

Проведена кластеризация выявленных INDEL-генотипов 29 штаммов из базы данных GenBank и построено филогенетическое дерево с помощью программы «GrapeTree» (алгоритм NJ) [29] (рис. 1).

Отмечено соответствующее разделение подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida по разным кластерам, причём подвид tularensis чётко разделён на подгруппы A.I и A.II. Штаммы подвида novicida образуют кластер, разделённый на 2 группы, 3 штамма holarctica bv japonica представлены 3 индивидуальными генотипами, 2 из которых принадлежат генетической линии holarctica. Точную принадлежность штамма O’HARA трудно определить из-за отсутствия данных по одному из локусов в базе данных GenBank.

Для верификации in vitro предлагаемой схемы INDEL-типирования исследованы 27 штаммов F. tularensis разных подвидов из музея живых культур (МЖК) Ростовского-на-Дону противочумного института методом ПЦР с использованием сконструированных праймеров. Для определения филогенетических связей между штаммами из базы данных GenBank и 27 штаммами F. tularensis из МЖК проведён кластерный анализ INDEL-генотипов и построено совместное филогенетическое дерево (рис. 2).

Итак, INDEL-генотип всех 9 штаммов подвида holarctica из МЖК совпадает с таковым у штаммов из базы данных GenBank, генотип всех 9 штаммов (МЖК) подвида mediasiatica идентичен генотипу единственного штамма из базы данных GenBank этого подвида (FSC147), что подтверждает обособленность штаммов этого подвида. Штаммы подвида tularensis (МЖК) впервые удается in vitro разделить на группы A.I и A.II (табл. 3). Генотип двух «японских» штаммов (holarctica bv japonica) идентичен генотипу штамма FSC022 и представляет, наряду со штаммом PHIT-FT049, отдельный кластер bv japonica. Единственный штамм F. novicida из МЖК относится к кластеру штаммов подвида novicida, представленному 2 группами штаммов. Принадлежность штамма O’HARA по-прежнему остаётся неопределённой.

 

Обсуждение

INDEL-типирование штаммов F. tularensis было впервые предложено в 2007 г. [15], когда MLVA являлся единственным методом с высокой разрешающей способностью на уровне штаммов по сравнению с методом PFGE. Метод MLVA был успешно применён во многих эпидемиологических исследованиях [8][9][31]. В методе используется обеззараженная культура и, в противоположность PFGE, результаты MLVA представляют собой дискретные цифровые значения, обеспечивающие сравнительный анализ данных, полученных в разных лабораториях. Важное ограничение, присущее MLVA, — это риск ошибочной оценки родства между штаммами на больших генетических расстояниях. Высокая мутабельность MLVA-маркеров [32][33] может вызывать эффекты гомоплазии, т.е. мутационные изменения по причинам, отличным от общего происхождения. INDEL-маркеры проявляют более низкую степень вариабельности и, следовательно, могут быть использованы при создании иерархической схемы типирования наряду с методом MLVA, тем более что оба метода основаны на фрагментарном анализе, минимизируя время и затраты на исследование. При анализе нуклеотидных последовательностей 5 штаммов F. tularensis разных подвидов авторами [15] были обнаружены 280 INDEL-маркеров, из них более 70% не превышали размер 20 п.н. Для окончательного варианта схемы INDEL-типирования было отобрано 38 INDEL-локусов. Комбинированный способ объединил INDEL-типирование по 38 локусам и MLVA-типирование по 25 VNTR-локусам, ранее предложенное А. Johansson и соавт. [8]. Это исследование показало, что канонические INDEL-маркеры могут быть интегрированы в эволюционный анализ на больших генетических расстояниях, тогда как MLVA-типирование обеспечивает хорошую разрешающую способность для родственных штаммов. Позднее INDEL-типирование совместно с SNP-типированием было широко использовано для дифференциации штаммов F. tularensis в различных регионах мира [34][35].

На наш взгляд, эта схема при всей своей эффективности чрезвычайно трудоёмкая и затратная для текущих исследований, поэтому мы предприняли усилия по её модификации для упрощённого и ускоренного определения подвидов штаммов F. tularensis. Для отбора INDEL-маркеров мы использовали расширенный набор штаммов (29) разных подвидов из базы данных GenBank, включающий единственный штамм подвида mediasiatica (FSC147). Основными условиями для выбора INDEL-маркеров являлись размер не менее 7 п.н. и значимость для дифференциации подвидов. На завершающем этапе были отобраны 5 маркеров, позволивших выявить у 29 штаммов F. tularensis из базы данных GenBank 9 индивидуальных генотипов с индексом разнообразия (DI = 0,85). Филогенетический анализ продемонстрировал разделение подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida по разным кластерам, причём подвид tularensis чётко разделен на подгруппы A.I и A.II. Не удалось установить точную принадлежность штамма O’HARA, очевидно, из-за отсутствия данных по одному из локусов в базе данных GenBank. Важно отметить, что топология разных подвидов полностью коррелирует со схемами эволюции туляремийного микроба, построенными ранее при анализе постепенной утраты регионов различия и при полногеномном секвенировании [3].

Предлагаемая нами схема INDEL-типирования была апробирована in vitro на 27 штаммах F. tularensis разных подвидов из МЖК (табл. 3). Показано, что штаммы подвида holarctica составляют единый кластер со штаммами этого подвида из базы данных GenBank, а штаммы подвида mediasiatica подтверждают существование обособленного кластера этого подвида, включающего единственный штамм из базы данных GenBank (рис. 2). При кластеризации подвида tularensis штаммы из МЖК впервые удаётся in vitro разделить на группы A.I и A.II (табл. 3). Генотип «японских» штаммов holarctica bv japonica (МЖК) совпадает с генотипом штамма FSC022, который вместе со штаммом PHITFT049 входит в отдельный кластер bv japonica. Музейный штамм F. novicida принадлежит кластеру штаммов подвида novicida.

Заключение

Таким образом, нами впервые разработана схема дифференциации подвидов F. tularensis на основе метода INDEL-типирования, позволяющая in vitro без необходимости секвенирования штаммов идентифицировать как подвиды F. tularensis (tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida), так и группы штаммов внутри подвидов. Топология филогенетического дерева INDEL-генотипов штаммов F. tularensis коррелирует со схемами эволюции туляремийного микроба [3]. Способ защищён патентом [37]. Предлагаемый метод может быть применён для комбинированного типирования штаммов F. tularensis совместно с MLVA- или SNP-типированием.

About the authors

V. M. Sorokin

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Author for correspondence.
Email: soroka53@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1835-1496

Vladimir M. Sorokin — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of tularemia

Rostov-on-Don

Россия

A. S. Vodopyanov

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231

Alexey S. Vodopyanov — Cand. Sci. (Med.), Deputy head, Group of
virology

Rostovon-Don

Россия

M. V. Tsimbalistova

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-4091-649X

Marina V. Tsimbalistova — Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of tularemia

Rostov-on-Don

Россия

N. V. Pavlovich

Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8287-4294

Natalya V. Pavlovich — D. Sci. (Med.), major researcher, Deputy
head, Laboratory of tularemia

Rostov-on-Don

Россия

References

Supplementary files