The utility of real-time PCR as a test for confirmation of the absence of residual neurovirulence of strains for live antiviral vaccines

Full Text

Введение

Золотым стандартом оценки специфической безопасности аттенуированных штаммов живых вакцин является гистологическое исследование головного и спинного мозга экспериментальных животных в тесте интрацеребрального заражения [1]. При этом важным показателем уровня их аттенуации признан контроль экстраневральной диссеминации вакцинных штаммов. Так, по данным ранее проведённых исследований, при низком уровне аттенуации штаммов вируса краснухи (ВК) вирус может не только размножаться в клетках ЦНС, распространяться по отделам ЦНС, но и преодолевать гематоэнцефалический барьер, поражая периферические органы обезьян. Для выявления ВК в вируссодержащем материале исследователи применяют классический прямой метод индикации — реакцию цитопатического действия (ЦПД) [2].

Особенностью индикации ВК является вариабельность проявления его цитодеструктивного действия на клетки. Размножение аттенуированных штаммов ВК с отчётливо выраженным ЦПД наблюдается лишь в культурах клеток ВНК-21 и RK-13 [3]. Другой недостаток этого метода — длительность; реакция ЦПД ВК на чувствительную клеточную линию занимает 10–12 сут.

Актуальной представляется разработка дополнительных подтверждающих стабильность аттенуации тестов на базе современных методов лабораторной диагностики. Молекулярно-биологический метод — ПЦР-РВ, основанный на прямой идентификации генетического материала возбудителя и характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью, широко используется в различных диагностических и научно-исследовательских центрах. Так, показана возможность использования метода ПЦР-РВ для контроля титра вакцинных штаммов РНК-содержащих вирусов в процессе производства вакцин и оценки подлинности живых вакцин [4–6].

Целью данного исследования является оценка возможности использования метода ПЦР-РВ в качестве дополнительного теста при контроле остаточной нейровирулентности аттенуированных вакцинных штаммов ВК.

Материалы и методы

В работе использовали живые аттенуированные вакцинные штаммы ВК: «Орлов-В» [7] из коллекции НИИЭМ им. Пастера и RA27/3, входящий в состав коммерческой живой аттенуированной вакцины производства НПО «Микроген».

Перевиваемая клеточная линия — культура клеток почки хомяка (ВНК-21) — была получена из музея культур клеток НИИЭМ им. Пастера.

Исследование проводили на 11 клинически здоровых обезьянах вида Macaca mulatta массой 3–5 кг, родившихся и содержащихся в питомнике НИИМП. В опыт отбирали животных, не содержащих в сыворотке крови нейтрализующих антител к ВК. Обезьяны были рандомизированы на 3 группы методом случайных чисел. Обращение с животными проводилось в строгом соответствии с Правилами содержания и ухода за нечеловекообразными приматами (ГОСТ  33216-2014). Протокол исследования одобрен Комиссией по биоэтике ФГБНУ «НИИ МП» (Протокол № 16 от 14.08.2019).

Животным интрацеребрально вводили по 0,5 мл следующих препаратов: в 1-й группе (n = 4) — вакцинный штамм «Орлов-В» с инфекционной активностью 4,7 lg ТЦД₅₀/0,5 мл; во 2-й (n = 2) — вакцинный штамм RA27/3 с инфекционной активностью 4,0 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, входящий в состав культуральной живой вакцины против краснухи («НПО «Микроген»); в 3-й (n = 1) — растворитель для лиофилизированной коммерческой вакцины против краснухи (вода для инъекций); в 4-й (n = 4) — низкоаттенуированный штамм ВК «Орлов-14» с инфекционной активностью 3,8 и 4,7 lg ТЦД₅₀/0,5. Вируссодержащий материал вводили обезьянам по методу [8].

После эксперимента обезьян выводили из опыта под глубоким наркозом, вводя в паховую вену животного 1 мл золетила («Valdepharm») и 4 мл ксилы («Interchemie Werken de Adelaar Eesti AS»). После того как животное входило в глубокий сон, в эту же вену вводили 5 мл листенона («Takeda Austria GmbH»), что приводило к полной остановке сердца.

Клиническим материалом исследования от экспериментальных животных служили образцы тканей различных отделов ЦНС (головной мозг, шейный и поясничный отделы спинного мозга), региональных лимфатических узлов (подчелюстных и заднешейных), паренхиматозных органов (лёгкое, печень, селезёнка), плазма и спинномозговая жидкость. Забор спинномозговой жидкости (ликвора) проводили непосредственно перед выделением головного и спинного мозга из мозжечково-мозговой цистерны (cisternamagna, c. cerebellomedullaris). Во время проведения аутопсии образцы исследуемых тканей помещали в индивидуальные стерильные пробирки типа «Эппендорф» и хранили при температуре не выше –68оС для проведения вирусологического и молекулярно-биологического исследований.

Титрование штаммов ВК по ЦПД проводили в культуре клеток ВНК-21. С этой целью из различных отделов ЦНС и паренхиматозных органов готовили 10% суспензию, растерев образцы ткани в стерильной фарфоровой ступке, после чего к суспензии добавляли физиологический раствор в соотношении 1 : 9 и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость использовали для приготовления последовательных 10-кратных разведений от 10^–1 до 10^–8. Каждое из разведений вносили по 100 мкл в 4 лунки 96-луночного планшета. Инфицированные и контрольные культуры клеток инкубировали в термостате с 5% СО₂ при 35ºС. Учет результатов проводили на 12-е сутки по реакции ЦПД. Титр ВК рассчитывали по методу Рида и Менча.

Для проведения молекулярно-биологического исследования использовали метод ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией, состоящий из трех этапов: экстракции РНК из исследуемого материала, обратной транскрипции РНК и амплификации фрагмента кДНК с гибридизационно-флюоресцентной детекцией.

Ткани головного мозга, шейный и поясничный отделы спинного мозга, подчелюстные и заднешейные лимфатические узлы, лёгкое, печень и селезёнку гомогенизировали в стерильной ступке, готовили 10% суспензию на физиологическом растворе («МОСФАРМ») и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученную надосадочную жидкость использовали для проведения экстракции РНК.

Выделение РНК из 10% суспензии образцов тканей ЦНС, паренхиматозных органов, а также спинномозговой жидкости и плазмы периферической крови проводили с помощью коммерческих наборов: «РИБО-сорб», «РИБО-золь-С», «РИБОпреп» (ЦНИИ Эпидемиологии) и «AllPrepDNA/ RNA/miRNAUniversalKit» («Qiagen») (табл. 1). Все этапы экстракции РНК выполняли согласно инструкции производителя для соответствующего комплекта реагентов.

 

Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» (ЦНИИ Эпидемиологии).

Для проведения ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации использовали набор реагентов «АмплиСенс® Rubellavirus-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии). Аналитическая чувствительность тест-системы составляла 400 копий/мл. Исследование проводили на амплификаторе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research»).

Учёт результатов ПЦР-анализа проводили на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флюоресценции с установленной на уровне 0,03 пороговой линией и последующего сравнения величины сигнала (Ct) в исследуемых образцах относительно контрольных (ПКО Rubellavirus-rec и ВКО STI-87-rec). Положительными считали образцы, у которых кривая флюоресценции имела типичный для ПЦР-РВ S-образный вид, однократно пересекалась с пороговой линией в области достоверного прироста флюоресценции и значение порового цикла (Ct) не превышало 35. Отрицательными по содержанию РНК ВК считали образцы, кривая флюоресценции которых не пересекала пороговую линию [9].

В качестве положительного контроля (помимо контролей, заложенных в тест-системах) параллельно с исследуемыми образцами методом ПЦР-РВ были исследованы образцы тканей ЦНС и внутренних органов обезьян M. mulatta, интрацеребрально получивших 0,5 мл жидкости с низкоаттенуированным штаммом ВК «Орлов-14». Обезьяны (n = 2), получившие штамм с инфекционной активностью 4,7 lg ТЦД₅₀/0,5 мл, были выведены из эксперимента на 2-е и 12-е сутки; получившие штамм с инфекционной активностью 3,8 lg ТЦД₅₀/0,5 мл (n = 2) были выведены из эксперимента на 21-е и 28-е сутки (4-я группа).

Результаты

Выявление ВК в исследуемых отделах ЦНС и периферических органах обезьян проводили стандартным методом по ЦПД. У животных 1-й группы ВК был выявлен только в головном мозге у 1 обезьяны, умерщвлённой на 2-е сутки после заражения (табл. 2). В то же время на 12, 21 и 28-е сутки после интрацеребральной инокуляции вакцинным штаммом «Орлов-В» ВК не был выявлен ни в одном из исследуемых органов. Результаты, полученные при исследовании органов животных 2-й и 3-й групп, указывают на отсутствие ВК в различных отделах ЦНС и периферических органах обезьян.

 

При анализе результатов молекулярно-биологического метода выявлено, что среди животных 1-й группы, заражённых вакцинным штаммом «Орлов-В», РНК ВК была выявлена только в головном мозге у обезьяны, умерщвлённой на 2-е сутки после инокуляции (табл. 3). При этом у других животных данной группы РНК ВК не выявлена ни в исследованных отделах ЦНС, ни во внутренних органах и плазме обезьян.

 

Сходные данные были получены при исследовании клинического материала от обезьян 2-й группы. Так, на 12-е и 28-е сутки эксперимента в образцах тканей экспериментальных животных, как и в образцах тканей отрицательной контрольной обезьяны (3-я группа), пороговый цикл не определялся, что свидетельствовало об отсутствии РНК ВК в исследуемых образцах.

У животных 4-й группы во все сроки наблюдения РНК ВК отсутствовала в лёгких и печени. На 2, 12 и 21-е сутки эксперимента РНК ВК была выявлена в исследованных отделах ЦНС, внутренних органах и плазме крови обезьян. В то же время на 28-е сутки после заражения ни в одном из исследуемых образцов не выявлено РНК ВК.

Таким образом, полученные результаты показывают отсутствие ВК в ЦНС, периферических органах и плазме крови обезьян, зараженных вакцинными штаммами, что свидетельствует о высоком уровне аттенуации штаммов «Орлов-В» и RA27/3 ВК. Получено также хорошее совпадение результатов определения содержания ВК в тканях ЦНС и периферических органах инокулированных животных вирусологическим и молекулярно-биологическим методами исследования.

Обсуждение

Классическим прямым вирусологическим методом индикации ВК является культуральный метод (выделение вируса на модели чувствительных клеточных культур). По данным литературы, выделение ВК in vitro обеспечивает широкий круг первичных, диплоидных и перевиваемых клеточных культур птичьего, животного и человеческого происхождения [10]. Основной причиной ЦПД ВК в культуре клеток является нарушение метаболизма клеток. Неструктурные вирусные белки р150 и р90 блокируют синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза клеточных белков, нарушению структуры клеточных мембран, лизосом и митохондрий [11]. В результате освобождаются и активируются клеточные лизосомальные ферменты, которые и вызывают деструкцию клеточных компонентов и развитие ЦПД в культуре клеток.

Однако особенностью индикации ВК является вариабельность проявления его цитодеструктивного действия на клетки. Так, при использовании невысокочувствительных культур клеток ВК может вызвать нелитическую продуктивную инфекцию. Отчётливая реакция клеток на заражение ВК может наблюдаться лишь в весьма ограниченном круге клеточных культур. ЦПД ВК на монослой клеток наблюдают в первичной культуре клеток почки кролика и амниона человека. Из перевиваемых линий клеток это клетки почек детёнышей хомяка (ВНК-21), а также обезьяньего (Vero) и кроличьего (RK-13) происхождения.

Преимущество метода выделения ВК на модели чувствительных клеточных культур заключается в том, что данный метод обеспечивает выделение живого возбудителя, что является достоверным подтверждением результата. По данным различных авторов, чувствительность культурального метода диагностики ВК колеблется в пределах 50–80%, при этом специфичность метода составляет 100% [12]. К недостаткам метода относятся длительность и субъективность оценки результата, необходимость проведения слепых пассажей, вариабельность и интенсивность проявления ЦПД ВК в культуре клеток.

Развитие молекулярной биологии — открытие генетического кода, изучение структуры и роли РНК как хранилища генетической информации у ряда вирусов — дало новые возможности в изучении и диагностике ВК.

Разработка метода ПЦР послужила поворотным моментом в развитии молекулярной диагностики постнатальной и врожденной краснухи. В настоящее время для выявления РНК ВК в образцах биологического материала метод амплификации нуклеиновых кислот остаётся наиболее распространённым в клинической лабораторной практике [13][14]. Разработано значительное количество коммерческих тест-систем как для качественной, так и для количественной идентификации РНК ВК.

Наиболее распространённым методом детекции ВК является метод ПЦР-РВ. Одним из преимуществ данного метода является то, что процессы амплификации и детекции амплификации ВК проходят одновременно в одной пробирке, что сокращает вероятность ложноположительных результатов из-за перекрёстной контаминации исследуемых образцов. Данному методу также присущи высокая чувствительность, специфичность, быстрота получения результатов и возможность автоматизации процесса постановки реакции [15]. Метод ПЦР-РВ активно применяется для оценки безопасности и эффективности живых противовирусных вакцин, в частности, для аттенуированных вакцинных штаммов вирусов гриппа, кори и краснухи [16–18].

В данной работе мы провели сравнительный анализ результатов, полученных при определении ВК в исследуемых образцах по ЦПД и методом ПЦР-РВ. Полученные данные указывают, что аналитическая чувствительность метода ПЦР-РВ превышает аналитическую чувствительность реакции ЦПД на 1,7–3,3 lg. Классический метод выделения ВК имеет ряд недостатков: длительность, субъективность анализа и зависимость от внешних факторов. В отличие от него, выявление ВК методом ПЦР-РВ имеет ряд преимуществ: специфичность, чувствительность и меньшую длительность реакции. Таким образом, метод ПЦР-РВ может быть использован в качестве дополнительного теста при доклинической оценке специфической безопасности, а именно экстраневральной диссеминации аттенуированных вакцинных штаммов, что крайне необходимо при контроле качества живых противовирусных вакцин.

About the authors

O. A. Shamsutdinova

Research Institute of medical Primatology

Author for correspondence.
Email: shamsutdinova-o-a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2742-3965

Olga A. Shamsutdinova — researcher, Laboratory of immunology
and cell biology

Sochi

Russian Federation

D. D. Karal-ogly

Research Institute of medical Primatology

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3606-1668

Dgina D. Karal-ogly — Cand. Sci. (Biol.), Depute Director

Sochi

Russian Federation

I. N. Lavrent’eva

Saint-Petersburg Pasteur Institute

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2188-6547

Irina N. Lavrent'eva — D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of experimental virology

Saint Petersburg

Russian Federation

References

Supplementary files