The association between Candida albicans sensitivity to antimycotic drugs and the architecture of their microbial community in the oropharynx of HIV infected patients

Full Text

Введение

Кандидоз — распространённое патологическое состояние, вызываемое дрожжеподобными грибами рода Candida. Несмотря на достижения современной медицины, проблемы, связанные с этой инфекцией, сохраняют свою актуальность [1]. Чаще всего кандидозы выступают как проявление дисбиозов различной этиологии [2, 3]. Однако в настоящее время наибольшее беспокойство представляет кандидозное осложнение основного заболевания, особенно среди иммунокомпрометированных лиц, число которых неуклонно растёт [4–11]. Этиологический фактор кандидоза — прокариотический условно-патогенный микроорганизм рода Candida, представленный почти 200 видами. Среди них наиболее распространённым в популяции людей является C. albicans [12].

Достаточно часто Candida spp. высеваются от пациентов в виде монокультуры одного вида, однако при ряде состояний было отмечено параллельное присутствие в биотопе нескольких видов или штаммов данных грибов [6, 8, 13, 14]. В ходе целенаправленного микробиологического исследования слизистых ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими признаками орофарингеального кандидоза мы подтвердили данный факт [15]. Вместе с тем было обнаружено, что сообщество грибов Candida spp. в биотопе ротоглотки отличает упорядоченность структуры, т.е. определённая архитектура: они могут присутствовать в данном биотопе в виде монокультуры или ассоциации коизолятов. Последние могут быть не только гетерогенными, состоящими из грибов различных видов, но и гомогенными, включающими различные штаммы одного вида.

В недавних научных публикациях делается особый акцент на структуру микробных сообществ внутренних биотопов тела человека, архитектура которых связана с патогенезом патологических процессов [16, 17]. Учитывая неуклонно расширяющееся распространение резистентности к антимикотическим препаратам среди грибов рода Candida [18–24], мы предположили, что устойчивость кандид к этим лекарственным средствам может быть ассоциирована с архитектурой их сообщества.

Цель работы — сравнительное исследование взаимосвязи архитектуры сообщества C. albicans и их чувствительности к антимикотическим препаратам в ротоглотке ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими проявлениями орофарингеального кандидоза.

Материалы и методы

Проведено микробиологическое исследование грибов рода Candida, выделенных из ротоглотки 31 ВИЧ-инфицированного пациента (51,6% — мужчины, 48,4% — женщины) в возрасте 20–69 лет с клиническими проявлениями орофарингеального кандидоза, находившихся на стационарном лечении в Клинической инфекционной больнице № 2 г. Москвы.

ВИЧ-инфекция у всех пациентов была диагностирована на основании клинико-эпидемиологических данных и подтверждена обнаружением специфических антител/антигенов методом иммуноферментного анализа и лизатного иммуноблоттинга к белкам вируса иммунодефицита человека («Profiblot 48 TECAN», «АвтоБлот 3000») в соответствии с клинической классификацией ВИЧ-инфекции по В.И. Покровскому (2001) в модификации 2006 г.¹ У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на использование данных лабораторных анализов в научных целях. Протокол исследование одобрен Комитетом по этике при ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России (протокол № 4 от 25.04.2014).

Выделение и идентификацию изолятов Candida spp. по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и молекулярно-генетическим свойствам осуществляли в соответствии с общепринятыми методами микробиологической диагностики. Ферментативную активность оценивали с помощью коммерческих тест-систем («Remel», «Erba Lachema»). Генетические маркеры изолятов определяли в мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами («АмплиСенс^®»). ПЦР проводили согласно методическим рекомендациям ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора². Для выделения ДНК использовали наборы реагентов, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Экстракцию ДНК из каждого клинического образца проводили в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL). Амплификацию с флюоресцентной детекцией проводили в режиме реального времени с помощью комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F. Выделенные чистые культуры Candida spp. хранили на скошенном агаре Сабуро в пробирках при 4–6ºС.

Всего было получено 52 изолята грибов рода Candida, в том числе C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei (табл. 1). В форме монокультур было выделено 18 изолятов, а также 34 коизолята, которые образовали 16 гомогенных ассоциаций, включающих штаммы только одного вида, и 18 — гетерогенных, состоящих из грибов различных видов. Для удобства анализа C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei были объединены в группу C. non-albicans.

 

Таблица 1. Характеристика изолятов грибов рода Candida, выделенных из ротоглотки ВИЧ-инфицированных пациентов

Table 1. Characteristics of isolates of Candida spp. isolated from the oropharynx of HIV-infected patients

Виды грибов Fungi species	Всего Total	Монокультуры Monocultures		Ассоциации | Communities
				всего total		гомогенные homogeneous		гетерогенные heterogeneous
		абс. | abs.	%	абс. | abs.	%	абс. | abs.	%	абс. | abs.	%
C. albicans	30	8	26,7	22	73,3	16	53,3	6	20,0
C. non-albicans	22	10	45,5	12	54,5	0	0,0	12	54,5
в том числе | including C. glabrata	11	7	63,6	4	36,4	0	0,0	4	36,4
C. tropicalis	6	3	50,0	3	50,0	0	0,0	3	50,0
C. krusei	5	0	0,0	5	100,0	0	0,0	5	100,0
Итого | Total	52	18	34,6	34	65,4	16	30,8	18	34,6

 

Чувствительность выделенных изолятов грибов рода Candida к антимикотическим препаратам определяли стандартным диско-диффузионным методом. Использовали бумажные диски («Oxoid») диаметром 6 мм, пропитанные антимикотическими препаратами, и плотную питательную среду Мюллера–Хинтона, содержащую 2% глюкозы и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего. В качестве инокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp. в концентрации 0,5 ЕД по McFarland. Посевы инкубировали при 35ºС 18–24 ч. Измеряли диаметр зоны задержки роста и оценивали культуры как чувствительные/резистентные к препаратам имидазолового (клотримазол, кетоконазол), триазолового (итраконазол, флуконазол) и полиенового (нистатин, амфотерицин В) рядов.

Результаты исследования подвергали стандартной статистической обработке с помощью программы «Statistica v. 6.0» («StatSoft»). Для сравнительного анализа применяли непараметрические методы Манна–Уитни и χ². Критерием статистической достоверности различия получаемых данных считали общепринятую в биологии и медицине величину ошибки р < 0,05 [25].

Результаты

Среди изолятов C. albicans, выделенных в форме монокультуры, резистентность к триазолам экспрессировалась в 3,02 раза чаще (p < 0,01), чем к полиенам, и в 2,21 раза чаще (p < 0,05), чем к имидазолам (табл. 2). При этом имидазолы и полиены отличались по этой характеристике в 1,36 раза (p > 0,05). Монокультурные изоляты C. albicans были чувствительны к обоим полиеновым препаратам и клотримазолу (87,5–100,0%) и относительно устойчивы к триазолам, особенно к флуконазолу (25,0%).

 

Таблица 2. Доля чувствительных к антимикотическим препаратам штаммов в различных группах изолятов грибов рода Candida, %

Table 2. The percentage of sensitive to antimycotic drugs strains in different groups of Candida spp. isolates, %

Виды грибов Fungi species	Форма Form	Количество изолятов Number of isolates	Имидазолы | Imidazoles			Триазолы | Triazoles			Полиены | Polyenes
			клотримазол clotrimazole	кетоконазол ketoconazole	сумма по 2 препаратам sum for 2 drugs	итраконазол itraconazole	флуконазол fluconazole	сумма по 2 препаратам sum for 2 drugs	нистатин nystatin	амфотерицин В аmphotericin B	сумма по 2 препаратам sum for 2 drugs
C. albicans	Монокультуры Monocultures	8	87,5	50,0	68,8	37,5	25,0	31,1	100,0	87,5	93,8
	Гомогенные ассоциации Homogeneous communities	16	62,5	62,5	62,5	37,5	25,0	31,3	100,0	81,3	90,6
	Гетерогенные ассоциации Heterogeneous communities	6	16,7	33,3	25,0	16,7	16,7	16,7	83,3	50,0	66,7
C. non-albicans	Монокультуры Monocultures	10	60,0	50,0	55,0	30,0	30,0	30,0	90,0	40,0	65,0
	Гетерогенные ассоциации Heterogeneous communities	12	50,0	41,7	45,8	66,7	16,7	41,7	75,0	66,7	70,8

 

Изоляты C. albicans, выделенные в форме гомогенных ассоциаций, чаще всего были чувствительны к препаратам полиенового ряда и реже — к триазолам, особенно флуконазолу. При этом чувствительность к полиенам в данной группе микробов встречалась в 1,45 раза чаще (p < 0,05), чем к имидазолам, а к триазолам — в 2,89 раза (p < 0,001). Количество штаммов, чувствительных к действию имидазолов, двукратно превосходило число чувствительных к триазолам (p < 0,05). Изоляты C. albicans этой формы микробного сообщества значимо не отличались по чувствительности к отдельным представителям тестированных фармакологических групп.

В группе C. albicans, выделенных в форме гетерогенных ассоциаций, отмечалась низкая экспрессия чувствительности к препаратам азолового ряда. Частота обнаружения штаммов, чувствительных к триазолам, была ниже, чем к полиенам, в 3,99 раза (p < 0,05), а к имидазолам — в 2,67 раза (p < 0,05). При этом имидазолы и триазолы практически не различались по эффективности.

Сравнительный анализ показал, что изоляты C. albicans, выделенные в форме гомогенных ассоциаций, не отличались от монокультурных по распространению чувствительности как к отдельным антимикотическим препаратам, так и к фармацевтическим группам. C. albicans, представители гетерогенных ассоциаций, отличались от монокультурных изолятов и компонентов гомогенных ассоциаций резким снижением чувствительности к имидазолам в целом (в 2,75 и 2,50 раза соответственно; p < 0,05), и в частности к клотримазолу (в 5,24 и 3,74 раза соответственно; p < 0,05).

Монокультурные штаммы C. non-albicans были высокочувствительны к полиенам, и в первую очередь к нистатину, а резистентны — к обоим триазоловым препаратам. Группа C. non-albicans, выделенная в форме гетерогенных ассоциаций, оказалась высокочувствительной к полиенам, и особенно к нистатину. Чувствительные к полиенам изоляты встречались в 1,55 раза чаще (p > 0,05), чем к имидазолам, и 1,70 (p < 0,05) — к триазолам. Эффекты имидазолов не отличались по данной характеристике от триазолов. Число изолятов, чувствительных к итраконазолу, было в 3,99 раза выше (p < 0,05), чем к флуконазолу.

Монокультурные штаммы C.non-albicans статистически значимо не отличались от компонентов гетерогенных ассоциаций по экспрессии резистентности к антимикотикам. Однако среди последних в 2,22 раза чаще встречались штаммы, чувствительные к итраконазолу, и 1,67 раза — к амфотерицину В, а также в 1,80 раза реже — чувствительные к флуконазолу (во всех случаях p > 0,05).

Монокультурные штаммы C. non-albicans в основном сохраняли тенденции, характерные для C. albicans. Однако штаммы C. non-albicans оказались в 2,19 раза реже чувствительны к амфотерицину В (p < 0,05). Для популяции C. non-albicans, компонентов гетерогенных ассоциаций, по сравнению с C. albicans аналогичной формы персистенции, было характерно почти трёхкратное повышение экспрессии чувствительности к клотримазолу (p < 0,05) и четырёхкратное — к итраконазолу (p < 0,05).

Обсуждение

Таким образом, в ходе исследования коллекции изолятов грибов рода Candida, выделенных из ротоглотки ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими проявлениями орофарингеального кандидоза, мы установили, что чувствительность C. albicans к антимикотическим препаратам зависит от архитектуры микробного сообщества. Так, среди грибов данного вида заметно выделялись компоненты гетерогенных ассоциаций. Их отличала низкая чувствительность к имидазолам, итраконозолу и амфотерицину В. В то же время в группе монокультурных изолятов доля резистентных к имидазолу штаммов была сопоставима с таковой к полиенам, а компоненты гомогенных ассоциаций практически не отличались от монокультурных.

Исследование, выполненное на группе C. non-albicans, взятой для сравнения, подтвердило зависимость чувствительности к антимикротическим препаратам от структуры микробного сообщества. Однако сопоставление популяций C. albicans и C. non-albicans по данной характеристике выявило их определённые различия. В частности, монокультурные изоляты C. non-albicans заметно чаще экспрессировали резистентность к амфотерицину В, а компоненты гетерогенных ассоциаций — чувствительность к клотримазолу и итраконазолу. Данные факты указывают на значимость архитектуры микробного сообщества грибов рода Candida в их межвидовой дифференциации. Между тем, общим для всех форм микробного сообщества как C. albicans, так и C. non-albicans, была высокая доля штаммов, резистентных к флуконазолу. В целом популяция C. albicans характеризовалась более высокой гетерогенностью в отношении чувствительности к антимикотикам, чем C. non-albicans. Отмеченный факт может быть следствием более высокой адаптивности вида C. albicans к факторам среды обитания по сравнению с последними [26].

Обнаруженные факты подтверждают отмеченную ранее значимость структуры микробных сообществ внутренних биотопов тела человека в патогенезе патологических процессов [16, 17]. Это подчёркивает важность изучения архитектуры микробных сообществ. Детальный анализ полученного материала показал, что архитектура сообщества грибов рода Candida — не случайное событие, а закономерность, с которой проявляются биологические свойства микроба.

Совершенно очевидно, что структура микробного сообщества может лишь частично объяснить различия микробов по чувствительности к антимикотическим средствам. Вполне вероятно, что наблюдаемые эффекты могут быть напрямую связаны с характерной способностью Candida spp. образовывать биоплёнки [11, 13, 14]. Данный вопрос может быть решён в ходе направленных экспериментальных исследований. Кроме того, представляется целесообразным определить роль самого макроорганизма ВИЧ-инфицированных пациентов в формировании архитектуры рассматриваемого сообщества, а также вклад межмикробных взаимодействий в распространение лекарственной устойчивости среди грибов Candida spp.

Помимо чисто научного интереса, проведённое исследование имеет важное практическое значение, особенно для клиники ВИЧ-инфицированных пациентов, осложнённой орофарингеальным кандидозом. В частности, мы подтвердили, высокую эффективность полиенов, в том числе нистатина, в лечении кандидозной инфекции у этих больных. В то же время, по нашим данным, к флюконазолу наиболее часто наблюдалась резистентность, на что неоднократно указывалось ранее [15, 22, 24]. Кроме того, при подборе эффективной антимикотической терапии для таких пациентов необходимо учитывать структуру сообщества Candida spp. в ротоглотке, особенно в случае обнаружения гетерогенных ассоциаций.

Выводы

1. Архитектура сообщества грибов рода Candida, выделенных из ротоглотки ВИЧ-инфицированных пациентов с клиническими проявлениями орофарингеального кандидоза, влияет на их чувствительность к антимикотическим препаратам.
2. При подборе эффективной антимикотической терапии для таких пациентов необходимо учитывать структуру сообщества Candida spp. в ротоглотке.

Этическое утверждение. Протокол исследования одобрен Комитетом по этике при Южно-Уральском государственном медицинском университете (протокол № 4 от 25.04.2014). У всех пациентов, включённых в исследование, было получено добровольное информированное согласие на использование данных лабораторных анализов в научных целях.

 

¹ Приказ Минздравсоцразвития России от 17.03.2006 № 166 «Российская клиническая классификация ВИЧ-инфекции».

² Методические рекомендации «Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией». URL: https://www.amplisens.ru/upload/iblock/db2/MR%20IPPP-FL.pdf

About the authors

Yuri V. Nesvizhsky

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Russia; G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0386-3883

D. Sci. (Med.), Professor, Department of microbiology, virology and immunology, chief researcher

Россия, Moscow; Moscow

Alexander D. Voropaev

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6431-811X

postgraduate student, Department of microbiology, virology and immunology

Россия, Moscow

Stanislav S. Afanasiev

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: afanasievss409.4@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-6497-1795

D. Sci. (Med.), Professor, chief researcher, deputy director for biotechnology

Россия, Moscow

Elena V. Volchkova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4581-4510

D. Sci. (Med.), Professor, Department of infectious diseases

Россия, Moscow

Maxim S. Afanasiev

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5860-4152

D. Sci. (Med.), Professor, Department of clinical allergology and immunology

Россия, Moscow

Elena A. Voropaeva

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0463-0136

D. Sci. (Biol.), Professor, chief researcher

Россия, Moscow

Mariam E. Suleimanova

Petrovsky National Research Center of Surgery

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9255-6481

resident

Россия, Moscow

Elena V. Budanova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1864-5635

Сand. Sci. (Med.), Associated Professor, Department of microbiology, virology and immunology

Россия, Moscow

Yulia N. Urban

G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: nesviz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0189-3608

Сand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of clinical microbiology and biotechnology

Россия, Moscow

References

Supplementary files