Comparative study of the biological properties of influenza А virus mutants obtained by site-specific mutagenesis and the live influenza reassortant vaccine variant

Full Text

Ввeдение

Накопленный к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ха) живой гриппозной вакцины в России и США продемонстрировал высокую эффективность этого препарата при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. В отличие от инактивированных гриппозных вакцин, живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами вируса гриппа. Классические живые гриппозные вакцины представляют собой реассортанты, имеющие гены, кодирующие «внутренние» белки от ха-штаммов — доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), А/Энн Арбор/6/60 (Н2N2), A/Краснодар/101/35/59 (Н2N2), и гены, кодирующие поверхностные гликопротеины от антигенно-актуальных эпидемических штаммов вируса гриппа. В последнее время значительный интерес среди исследователей вызывает генно-инженерный подход к получению живых гриппозных вакцин, предполагающий прямое включение заранее известных и охарактеризованных чувствительных к температуре (temperature-sensitive — ts) мутаций, присутствующих в геноме штаммов-доноров аттенуации, которые в дальнейшем клонируются в геном вирулентного штамма вируса гриппа. Данные литературы свидетельствуют о том, что использование технологии сайт-специфического мутагенеза может значительно продвинуть разработку живых гриппозных вакцин как в медицине, так и в ветеринарии [1–12]. В НИИВС им. И.И. Мечникова была получена большая панель сайт-специфических мутантов (ССМ) вируса гриппа серотипа Н1N1 с использованием мультиплазмидной системы на базе плазмид pHW2000, содержащих гены штамма A/WSN/33 (H1N1). Исследование ts- и att (attenuated)-фенотипа полученных мутантов показало их высокий аттенуационный потенциал.

Цель работы — сравнительное изучение свойств двух ССМ — U2 и M26, имеющих ts-мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, и ха-реассортанта, полученного по классической технологии и имеющего 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ха-донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2), и 2 гена, кодирующих поверхностные белки НА и NA от вирулентного штамма А/WSN/33 (H1N1).

Материалы и методы

Вирусы

Вирулентный штамм А/WSN/33 (H1N1) получен из Государственной коллекции вирусов при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. При изучении генетической стабильности использовали группу ССМ, полученных с помощью мультиплазмидной системы на базе плазмид pHW2000, содержащих гены штамма А/WSN/33(H1N1), предоставленной доктором Р. Вебстером (Мемфис, США). Для исследований использовали ССМ U2 и M26, а также ха-реассортант между штаммами А/WSN/33 (H1N1) и А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2). ССМ U2 имел 3 ts-мутации в гене РВ2, полученные из генома ха-штаммов-доноров А/Энн Арбор/6/60, А/Ленинград/134/17/57 и А/Краснодар/101/35/59. ССМ M26 имел 3 ts-мутации в гене РВ1, полученные от штамма А/Энн Арбор/6/60, 1 ts-мутацию в гене РВ2 от штамма А/Краснодар/101/35/549 и 1 ts-мутацию в гене РА (аминокислотные замены и их позиции указаны в табл. 1).

 

Таблица 1. ССМ штамма А/WSN/33 (H1N1)

Table 1. Site-specific mutants of the A/WSN/33 (H1N1)

Номер трансфектанта Number of transfectant	Ген Gene	Штамм-донор (Н2N2) Donor strain (H2N2)	Аминокислотные замены Amino acid replacement
3	РВ1	A/Krasnodar/101/35/59	I147T
4	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59	N265S
			М290L
21	РВ1	A/Krasnodar/101/35/59 A/WSN/33 (H1N1)	I147T
	PA		F658A
13 LAK-2	РВ2	A/Krasnodar/101/35/59 A/Leningrad/134/17/57	V290L V478L
14 ААК -2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59	N265S V290L
15 LAK-2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Leningrad/134/17/57	N265S V478L
16 U2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59, A/Leningrad/134/17/57	N265S V290L V478L
17 M26	РВ1	A/Ann Arbor/6/60	K391E E581G E457D
	РВ2	A/Krasnodar/101/35/59	V290L
	РА	A/WSN/33 (H1N1)	F658A

 

Клеточные культуры

В работе использовали перевиваемую культуру эпителиальных клеток почек собаки Madin–Darby Canine Kidney (MDCK) и культуру клеток аденокарциномы лёгкого человека А549. Все использованные в работе вирусы и ССМ поддерживали путём пассажей в 9–11-дневных куриных эмбрионах («СГЦ Загорское ЭПХ»).

Изучение генетической стабильности ССМ штамма А/WSN/33

Клеточную культуру MDCK инфицировали исследуемыми вирусами с расчётом коэффициента множественности заражения, равном 0,01 средней эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД₅₀) на 0,2 мл на одну клетку тканевой культуры, и инкубировали в диапазоне температур 34–39ºС. Через 72 ч супернатанты отбирали из культуры клеток, где наблюдалось цитопатическое действие вируса. У вирусов, присутствующих в этих супернатантах, было исследовано изменение ts-фенотипа методом заражения куриных 10-дневных эмбрионов при разных температурах. Поскольку способность к генетическим изменениям, которые вызывали изменение ts-фенотипа, могла быть достаточно низкой, а также могла варьировать, эксперименты проводили несколько раз для каждого мутанта. Мутант считался генетически стабильным, если соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºC/34ºC было не ниже 1 : 500 [1].

Иммунизация мышей

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986. На проведение исследования получено разрешение этического комитета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечниковa (протокол № 6 от 02.04.2018). Беспородные мыши-самки массой 10–12 г получены из питомника РАН «Андреевка». Иммунизацию проводили интраназально под лёгким эфирным наркозом вирусами в инфекционном титре 10^5.0 ЭИД₅₀/0,2 мл в дозе 50 мкл на мышь, вторая иммунизация была через 21 день после первой. Забор крови у мышей производили через 21 день после 1-й иммунизации и через 10 дней после 2-й иммунизации. В эксперименте было 4 группы животных по 12 особей. Первую группу иммунизировали мутантом U2, 2-ю — мутантом M26, 3-ю — ха-реассортантом, 4-ю (контрольную) — физиологическим раствором.

Иммуноферментный анализ

В работе использовали общелабораторные и химические реагенты: 3,3'-, 5,5'-тетраметилбензидин, компоненты буферных растворов («Sigma», «Fluka», «Хеликон»). Для приготовления растворов брали деионизованную воду («Milli-Q System», «Millipore»). Для иммуноферментного анализа (ИФА) использовали прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты («Corning-Costar») с иммобилизованными препаратами вируса гриппа. В лунки планшета вносили по 100 мкл сывороток крови иммунизированных мышей и мышей контрольной группы в разведении от 1 : 400 до 1 : 409 600, выдерживали на шейкере при 37ºС, скорости вращения 700 об/мин в течение 60 мин. Каждый образец анализировали в 2 лунках. После отмывки в лунки планшета вносили по 100 мкл антител кролика к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой (А 9044, «Sigma») и повторяли этап инкубации. Затем вносили по 100 мкл 33 мМ цитратного буферного раствора рН 4,0, содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5 мМ 3,3'-, 5,5'-тетраметилбензидина. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,5 М серной кислоты, измеряли оптическую плотность в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм.

Результаты выявления антител в ИФА представляли в виде титров, которые определяли как последнее разведение образца, в котором ОП_{образца} ≥ ОП_ср.К × 2, где ОП_ср.К — среднее арифметическое значение регистрируемого сигнала для образцов контрольной группы.

Реакция торможения гемагглютинации

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили согласно Методическому указанию МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 28.09.2003). В качестве антигенов в РТГА использовали мутант U2, мутант M26 и ха-реассортант. Для постановки РТГА сыворотки прогревали в течение 30 мин при 56ºС для разрушения термолабильных ингибиторов. Результаты выявления антител в РТГА представляли в виде титров, которые определяли как последнее разведение образца сыворотки, при котором отсутствовала агглютинация эритроцитов.

Сравнительное изучение интерфероногенности мутантов U2, M26 и ха-реассортанта

Монослой клеток А549 инфицировали вирусами с расчётом коэффициента множественности заражения, равного 0,01 ЭИД₅₀/0,2 мл на одну клетку тканевой культуры, и инкубировали 16 ч в СО₂-инкубаторе. Далее проводили выделение РНК из клеточной культуры при помощи набора «diaGene» («Диаэм»). Для получения кДНК использовали набор реактивов «MMLV RT kit» («Евроген»). Далее проводили полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием праймеров к последовательностям генов, кодирующих интерфероны 1-го типа. Результаты ПЦР-РВ анализировали с помощью программного обеспечения «Microsoft Office Excel 2013». Уровень экспрессии, показывающий, во сколько раз большую экспрессию имеют исследуемые образцы по сравнению с контрольным, неинфицированным образцом, оценивали по формуле:

Нормализованная степень экспрессии = 2^–∆∆CT,

где ∆∆CT = ∆CT_{(инфицированный образец)} – ∆CT_{(неинфицированный образец)};

∆CT = CT_{(исследуемого гена)} – CT_{(гена β-актин)}.

Процесс нормализации экспрессии исследуемого гена с референсным геном компенсирует любые различия в количествах взятых на анализ образцов биологического материала.

Статистический анализ

Данные, полученные в ИФА и РТГА, анализировали с помощью программного обеспечения «Prism 9» и «GraphPad Software». Результаты для каждой группы экспериментальных животных выражали как среднее арифметическое титра ± стандартное отклонение (σ). Критерий Манна–Уитни использовали для сравнения результатов, полученных для разных условий эксперимента. Величина p < 0,05 рассматривалась как статистически значимая.

Результаты

Генетическая стабильность

Генетическая стабильность вакцинных вариантов вируса гриппа является важнейшим условием их безопасного использования для иммунизации людей. В этой связи мы исследовали генетическую стабильность группы полученных нами ССМ штамма А/WSN/33 (H1N1), имеющих различное количество ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, с помощью температурного стресс-теста [1]. Данный тест предварительно был успешно использован для изоляции ts-ревертантов из популяции кандидатов в живые гриппозные вакцины [13, 14]. Данные по генетической стабильности, полученные после заражения клеточной культуры MDCK вакцинными вариантами вируса гриппа, представлены в табл. 2. У исследуемых вирусов, имеющих в геноме одиночные или двойные мутации, наблюдалось резкое изменение ts-фенотипа. В частности, после стресс-теста соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºС/34ºС наблюдалось у мутанта ААК-2 не выше 1 : 30, у мутанта AAL-2 — не выше 1 : 10, у мутанта LAK-2 — не выше 1 : 3. Однако у мутантов U2 и M26, имеющих большее количество ts-мутаций в геноме, не наблюдалось значительных изменений ts-фенотипа. Соотношение титров при shutoff 38ºС/34ºС сохранялось в пределах 1 : 3000–1 : 4000, что свидетельствует о высокой генетической стабильности этих вариантов.

 

Таблица 2. Изучение генетической стабильности ССМ штамма А/WSN/33, имеющих ts-мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Table 2. Study of the genetic stability of site-specific mutants of strain A/WSN/33 with ts-mutations in the genes encoding proteins of the polymerase complex

Исследуемые вирусы Researched viruses	ts-Фенотип мутантов до проведения стресс-теста, lg ЭИД50/0,2 мл ts-Рhenotype of mutants before the stress test, lg EID50/0,2 ml			ts-Фенотип после проведения стресс-теста, lg ЭИД50/0,2 мл ts-Рhenotype after stress test, lg EID50/0,2 ml
	34ºС	38ºС	39ºС	34ºС	38ºС	39ºС
Исходный штамм Original strain А/WSN/33 (H1N1)	6,5 ± 0,3	6,5 ± 0,2	6,2 ± 0,4	6,5 ± 0,4	6,5 ± 0,8	6,2 ± 0,4
AAL-2	6,5 ± 0,4	3,5 ± 0,5	< 1,0	4,5 ± 0,8	3,5 ± 0,7	1,5 ± 0,5
AAK-2	5,5 ± 0,5	3,5 ± 0,4	< 1,0	5,0 ± 0,5	3,5 ± 0,4	2,0 ± 0,4
LAK-2	6,5 ± 0,5	3,0 ± 0,3	< 1,0	5,5 ± 0,2	5,0 ± 0,5	2,5 ± 0,2
U-2	6,5 ± 0,3	2,0 ± 0,4	< 1,0	4,5 ± 0,5	1,0 ± 0,5	< 1,0
M26	6,0 ± 0,5	2,0 ± 0,4	< 1,0	6,0 ± 0,4	2,0 ± 0,3	< 1,0
Трансфектант № 3 | Transfectant No. 3	6,5 ± 0,3	3,0 ± 0,3	< 1,0	6,0 ± 0,5	5,5 ± 0,4	2,0 ± 0,4
Трансфектант № 4 | Transfectant No. 4	5,5 ± 0,6	3,0 ± 0,5	< 1,0	5,5 ± 0,5	3,5 ± 0,4	1,0 ± 0,5

 

Иммуногенность

Проведено сравнительное изучение способности ССМ U2 и M26, а также ха-реассортанта индуцировать гуморальный иммунитет путём интраназальной иммунизации мышей исследуемыми вирусами.

На рис. 1 и рис. 2 представлены результаты, полученные в РТГА и ИФА. Результаты свидетельствуют о том, что как после 1-й, так и после 2-й иммунизации ССМ способствовали более высокой выработке сывороточных антител, чем ха-реассортант. Наиболее отчётливо эта разница проявилась в результатах ИФА. По сравнению с ха-реассортантом мутант M26 показал в 4 и 8 раз больший титр после 1-й и 2-й иммунизаций соответственно; для мутанта U2 наблюдалась разница в 2 и 4 раза (p < 0,01).

 

Рис. 1. Титры антител ССМ и ха-реассортанта в РТГА после интраназальной иммунизации. *p < 0,01.

 

Рис. 2. Титры антител ССМ и ха-реассортанта в ИФА после интраназальной иммунизации. *p < 0,01.

 

Сравнительное изучение интерфероногенности

Исследована способность ССМ U2 и M26, а также ха-реассортанта индуцировать интерфероны 1-го типа, а именно: α-1, α-2, α-4 и β в клеточной культуре А549. ССМ способствовали повышению интерферона 1-го типа в большей степени, чем ха-реассортант (рис. 3). Мутанты U2 и M26 индуцировали α-1 в 2,2 и 3,6 раза соответственно больше по сравнению с контролем. В свою очередь экспрессия интерферона-β показала превышение в 11,3 и 15,4 раза над контролем для мутантов U2 и M26 соответственно, что является наибольшим значением для группы исследуемых интерферонов.

 

Рис. 3. Влияние ССМ и ха-реассортанта на способность индуцировать интерферон α-1, α-2, α-4 и β клетками карциномы лёгочной ткани человека А549.

 

Обсуждение

Генетическая стабильность вакцинных вариантов вируса гриппа является важнейшим условием их безопасного использования для иммунизации населения. У мутантов U2 и M26 после проведения температурного стресс-теста не наблюдалось изменения ts-фенотипа. Соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºC/34ºC у данных мутантов свидетельствует об их высокой генетической стабильности. Как показали результаты сравнительного изучения иммуногенности ССМ U2, M26 и ха-реассортанта, ССМ способствовали более высокой выработке сывороточных антител, чем ха-реассортант. Интересно отметить способность мутанта M26 индуцировать более высокие титры сывороточных антител по сравнению с мутантом U2 в ИФА, в то же время в РТГА наблюдались одинаковые титры сывороточных антител для ССМ после 2-й иммунизации. Можно предположить, что мутант M26 в результате иммунизации приводит к синтезу большого количества дефектного белка. Антитела, образуемые в ответ на синтез дефектного белка, теряют способность к нейтрализации в РТГА, однако в ИФА продолжают детектироваться.

Сравнительное изучение интерфероногенности исследуемых вирусов показало, что ССМ U2 и M26 способствуют повышению уровня интерферонов 1-го типа в клетках А549 в большей степени, чем ха-реассортант, что свидетельствует о более активной стимуляции мутантами клеточного иммунитета. Ранее мы показали высокую защитную эффективность данных ССМ вируса гриппа при гомологичном и гетерологичном контрольном заражении [11]. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что ССМ вируса гриппа типа А серотипа Н1N1, обладающие соответствующим набором ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, можно рассматривать как кандидаты в живые гриппозные вакцины.

About the authors

Bogdan S. Cherepovich

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: bogdancherepovich@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5803-6263

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

Russian Federation, Moscow

Artem A. Rtishchev

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: rtishchevartyom@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4212-5093

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

Russian Federation, Moscow

Irina I. Akopova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: ii_akopova@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1795-4356

leading researcher, Laboratory of RNA viruses

Russian Federation, Moscow

Olga V. Borisova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: olvb@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7664-2945

Cand. Sci. (Chem.), Head, Laboratory of medical biotechnology

Russian Federation, Moscow

Vladimir Y. Kost

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: goron.dekar@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1703-2685

researcher, Laboratory of molecular toxicology

Russian Federation, Moscow

Nina M. Kutuzova

Moscow State Pedagogical University

Email: nm.kutuzova@mpgu.su
ORCID iD: 0000-0002-5963-9525

D. Sci. (Biol.), Professor, Head, Department of biochemistry, molecular biology and genetics

Russian Federation, Moscow

Stanislav G. Markushin

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: s.g.markushin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0994-5337

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of genetics of RNA-containing viruses

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files