Comparative study of the biological properties of influenza А virus mutants obtained by site-specific mutagenesis and the live influenza reassortant vaccine variant

Full Text

Ввeдение

Накопленный к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ха) живой гриппозной вакцины в России и США продемонстрировал высокую эффективность этого препарата при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. В отличие от инактивированных гриппозных вакцин, живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами вируса гриппа. Классические живые гриппозные вакцины представляют собой реассортанты, имеющие гены, кодирующие «внутренние» белки от ха-штаммов — доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2), А/Энн Арбор/6/60 (Н2N2), A/Краснодар/101/35/59 (Н2N2), и гены, кодирующие поверхностные гликопротеины от антигенно-актуальных эпидемических штаммов вируса гриппа. В последнее время значительный интерес среди исследователей вызывает генно-инженерный подход к получению живых гриппозных вакцин, предполагающий прямое включение заранее известных и охарактеризованных чувствительных к температуре (temperature-sensitive — ts) мутаций, присутствующих в геноме штаммов-доноров аттенуации, которые в дальнейшем клонируются в геном вирулентного штамма вируса гриппа. Данные литературы свидетельствуют о том, что использование технологии сайт-специфического мутагенеза может значительно продвинуть разработку живых гриппозных вакцин как в медицине, так и в ветеринарии [1–12]. В НИИВС им. И.И. Мечникова была получена большая панель сайт-специфических мутантов (ССМ) вируса гриппа серотипа Н1N1 с использованием мультиплазмидной системы на базе плазмид pHW2000, содержащих гены штамма A/WSN/33 (H1N1). Исследование ts- и att (attenuated)-фенотипа полученных мутантов показало их высокий аттенуационный потенциал.

Цель работы — сравнительное изучение свойств двух ССМ — U2 и M26, имеющих ts-мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, и ха-реассортанта, полученного по классической технологии и имеющего 6 генов, кодирующих «внутренние» белки от ха-донора аттенуации А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2), и 2 гена, кодирующих поверхностные белки НА и NA от вирулентного штамма А/WSN/33 (H1N1).

Материалы и методы

Вирусы

Вирулентный штамм А/WSN/33 (H1N1) получен из Государственной коллекции вирусов при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. При изучении генетической стабильности использовали группу ССМ, полученных с помощью мультиплазмидной системы на базе плазмид pHW2000, содержащих гены штамма А/WSN/33(H1N1), предоставленной доктором Р. Вебстером (Мемфис, США). Для исследований использовали ССМ U2 и M26, а также ха-реассортант между штаммами А/WSN/33 (H1N1) и А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2). ССМ U2 имел 3 ts-мутации в гене РВ2, полученные из генома ха-штаммов-доноров А/Энн Арбор/6/60, А/Ленинград/134/17/57 и А/Краснодар/101/35/59. ССМ M26 имел 3 ts-мутации в гене РВ1, полученные от штамма А/Энн Арбор/6/60, 1 ts-мутацию в гене РВ2 от штамма А/Краснодар/101/35/549 и 1 ts-мутацию в гене РА (аминокислотные замены и их позиции указаны в табл. 1).

 

Таблица 1. ССМ штамма А/WSN/33 (H1N1)

Table 1. Site-specific mutants of the A/WSN/33 (H1N1)

Номер трансфектанта Number of transfectant	Ген Gene	Штамм-донор (Н2N2) Donor strain (H2N2)	Аминокислотные замены Amino acid replacement
3	РВ1	A/Krasnodar/101/35/59	I147T
4	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59	N265S
			М290L
21	РВ1	A/Krasnodar/101/35/59 A/WSN/33 (H1N1)	I147T
	PA		F658A
13 LAK-2	РВ2	A/Krasnodar/101/35/59 A/Leningrad/134/17/57	V290L V478L
14 ААК -2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59	N265S V290L
15 LAK-2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Leningrad/134/17/57	N265S V478L
16 U2	РВ2	A/Ann Arbor/6/60 A/Krasnodar/101/35/59, A/Leningrad/134/17/57	N265S V290L V478L
17 M26	РВ1	A/Ann Arbor/6/60	K391E E581G E457D
	РВ2	A/Krasnodar/101/35/59	V290L
	РА	A/WSN/33 (H1N1)	F658A

 

Клеточные культуры

В работе использовали перевиваемую культуру эпителиальных клеток почек собаки Madin–Darby Canine Kidney (MDCK) и культуру клеток аденокарциномы лёгкого человека А549. Все использованные в работе вирусы и ССМ поддерживали путём пассажей в 9–11-дневных куриных эмбрионах («СГЦ Загорское ЭПХ»).

Изучение генетической стабильности ССМ штамма А/WSN/33

Клеточную культуру MDCK инфицировали исследуемыми вирусами с расчётом коэффициента множественности заражения, равном 0,01 средней эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД₅₀) на 0,2 мл на одну клетку тканевой культуры, и инкубировали в диапазоне температур 34–39ºС. Через 72 ч супернатанты отбирали из культуры клеток, где наблюдалось цитопатическое действие вируса. У вирусов, присутствующих в этих супернатантах, было исследовано изменение ts-фенотипа методом заражения куриных 10-дневных эмбрионов при разных температурах. Поскольку способность к генетическим изменениям, которые вызывали изменение ts-фенотипа, могла быть достаточно низкой, а также могла варьировать, эксперименты проводили несколько раз для каждого мутанта. Мутант считался генетически стабильным, если соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºC/34ºC было не ниже 1 : 500 [1].

Иммунизация мышей

Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986. На проведение исследования получено разрешение этического комитета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечниковa (протокол № 6 от 02.04.2018). Беспородные мыши-самки массой 10–12 г получены из питомника РАН «Андреевка». Иммунизацию проводили интраназально под лёгким эфирным наркозом вирусами в инфекционном титре 10^5.0 ЭИД₅₀/0,2 мл в дозе 50 мкл на мышь, вторая иммунизация была через 21 день после первой. Забор крови у мышей производили через 21 день после 1-й иммунизации и через 10 дней после 2-й иммунизации. В эксперименте было 4 группы животных по 12 особей. Первую группу иммунизировали мутантом U2, 2-ю — мутантом M26, 3-ю — ха-реассортантом, 4-ю (контрольную) — физиологическим раствором.

Иммуноферментный анализ

В работе использовали общелабораторные и химические реагенты: 3,3'-, 5,5'-тетраметилбензидин, компоненты буферных растворов («Sigma», «Fluka», «Хеликон»). Для приготовления растворов брали деионизованную воду («Milli-Q System», «Millipore»). Для иммуноферментного анализа (ИФА) использовали прозрачные полистироловые 96-луночные планшеты («Corning-Costar») с иммобилизованными препаратами вируса гриппа. В лунки планшета вносили по 100 мкл сывороток крови иммунизированных мышей и мышей контрольной группы в разведении от 1 : 400 до 1 : 409 600, выдерживали на шейкере при 37ºС, скорости вращения 700 об/мин в течение 60 мин. Каждый образец анализировали в 2 лунках. После отмывки в лунки планшета вносили по 100 мкл антител кролика к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой (А 9044, «Sigma») и повторяли этап инкубации. Затем вносили по 100 мкл 33 мМ цитратного буферного раствора рН 4,0, содержащего 0,01% перекиси водорода и 0,5 мМ 3,3'-, 5,5'-тетраметилбензидина. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,5 М серной кислоты, измеряли оптическую плотность в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм.

Результаты выявления антител в ИФА представляли в виде титров, которые определяли как последнее разведение образца, в котором ОП_{образца} ≥ ОП_ср.К × 2, где ОП_ср.К — среднее арифметическое значение регистрируемого сигнала для образцов контрольной группы.

Реакция торможения гемагглютинации

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили согласно Методическому указанию МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 28.09.2003). В качестве антигенов в РТГА использовали мутант U2, мутант M26 и ха-реассортант. Для постановки РТГА сыворотки прогревали в течение 30 мин при 56ºС для разрушения термолабильных ингибиторов. Результаты выявления антител в РТГА представляли в виде титров, которые определяли как последнее разведение образца сыворотки, при котором отсутствовала агглютинация эритроцитов.

Сравнительное изучение интерфероногенности мутантов U2, M26 и ха-реассортанта

Монослой клеток А549 инфицировали вирусами с расчётом коэффициента множественности заражения, равного 0,01 ЭИД₅₀/0,2 мл на одну клетку тканевой культуры, и инкубировали 16 ч в СО₂-инкубаторе. Далее проводили выделение РНК из клеточной культуры при помощи набора «diaGene» («Диаэм»). Для получения кДНК использовали набор реактивов «MMLV RT kit» («Евроген»). Далее проводили полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием праймеров к последовательностям генов, кодирующих интерфероны 1-го типа. Результаты ПЦР-РВ анализировали с помощью программного обеспечения «Microsoft Office Excel 2013». Уровень экспрессии, показывающий, во сколько раз большую экспрессию имеют исследуемые образцы по сравнению с контрольным, неинфицированным образцом, оценивали по формуле:

Нормализованная степень экспрессии = 2^–∆∆CT,

где ∆∆CT = ∆CT_{(инфицированный образец)} – ∆CT_{(неинфицированный образец)};

∆CT = CT_{(исследуемого гена)} – CT_{(гена β-актин)}.

Процесс нормализации экспрессии исследуемого гена с референсным геном компенсирует любые различия в количествах взятых на анализ образцов биологического материала.

Статистический анализ

Данные, полученные в ИФА и РТГА, анализировали с помощью программного обеспечения «Prism 9» и «GraphPad Software». Результаты для каждой группы экспериментальных животных выражали как среднее арифметическое титра ± стандартное отклонение (σ). Критерий Манна–Уитни использовали для сравнения результатов, полученных для разных условий эксперимента. Величина p < 0,05 рассматривалась как статистически значимая.

Результаты

Генетическая стабильность

Генетическая стабильность вакцинных вариантов вируса гриппа является важнейшим условием их безопасного использования для иммунизации людей. В этой связи мы исследовали генетическую стабильность группы полученных нами ССМ штамма А/WSN/33 (H1N1), имеющих различное количество ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, с помощью температурного стресс-теста [1]. Данный тест предварительно был успешно использован для изоляции ts-ревертантов из популяции кандидатов в живые гриппозные вакцины [13, 14]. Данные по генетической стабильности, полученные после заражения клеточной культуры MDCK вакцинными вариантами вируса гриппа, представлены в табл. 2. У исследуемых вирусов, имеющих в геноме одиночные или двойные мутации, наблюдалось резкое изменение ts-фенотипа. В частности, после стресс-теста соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºС/34ºС наблюдалось у мутанта ААК-2 не выше 1 : 30, у мутанта AAL-2 — не выше 1 : 10, у мутанта LAK-2 — не выше 1 : 3. Однако у мутантов U2 и M26, имеющих большее количество ts-мутаций в геноме, не наблюдалось значительных изменений ts-фенотипа. Соотношение титров при shutoff 38ºС/34ºС сохранялось в пределах 1 : 3000–1 : 4000, что свидетельствует о высокой генетической стабильности этих вариантов.

 

Таблица 2. Изучение генетической стабильности ССМ штамма А/WSN/33, имеющих ts-мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Table 2. Study of the genetic stability of site-specific mutants of strain A/WSN/33 with ts-mutations in the genes encoding proteins of the polymerase complex

Исследуемые вирусы Researched viruses	ts-Фенотип мутантов до проведения стресс-теста, lg ЭИД50/0,2 мл ts-Рhenotype of mutants before the stress test, lg EID50/0,2 ml			ts-Фенотип после проведения стресс-теста, lg ЭИД50/0,2 мл ts-Рhenotype after stress test, lg EID50/0,2 ml
	34ºС	38ºС	39ºС	34ºС	38ºС	39ºС
Исходный штамм Original strain А/WSN/33 (H1N1)	6,5 ± 0,3	6,5 ± 0,2	6,2 ± 0,4	6,5 ± 0,4	6,5 ± 0,8	6,2 ± 0,4
AAL-2	6,5 ± 0,4	3,5 ± 0,5	< 1,0	4,5 ± 0,8	3,5 ± 0,7	1,5 ± 0,5
AAK-2	5,5 ± 0,5	3,5 ± 0,4	< 1,0	5,0 ± 0,5	3,5 ± 0,4	2,0 ± 0,4
LAK-2	6,5 ± 0,5	3,0 ± 0,3	< 1,0	5,5 ± 0,2	5,0 ± 0,5	2,5 ± 0,2
U-2	6,5 ± 0,3	2,0 ± 0,4	< 1,0	4,5 ± 0,5	1,0 ± 0,5	< 1,0
M26	6,0 ± 0,5	2,0 ± 0,4	< 1,0	6,0 ± 0,4	2,0 ± 0,3	< 1,0
Трансфектант № 3 | Transfectant No. 3	6,5 ± 0,3	3,0 ± 0,3	< 1,0	6,0 ± 0,5	5,5 ± 0,4	2,0 ± 0,4
Трансфектант № 4 | Transfectant No. 4	5,5 ± 0,6	3,0 ± 0,5	< 1,0	5,5 ± 0,5	3,5 ± 0,4	1,0 ± 0,5

 

Иммуногенность

Проведено сравнительное изучение способности ССМ U2 и M26, а также ха-реассортанта индуцировать гуморальный иммунитет путём интраназальной иммунизации мышей исследуемыми вирусами.

На рис. 1 и рис. 2 представлены результаты, полученные в РТГА и ИФА. Результаты свидетельствуют о том, что как после 1-й, так и после 2-й иммунизации ССМ способствовали более высокой выработке сывороточных антител, чем ха-реассортант. Наиболее отчётливо эта разница проявилась в результатах ИФА. По сравнению с ха-реассортантом мутант M26 показал в 4 и 8 раз больший титр после 1-й и 2-й иммунизаций соответственно; для мутанта U2 наблюдалась разница в 2 и 4 раза (p < 0,01).

 

Рис. 1. Титры антител ССМ и ха-реассортанта в РТГА после интраназальной иммунизации. *p < 0,01.

 

Рис. 2. Титры антител ССМ и ха-реассортанта в ИФА после интраназальной иммунизации. *p < 0,01.

 

Сравнительное изучение интерфероногенности

Исследована способность ССМ U2 и M26, а также ха-реассортанта индуцировать интерфероны 1-го типа, а именно: α-1, α-2, α-4 и β в клеточной культуре А549. ССМ способствовали повышению интерферона 1-го типа в большей степени, чем ха-реассортант (рис. 3). Мутанты U2 и M26 индуцировали α-1 в 2,2 и 3,6 раза соответственно больше по сравнению с контролем. В свою очередь экспрессия интерферона-β показала превышение в 11,3 и 15,4 раза над контролем для мутантов U2 и M26 соответственно, что является наибольшим значением для группы исследуемых интерферонов.

 

Рис. 3. Влияние ССМ и ха-реассортанта на способность индуцировать интерферон α-1, α-2, α-4 и β клетками карциномы лёгочной ткани человека А549.

 

Обсуждение

Генетическая стабильность вакцинных вариантов вируса гриппа является важнейшим условием их безопасного использования для иммунизации населения. У мутантов U2 и M26 после проведения температурного стресс-теста не наблюдалось изменения ts-фенотипа. Соотношение титров при пороговых значениях температур 38ºC/34ºC у данных мутантов свидетельствует об их высокой генетической стабильности. Как показали результаты сравнительного изучения иммуногенности ССМ U2, M26 и ха-реассортанта, ССМ способствовали более высокой выработке сывороточных антител, чем ха-реассортант. Интересно отметить способность мутанта M26 индуцировать более высокие титры сывороточных антител по сравнению с мутантом U2 в ИФА, в то же время в РТГА наблюдались одинаковые титры сывороточных антител для ССМ после 2-й иммунизации. Можно предположить, что мутант M26 в результате иммунизации приводит к синтезу большого количества дефектного белка. Антитела, образуемые в ответ на синтез дефектного белка, теряют способность к нейтрализации в РТГА, однако в ИФА продолжают детектироваться.

Сравнительное изучение интерфероногенности исследуемых вирусов показало, что ССМ U2 и M26 способствуют повышению уровня интерферонов 1-го типа в клетках А549 в большей степени, чем ха-реассортант, что свидетельствует о более активной стимуляции мутантами клеточного иммунитета. Ранее мы показали высокую защитную эффективность данных ССМ вируса гриппа при гомологичном и гетерологичном контрольном заражении [11]. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что ССМ вируса гриппа типа А серотипа Н1N1, обладающие соответствующим набором ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, можно рассматривать как кандидаты в живые гриппозные вакцины.

About the authors

Bogdan S. Cherepovich

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: bogdancherepovich@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5803-6263

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

Россия, Moscow

Artem A. Rtishchev

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: rtishchevartyom@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4212-5093

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

Россия, Moscow

Irina I. Akopova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: ii_akopova@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1795-4356

leading researcher, Laboratory of RNA viruses

Россия, Moscow

Olga V. Borisova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: olvb@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7664-2945

Cand. Sci. (Chem.), Head, Laboratory of medical biotechnology

Россия, Moscow

Vladimir Y. Kost

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: goron.dekar@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1703-2685

researcher, Laboratory of molecular toxicology

Россия, Moscow

Nina M. Kutuzova

Moscow State Pedagogical University

Email: nm.kutuzova@mpgu.su
ORCID iD: 0000-0002-5963-9525

D. Sci. (Biol.), Professor, Head, Department of biochemistry, molecular biology and genetics

Россия, Moscow

Stanislav G. Markushin

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: s.g.markushin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0994-5337

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of genetics of RNA-containing viruses

Россия, Moscow

References

Supplementary files