Journal of microbiology, epidemiology and immunobiologyJournal of microbiology, epidemiology and immunobiologyЖурнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии0372-93112686-7613Central Research Institute for Epidemiology116510.36233/0372-9311-239ORIGINAL RESEARCHESОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯResearch ArticleComparative study of the biological properties of influenza А virus mutants obtained by site-specific mutagenesis and the live influenza reassortant vaccine variantСравнительное изучение биологических свойств мутантов вируса гриппа А, полученных с помощью сайт-специфического мутагенеза, и варианта живой гриппозной реассортантной вакциныhttps://orcid.org/0000-0002-5803-6263CherepovichBogdan S.ЧереповичБогдан Сергеевич
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

м.н.с. лаб. РНК-содержащих вирусов

bogdancherepovich@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4212-5093RtishchevArtem A.РтищевАртём Андреевич
Russian Federation

junior researcher, Laboratory of RNA viruses

м.н.с. лаб. РНК-содержащих вирусов

rtishchevartyom@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-1795-4356AkopovaIrina I.АкоповаИрина Ивановна
Russian Federation

leading researcher, Laboratory of RNA viruses

в.н.с. лаб. РНК-содержащих вирусов

ii_akopova@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7664-2945BorisovaOlga V.БорисоваОльга Васильевна
Russian Federation

Cand. Sci. (Chem.), Head, Laboratory of medical biotechnology

к.х.н., зав. лаб. медицинской биотехнологии

olvb@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1703-2685KostVladimir Y.КостВладимир Юрьевич
Russian Federation

researcher, Laboratory of molecular toxicology

н.с. лаб. молекулярной токсикологии

goron.dekar@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5963-9525KutuzovaNina M.КутузоваНина Михайловна
Russian Federation

D. Sci. (Biol.), Professor, Head, Department of biochemistry, molecular biology and genetics

д.б.н., профессор, зав. каф. биохимии, молекулярной биологии и генетики МПГУ

nm.kutuzova@mpgu.suhttps://orcid.org/0000-0003-0994-5337MarkushinStanislav G.МаркушинСтанислав Георгиевич
Russian Federation

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of genetics of RNA-containing viruses

д.м.н., зав. лаб. генетики РНК-содержащих вирусов

s.g.markushin@rambler.ruI. Mechnikov Research Institute for Vaccines and SeraНаучно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. МечниковаShemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RASИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАНMoscow State Pedagogical UniversityМосковский педагогический государственный университет0712202299555756411022022Copyright ©; 2022, Cherepovich B.S., Rtishchev A.A., Akopova I.I., Borisova O.V., Kost V.Y., Kutuzova N.M., Markushin S.G.Copyright ©; 2022, Черепович Б.С., Ртищев А.А., Акопова И.И., Борисова О.В., Кост В.Ю., Кутузова Н.М., Маркушин С.Г.2022Cherepovich B.S., Rtishchev A.A., Akopova I.I., Borisova O.V., Kost V.Y., Kutuzova N.M., Markushin S.G.Черепович Б.С., Ртищев А.А., Акопова И.И., Борисова О.В., Кост В.Ю., Кутузова Н.М., Маркушин С.Г.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1165

The aim of study was to carry out comparative investigation of biological properties of site-specific mutants of Influenza A virus and variant of live cold-adapted (CA) influenza reassortant vaccine.

Materials and methods. The genetic stability of site-specific mutants (SSM) of the A/WSN/33 (H1N1) strain with ts (temperature sensitive)-mutations in polymerase genes was studied using a stress-test in Madin–Darby Canine Kidney (MDCK) culture. A comparative study of immunogenicity of U2 and M26 mutants with the high genetic stability and the CA-reassortant with similar surface proteins was carried out. The increase in the antibody titer was investigated using enzyme-linked immunosorbent assay and the reaction of delayed hemagglutination. Ability of the studied viruses to induce type 1 interferon in A549 cells was determined using real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).

Results. It was shown that U2 and M26 mutants, which have 3 ts-mutations or more in polymerase genes have high genetic stability. It was found that U2 and M26 mutants induced a higher antibody titers than the CA reassortant in mice following the intranasal immunization. The ability of site-specific mutants and CA reassortant to induce type 1 interferon was also investigated. Mutants U2 and M26 increased the level of interferon to a greater extent than the CA-reassortant.

Conclusion. The data obtained indicate that SSM U2 and M26 with 3 ts-mutations or more in the genome have a significant level of genetic stability. Mutants U2 and M26 have a higher immunogenicity and a higher ability to induce interferon in comparison with the CA reassortant. These facts allow us to conclude that SSM of the influenza virus with a set of mutations in polymerase genes can be considered as promising candidates for live influenza vaccines.

Цель исследования — сравнительное изучение биологических свойств сайт-специфических мутантов вируса гриппа А и гриппозной реассортантной вакцины.

Материалы и методы. Для изучения генетической стабильности сайт-специфических мутантов штамма А/WSN/33 вируса гриппа А была использована методика температурного стресс-теста, который проводили в культуре клеток Madin–Darby Canine Kidney (MDCK). Иммуногенность изучали путём интраназальной иммунизации мышей исследуемыми вирусами. Титр антител определяли с помощью реакции торможения гемагглютинации и иммуноферментного анализа. Способность вирусов индуцировать интерферон 1-го типа в клетках A549 выявляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Результаты. Исследована генетическая стабильность сайт-специфических мутантов штамма А/WSN/33 (H1N1) с разным количеством чувствительных к температуре (temperature-sensitive — ts) мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, при помощи стресс-теста в культуре клеток MDCK. Показано, что мутанты U2 и M26, имеющие, соответственно, 3 и 5 ts-мутаций в генах, кодирующих полимеразные белки, обладают высокой генетической стабильностью. Проведено сравнительное изучение способности мутантов U2 и M26, а также холодоадаптированного (ха) реассортанта индуцировать гуморальный иммунитет при интраназальной иммунизации мышей. Обнаружено, что мутанты способствуют более высокой выработке сывороточных антител, чем ха-реассортант. Изучена способность мутантов U2 и M26, а также ха-реассортанта индуцировать экспрессию интерферонов 1-го типа (α-1, α-2, α-4 и интерферон-β) в культуре клеток А549. Показано, что мутанты в большей степени повышают уровень интерферонов 1-го типа по сравнению с ха-реассортантом.

Заключение. Сайт-специфические мутанты вируса гриппа А, имеющие в полимеразных генах 3 и 5 ts-мутаций, показывают высокий уровень генетической стабильности. Они обладают высокой иммуногенностью и индуцируют более высокий уровень интерферона 1-го типа по сравнению с ха-реассортантом. Это позволяет рассматривать сайт-специфические мутанты U2 и M26 в качестве кандидатов в живые гриппозные вакцины.

site-specific mutantsinfluenza virusgenetic stabilityimmunogenicityCA-reassortantinterferonogenicitylive influenza vaccinesвирус гриппасайт-специфические мутантыгенетическая стабильностьиммуногенностьинтерфероногенностьживые гриппозные вакциныНИИВС им. И.И. МечниковаThe I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and SeraParkin N.T., Chiu P., Coelingh K. Genetically engineered live attenuated influenza A virus vaccine candidates. J. Virol. 1997; 71(4): 2772–8. https://doi.org/10.1128/jvi.71.4.2772-2778.1997Subbarao E.K., Park E.J., Lawson C.M., Chen A.Y., Murphy B.R., et al. Sequential addition of temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J. Virol. 1995; 69(10): 5969–77. https://doi.org/10.1128/jvi.69.10.5969-5977.1995Broadbent A.J., Santos C.P., Godbout R.A., Subbarao K. The temperature-sensitive and attenuation phenotypes conferred by mutations in the influenza virus PB2, PB1 and NP genes are influenced by the species of origin of the PB2 gene in reassortant viruses derived from Influenza A/California/07/2009 and A/WSN/33 viruses. J. Virol. 2014; 88(21): 12339–47. https://doi.org/10.1128/jvi.02142-14Song H., Nieto G.R., Perez D.R. A new generation of modified live attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates. J. Virol. 2007; 81(17): 9238–48. https://doi.org/10.1128/jvi.00893-07Hickman D., Hossain M.J., Song H., Araya Y., Solórzano A., Perez D.R. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J. Gen. Virol. 2008; 89(Pt. 11): 2682–90. https://doi.org/10.1099/vir.0.2008/004143-0Solórzano A., Ye J., Pérez D.R. Alternative live-attenuated influenza vaccines based on modifications in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J. Virol. 2010; 84(9): 4587–96. https://doi.org/10.1128/jvi.00101-10Pena L., Vincent A.L., Ye J., Ciacci-Zanella J.R., Angel M., Lorusso A., et al. Modifications in the polymerase genes of a swine-like triple-reassortant influenza virus to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J. Virol. 2011; 85(1): 456–69. https://doi.org/10.1128/jvi.01503-10Pena L., Sutton T., Chockolingam M., Kumar S., Angel M., Shao H., et al. Influenza viruses with rearranged genomes as live-attenuated vaccines. J. Virol. 2013; 87(9): 5118–27. https://doi.org/10.1128/jvi.02490-12Zhou B., Li Y., Speer S.D., Subba A., Lin X., Wentworth D.E. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. Vaccine. 2012; 30(24): 3691–792. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.03.025Kost V., Tsfasman T., Terekhov A., Koptiaeva I.B., Lisovskaya K.V., Markushin S. Attenuation of the cold-adapted (CA) A/Krasnodar/101/35/59 (H2N2) influenza strain. Role of the 147Thr mutation in the PB1 gene. Int. J. Sci. Res. Methodol. 2017; 6(2): 96–114.Tsfasman T., Kost V.Y., Markushin S., Koptyaeva I.B., Akopova I.I., Lisovskaya K.V., et al. Investigation of efficiency of site-specific mutants of the influenza virus in homological and heterological control infection. EC Microbiology. 2017; 12(5): 232–42.Markushin S.G., Rtishchev A.A. Creation of live influenza vaccines with the use of site -specific mutagenesis. Biol. Bull. Rev. 2017; 7(4): 323–32.Murphy B.R., Tolpin M.D., Massicot J.G., Kim H.Y., Parrot R.H., Chanock R.M. Escape of a mutant from its temperature sensitive phenotype by extragenic suppression and other types of mutation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980; 354: 172–82. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1980.tb27966.xMurphy B.R., Tolpin M.D., Massicot J.G., Kim H.Y., Parrott R.H., Chanock R.M. Escape of a mutant from its temperature sensitive phenotype by extragenic suppression and other types of mutation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980; 354: 172–82. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1980.tb27966.x