Effect of trypsin, lidase and fluimucil on the growth of Bordetella pertussis biofilms on an abiotic substrate

Full Text

Введение

Коклюш остаётся актуальной проблемой здравоохранения во всём мире, в том числе в странах с высоким уровнем вакцинации [1–3]. Одной из вероятных причин продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша может быть формирование в респираторном тракте биоплёнок B. pertussis, отличающихся от планктонных клеток повышенной устойчивостью к иммунной системе хозяина, антибактериальным препаратам и другим факторам [4]. В связи с этим важной задачей является разработка методов, направленных на подавление роста биоплёнок B. pertussis и разрушение сформированных биоплёнок в макроорганизме [5]. Полимерный матрикс является важным структурным компонентом биоплёнок, защищающим бактерии от повреждающих факторов внешней среды [6]. Одним из подходов к борьбе с биоплёнками является поиск препаратов, способных разрушать их матрикс, что облегчает доступ антибактериальных препаратов к микробным клеткам и повышает их чувствительность к факторам иммунной системы.

Чувствительность биоплёнок B. pertussis к препаратам, способным разрушать компоненты матрикса в респираторном тракте и на абиотических субстратах, пока изучена недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единичные публикации.

Цель работы — изучение влияния трипсина, лидазы и флуимуцила на рост биоплёнок B. pertussis на абиотическом субстрате.

Материалы и методы

В работе использовали выделенные в России от больных коклюшем в 2001–2010 гг. штаммы № 178 (серовар 1.2.0), № 287 (серовар 1.0.3) и штамм № 317 (серовар 1.2.3). В опытах использовали трипсин кристаллический (ООО «Самсон-Мед»), лидазу (гиалуронидаза; АО «НПО «Микроген»), флуимуцил (N-ацетил-L-цистеин; «Zambon»). Контроль морфологических, серологических и культуральных свойств штаммов проводили в соответствии с Методическими указаниями [7].

В качестве инокулята для получения биоплёнок использовали ночные культуры штаммов, выращенных на плотной питательной среде «Бордетелагар» (Питательная среда для культивирования и выделения коклюшного микроба сухая; ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»). Для образования биоплёнок бактерии культивировали в 96-луночных пластиковых планшетах («Медполимер») в жидкой синтетической питательной среде в соответствии с ранее описанным методом [8]. Культуры штаммов в жидкой синтетической питательной среде в концентрации 10 МОЕ (10 млрд микробных клеток/мл) в объёме 100 мкл вносили в лунки планшетов. После этого в лунки вносили по 100 мкл раствора ферментных препаратов и выдерживали планшеты в термостате при 37ºС в течение 24 ч. Трипсин использовали в концентрациях 100, 10 и 1 мкг/мл, лидазу — 160, 80 и 40 МЕ/мл, флуимуцил — 1000, 100 и 10 мкг/мл. Для изучения влияния препаратов на сформированные биоплёнки в лунки планшетов вносили по 100 мкл культур штаммов при концентрации микробных клеток 10 МОЕ и 100 мкл питательной среды. Планшеты выдерживали в термостате при 37ºС в течение 24 ч, после чего промывали лунки планшетов питательной средой, добавляли в лунки по 0,2 мл раствора препаратов в разных дозах в жидкой питательной среде и инкубировали планшеты в течение 2 ч при 37ºС. После культивирования бактерий из лунок планшетов осторожно отбирали надосадочную жидкость в объёме 0,1 мл и высевали на косяки с плотной питательной средой («Бордетелагар»), которые инкубировали в термостате при 37ºС в течение 2 сут. Интенсивность образования биоплёнок в планшетах оценивали окрашиванием 0,1% раствором генцианвиолета по показателям оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя по отношению к негативному контролю (ОП_К = 0,047), как плотные (ОП ≥ 0,188), умеренные (0,094 ≤ ОП < 0,188), слабые (0,070 ≤ ОП < 0,094), отсутствие биоплёнок (0,047 < ОП < 0,070). Результаты оценивали по значениям доз ферментов, которые определяли как наибольшие их разведения, подавляющие рост биоплёночных культур по сравнению с контролем (слабые биоплёнки или их отсутствие, а также умеренные биоплёнки, по значениям ОП статистически достоверно отличающиеся от контроля). Формирование плотных и умеренных биоплёнок в присутствии ферментов рассматривали как устойчивость к ферментам. Для достоверного обсчёта результатов использовали 5 лунок на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного образца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по t-критерию Стьюдента [9].

Результаты

Контрольные культуры всех исследованных штаммов в данной серии опытов формировали умеренные биоплёнки. Все исследованные штаммы при формировании биоплёнок проявляли чувствительность к трипсину и лидазе (табл. 1, 2). Трипсин в концентрации 100 мкг/мл полностью подавлял рост биоплёнок, а в концентрации 10 мкг/мл также полностью подавлял рост биоплёнок или значительно снижал интенсивность их образования (слабые биоплёнки). При концентрации трипсина 1 мкг/мл отмечен умеренный рост биоплёнок, однако по интенсивности образования данные биоплёнки статистически достоверно отличались от биоплёнок, полученных в контроле (культуры без добавления трипсина). Добавление трипсина к сформированным биоплёнкам приводило к их деструкции. При концентрации трипсина 100 мкг/мл отмечено отсутствие биоплёнок. Биоплёнки регистрировались как слабые у всех 3 штаммов при концентрации трипсина в дозе 10 мкг/мл. При концентрации трипсина 1 мкг/мл все штаммы образовывали умеренные биоплёнки. При этом отмечена статистически достоверная разница по сравнению с контролем.

 

Таблица 1. Влияние препаратов на формирование биоплёнок штаммами B. pertussis

Table 1. Effect of drugs on biofilm formation by B. pertussis strains

Дозы препаратов Doses of drugs	Значения ОП/интенсивность биоплёнок | Optical density values/biofilm intensity
	штаммы (серовар) | strains (serovar)
	№ 317 (1.2.3)	№ 287 (1.0.3)	№ 178 (1.2.0)
Контроль культуры | Culture control	0,181 ± 0,007 умеренная | medium	0,160 ± 0,002 умеренная | medium	0,154 ± 0,001 умеренная | medium
Трипсин, мкг/мл | Trypsin, µg/ml
100	0,045 ± 0,005* нет | no	0,041 ± 0,002* нет | no	0,041 ± 0,002* нет | no
10	0,061 ± 0,015* слабая | weak	0,054 ± 0,001* нет | no	0,071 ± 0,001* слабая | weak
1	0,113 ± 0,007* умеренная | medium	0,111 ± 0,001* умеренная | medium	0,095 ± 0,002* умеренная | medium
Лидаза, МЕ/мл | Lidaza, IU/ml
160	0,084 ± 0,008* слабая | weak	0,084 ± 0,004* слабая | weak	0,079 ± 0,002* слабая | weak
80	0,087 ± 0,006* слабая | weak	0,096 ± 0,002* умеренная | medium	0,081 ± 0,004* слабая | weak
40	0,101 ± 0,007* умеренная | medium	0,115 ± 0,005* умеренная | medium	0,110 ± 0,002* умеренная | medium
Флуимуцил, мкг/мл | Fluimucil, µg/ml
1000	0,157 ± 0,006 умеренная | medium	0,158 ± 0,003 умеренная | medium	0,153 ± 0,005 умеренная | medium
100	0,174 ± 0,008 умеренная | medium	0,159 ± 0,005 умеренная | medium	0,154 ± 0,007 умеренная | medium
10	0,172 ± 0,009 умеренная | medium	0,158 ± 0,007 умеренная | medium	0,152 ± 0,003 умеренная | medium

Примечание. Здесь и в табл. 2: * — подавление роста биоплёнок (различия между опытными образцами и контролем статистически достоверны (р < 0,05).

Note. Here and in the Table 2: ⃰ — suppression of biofilm growth (differences between experimental samples and control are statistically significant (p < 0.05).

 

Таблица 2. Влияние препаратов на сформированные биоплёнки штаммов B. pertussis

Table 2. The effect of drugs on the formed biofilms of B. pertussis strains

Дозы препаратов | Doses of drugs	Значения ОП/интенсивность биоплёнок | Optical density values/biofilm intensity
	Штаммы (серовар) | Strains (serovar)
	№ 317 (1.2.3)		№ 287 (1.0.3)	№ 178 (1.2.0)
Контроль культуры | Culture control	0,178 ± 0,010 умеренная | medium		0,158 ± 0,003 умеренная | medium	0,155 ± 0,002 умеренная | medium
Трипсин, мкг/мл | Trypsin, µg/ml
100	0,070 ± 0,006* слабая | weak		0,041 ± 0,002* нет | no	0,039 ± 0,001* нет | no
10	0,078 ± 0,016* слабая | weak		0,086 ± 0,007* слабая | weak	0,079 ± 0,007* слабая | weak
1	0,110 ± 0,014* умеренная | medium		0,120 ± 0,005* умеренная | medium	0,115 ± 0,009* умеренная | medium
Лидаза, МЕ/мл | Lidaza, IU/ml
160	0,161 ± 0,016 умеренная | medium		0,157 ± 0,001 умеренная | medium	0,142 ± 0,015 умеренная | medium
80	0,181 ± 0,008 умеренная | medium		0,159 ± 0,007 умеренная | medium	0,135 ± 0,013 умеренная | medium
40	0,179 ± 0,015 умеренная | medium		0,156 ± 0,005 умеренная | medium	0,145 ± 0,010 умеренная | medium
Флуимуцил, мкг/мл | Fluimucil, µg/ml
1000	0,191 ± 0,014 умеренная | medium		0,157 ± 0,007 умеренная | medium	0,152 ± 0,003 умеренная | medium
100	0,181 ± 0,015 умеренная | medium		0,159 ± 0,010 умеренная | medium	0,156 ± 0,007 умеренная | medium
10	0,179 ± 0,016 умеренная | medium		0,157 ± 0,003 умеренная | medium	0,154 ± 0,005 умеренная | medium

 

Лидаза также подавляла образование биоплёнок всех штаммов. При концентрации 160 МЕ/мл формировались слабые биоплёнки, а при концентрации 80 МЕ/мл формировались слабые или умеренные биоплёнки, статистически достоверно отличавшиеся от контроля (культуры без добавления лидазы). При концентрации 40 МЕ/мл все штаммы формировали умеренные биоплёнки. При этом отмечена статистически достоверная разница по сравнению с контролем. При добавлении лидазы в дозах 160, 80 и 40 МЕ/мл к сформированным биоплёнкам не выявлено статистически значимой разницы в образовании биоплёнок по сравнению с контролем.

Флуимуцил не оказывал влияния как на формирование биоплёнок всеми штаммами, так и на уже сформированные биоплёнки. При добавлении флуимуцила в концентрациях 1000, 100 и 10 мкг/мл формировались умеренные биоплёнки, как в контрольных культурах.

При посеве надосадочных жидкостей из культур в присутствии препаратов, а также из лунок с контролем культуры на плотную питательную среду был отмечен рост типичных для B. pertussis мелких колоний размером 0,5–1,0 мм, выпуклых, круглых, с ровными краями, серого цвета, блестящих. Исследование морфологических свойств микробных клеток показало, что они представляют собой неподвижные, грамотрицательные, овоидной формы мелкие палочки, располагающиеся в мазках отдельно или парами.

Обсуждение

Экзополимерный матрикс является важным структурным компонентом биоплёнок, защищающим бактерии от повреждающих факторов внешней среды, в том числе иммунной системы, антибиотиков [10]. Матрикс бактериальных биоплёнок включает экзополисахаридный компонент, липополисахариды, протеины, нуклеиновые кислоты, лектины и минералы. Различные виды бактерий и различные штаммы внутри одного и того же вида продуцируют различные типы матричных полимеров с различным химическим составом и физическим свойствам. Разрушая внеклеточный полимерный матрикс биоплёнок, можно добиться их повреждения, а также повысить эффективность антибиотиков. Каждый компонент матрикса может служить мишенью для веществ, способных вызывать их разрушение [11, 12]. Одним из подходов к разрушению биоплёнок является ферментативный гидролиз их матрикса. К ферментам, разрушающим матрикс биоплёнки, относятся протеазы, дезоксирибонуклеазы, а также гликозил-гидролазы, катализирующие гидролиз гликозидных связей в молекулах углеводов. Так, использование ДНКазы предотвращало образование биоплёнок представителями рода Staphylococcus и Enterococcus in vitro [13]. Показано, что обработка биоплёнок Pseudomonas aeruginosa in vivo и ex vivo гликозил-гидролазой приводила к разрушению матрикса и переходу микробных клеток в планктонное состояние, что сопровождалось повышением их чувствительности к антибиотикам [11, 14]. Протеолитические ферменты, катализирующие гидролиз белков, давно применяются при лечении пациентов с длительно незаживающими ранами и ожогами, в частности, в составе коммерческих препаратов «Трипсин», «Химотрипсин», «Лидаза», «Коллализин» и др. Недавно была показана возможность использования протеолитических ферментов для борьбы с бактериальными биоплёнками на поверхности ран, тканей, медицинских изделий [15].

Нами исследована чувствительность биоплёнок основных сероваров (1.0.3, 1.2.0 и 1.2.3) свежевыделенных штаммов коклюшного микроба к двум ферментным препаратам (трипсину, лидазе) и флуимуцилу. Использованные нами препараты отличались по влиянию на биоплёнки. Наибольшую активность проявлял трипсин, подавлявший рост биоплёнок и разрушавший сформированные биоплёнки. Лидаза менее активно подавляла рост биоплёнок, не оказывая влияния на сформированные биоплёнки. Флуимуцил не влиял на рост биоплёнок и на сформированные биоплёнки.

По отношению ко всем штаммам выявлена зависимость интенсивности роста биоплёнок от разведения концентрации препаратов. Снижение концентрации трипсина и лидазы сопровождалось усилением роста биоплёнок.

В целом мы не обнаружили существенных различий между исследованными штаммами B. pertussis основных сероваров по чувствительности к трипсину, лидазе и флуимуцилу.

Различный эффект исследованных нами препаратов можно объяснить механизмом их действия на матрикс биоплёнок В. pertussis, основными компонентами которого являются протеины, полисахаридный полимер, липополисахарид и экстрацеллюлярная ДНК [6]. Трипсин представляет собой эндогенный протеолитический фермент, разрывающий пептидные связи в молекуле белка, а также расщепляющий высокомолекулярные продукты распада белков и некоторые низкомолекулярные пептиды. Таким образом, подавление роста биоплёнок B. pertussis и разрушение сформированных биоплёнок трипсином можно объяснить протеолизом белков матрикса, что привело к его деградации. Лидаза (гиалуронидаза) расщепляет основной компонент межуточного вещества соединительной ткани — мукополисахарид, в состав которого входят ацетилглюкозамин и глюкуроновая кислота. Гиалуроновая кислота является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса, содержится во многих биологических жидкостях (слюне, синовиальной жидкости и др.), а также продуцируется некоторыми бактериями. Наличие уроновых кислот также выявлено в составе полисахаридного полимера биоплёнок B. pertussis [16]. Присутствие уроновых кислот в матриксе бактерий может играть важную роль в вирулентности, способствуя стабилизации гликозидных связей с помощью карбоновой кислоты и придавая биоплёночным бактериям более высокую устойчивость к кислотному гидролизу. Также важно отметить, что продукция экзополимеров, содержащая уроновые кислоты, бактериями, колонизирующими дыхательный и кишечный тракты, может способствовать их агрегированию и адгезии к клеткам респираторного тракта. Таким образом, эффект лидазы на биоплёнки можно объяснить расщеплением мукополисахаридов, содержащих уроновые кислоты, что приводило к разрушению матрикса.

Флуимуцил (N-ацетил-L-цистеин) широко используется в качестве муколитического агента для лечения заболеваний бронхолёгочной системы. Действие флуимуцила обусловлено его способностью разрывать дисульфидные связи кислых мукополисахаридов. Препарат обладает способностью уменьшать адгезию некоторых возбудителей к слизистым оболочкам, а также оказывает прямое разрушающее воздействие на внеклеточный матрикс, что позволяет рассматривать его в качестве терапии инфекций, связанных с образованием биоплёнок. В частности, показана способность флуимуцила подавлять образование биоплёнок Pseudomonas aeruginosa и Vibrio cholerae [17]. Отсутствие влияния флуимуцила на биоплёнки B. pertussis может указывать на различия в содержании кислых мукополисахаридов в составе матрикса биоплёнок разных микроорганизмов. Рост типичных по морфологическим свойствам колоний В. pertussis при посеве надосадков биоплёночных культур на плотную питательную среду свидетельствует о разрушении матрикса биоплёнок трипсином и лидазой и отсутствии влияния на планктонные клетки. Разрушение матрикса вызывает дисперсию бактерий, т.е. переход в состояние, близкое к планктонному фенотипу, что делает их более восприимчивыми к факторам иммунной системы и антибактериальным препаратам. Однако в настоящее время иммунобиологические свойства диспергированных из биоплёнок клеток изучены недостаточно. Потенциально они способны к диссеминации, реколонизации, бактериемии и септицемии. В связи с этим важное значение имеет изучение комбинированного действия препаратов, разрушающих матрикс биоплёнок, с антибактериальными препаратами [14].

Полученные нами результаты открывают перспективы для изучения влияния ферментных препаратов на рост биоплёнок B. pertussis на экспериментальных животных, в том числе в сочетании с антибактериальными препаратами, для разработки эффективных препаратов для лечения коклюшной инфекции.

About the authors

Eugene M. Zaуtsev

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: pertussis@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9074

D. Sci. (Med.), Head, Laboratory of immunomodulators

Россия, Moscow

Marina V. Britsina

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: britsinamarina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3044-0790

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators

Россия, Moscow

Maria N. Ozeretskovskaya

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: manja33@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9809-4217

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators

Россия, Moscow

Irina G. Bazhanova

I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: ibajanowa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1404-1498

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of immunomodulators

Россия, Moscow

References

Supplementary files