Email this article Comparative evaluation of hydrolysates as a basis for the construction of a nutrient medium for the cultivation of Listeria monocytogenes
- Authors: Khaptanova N.M.1, Ostyak А.S.1, Lukyanova S.V.1, Kuznetsov V.I.1, Аndreevskaya N.M.1, Adamovich S.N.2, Ushakov I.A.2, Yudenich S.V.1, Balakhonov S.V.1
-
Affiliations:
- Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
- Irkutsk А.Е. Favorsky Institute of Chemistry
- Issue: Vol 98, No 4 (2021)
- Pages: 481-485
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- Submitted: 18.03.2021
- Accepted: 18.03.2021
- Published: 22.09.2021
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1001
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-108
- ID: 1001
Cite item
Full Text
Abstract
The objective is to perform a comparative evaluation of the pancreatic hydrolysates prepared from fish and squid to determine the optimal culture medium for Listeria monocytogenes.
Materials and methods. The following raw materials were used in the study: Pacific Herring (Clupea pallasii), Alaska Pollock (Gadus chalcogrammus), Common Roach (Rutilus rutilus lacustris), European Squid (Loligo vulgaris). The raw materials were subjected to enzymatic hydrolysis using the pancreas (according to Hottinger). A study of the physicochemical properties of pancreatic hydrolysates (content of free amino nitrogen (FAN), acidity of fish hydrolysates, the amino acid composition) was carried out.. The specific activity of nutrient media during the cultivation of the test strain L. monocytogenes 766 was assessed by a complex of microbiological methods.
Results and discussion. The highest content of FAN at the end of enzymatic hydrolysis was observed in the pancreatic hydrolysate of the common roach (6%), the acidity of the hydrolysate remained stable from 6th to 13th day of the hydrolysis process (pH 7.2). Pancreatic hydrolysate of the common roach contained a number of amino acids that are most essential for the growth of Listeria. An assessment of the biological properties of nutrient media prepared on the basis of the obtained hydrolysates demonstrated that the best results in terms of sensitivity and germination of L. monocytogenes 766 showed a nutrient medium based on the pancreatic hydrolysate of the common roach. During the cultivation of L. monocytogenes 766 the test strain retained its morphological and cultural properties and did not show signs of dissociation.
Conclusion. The research results have shown that the pancreatic hydrolysate of the common roach is a promising protein basis for the construction of an experimental environment for listeria.
Full Text
Введение
При проведении бактериологических исследований, а также для производства медицинских изделий для диагностики in vitro требуются качественные питательные среды (ПС), обеспечивающие потребности роста Listeria monocytogenes. К наиболее часто применяемым компонентам микробиологических сред относятся питательные основы животного и растительного происхождения [1–3]. В настоящее время мясные основы в большинстве случаев уступили место более рентабельному сырью — рыбе и продуктам ее переработки. Так, в производстве отечественных ПС используют гидролизат рыбной муки, в связи с этим целесообразен поиск альтернативных источников сырья [4–6].
Цель — провести сравнительную оценку панкреатических гидролизатов (ПГ), полученных из рыбы и кальмаров, для подбора оптимальной ПС для культивирования L. monocytogenes.
Материалы и методы
Для получения ПГ в качестве исходного сырья использовали сельдь тихоокеанскую (Clupea pallasii), минтай (Gadus chalcogrammus), плотву сибирскую (Rutilus rutilus lacustris) — сорогу, кальмара европейского (Loligo vulgaris). В качестве фермента — поджелудочную железу крупного рогатого скота. ПГ готовили согласно методике [7]. Содержание аминного азота определяли формольным титрованием, значение рН гидролизатов исследовали потенциометрическим методом по МУК 4.2.2316-081.
Определение состава гидролизатов 1–4 проводили методом 1Н, 13С, 15N ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР 1H (400,1 МГц), 13С (100,6 МГц), 15N (40,5 МГц) записывали на спектрометрах «Bruker DPX400» (13С) и «Bruker AV400» (1Н и 2М) без использования дейтерированных растворителей.
Определение биологических свойств проводили комплексом микробиологических методов в соответствии с МУК 4.2.2316-08. В работе использовали тест-штамм L. monocytogenes 766 из коллекции патогенных бактерий Иркутского научно-исследовательского противочумного института.
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (m). При оценке достоверности различий сравниваемых данных за уровень значимости принимали р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В процессе приготовления ПГ смешивали фарш из исходного сырья, бульон, добавляли поджелудочную железу крупного рогатого скота и хлороформ. Потеря в массе от исходного сырья составила 56% у кальмаров и 26–38% у рыбы.
Динамику ферментативного процесса определяли по нарастанию аминного азота. Во всех полученных ПГ наблюдали количественное изменение содержания аминного азота в течение 13 сут (в среднем до 5,7 ± 0,2%). Содержание 1,5–6,0% аминного азота в гидролизате говорит о высокой степени расщепления белка до аминокислот и пептидов. Прекращение нарастания аминного азота свидетельствует об окончании ферментативного процесса.
Наибольшее содержание аминного азота в конце гидролиза выявлено в ПГ сороги — 6%. Этот показатель оставался стабильным с 6-х до 13-х суток процесса гидролиза, что свидетельствует о более быстрой фазе гидролиза в этом образце. Наименьшие показания аминного азота отмечены в ПГ минтая (5,4%). Во всех образцах степень гидролиза наиболее интенсивно увеличивалась в течение первых 3 сут и на 7-е сутки (в среднем на 0,9 ± 0,2% и 1,2 ± 0,2% соответственно) по сравнению с 1-ми сутками ферментолиза, а в течение последующих 6 сут отмечалась стабилизация значений степени гидролиза (в среднем увеличение на 0,2%) по сравнению с 7-ми сутками.
Водородный показатель (рН) исследуемых проб в процессе гидролиза на 1-е сутки оставался нейтральным, а затем, на протяжении последующих 13 сут, изменялся в слабощелочную сторону (в среднем от 6,9 ± 0,1 до 7,4 ± 0,2).
Значения рН в гидролизате сороги оставалось стабильным с 6-х до 13-х суток процесса гидролиза (рН 7,2), что согласуется и с показателями аминного азота. В гидролизате сельди значения рН с 7-х по 13-е сутки были также близки к нейтральным значениям, а в гидролизатах кальмара и минтая, напротив, после 3 сут гидролиза стремились в слабощелочную сторону (от 7,4 до 7,7), что, вероятнее всего, связано с особенностями исходного сырья.
Для оценки качественного состава питательных основ был использован метод ЯМР-спектроскопии. Согласно данным [8–10] и спектральной базы органических соединений National Institute of Advanced Industrial Science and Technology2, эти сигналы соответствуют группам СНNH2, СН2СНNH2 аминокислот. В области спектра 124–125 м.д. для всех образцов присутствуют наборы сигналов, характерные для замещённого ароматического кольца.
В области 174–188 м.д. наблюдаются наборы сигналов карбоксильных групп СООН, принадлежащих нескольким аминокислотам. Анализ 2М спектров ЯМР свидетельствует о наличии в образцах свободных аминокислот (аланин, валин, треонин, аргинин, лизин, лейцин, метионин, фенилаланин, глицин). Доля гистидина, тирозина, триптофана составляет 5%. В виде примесей в ПГ сельди присутствует глицерин (73,1 и 63,5 м.д.), а в ПГ минтая и кальмара — диметилкарбамид (3,3 м.д. в 1Н-ЯМР и 60 и 157 м.д. в 13С). Наиболее свободным от примесей был ПГ сороги. Сигналы в спектрах 15N-ЯМР в области от –330 до –352 м.д. соответствуют свободным NH2-группам.
Таким образом, из исследуемых аминокислот в ПГ выявлены 5 (лейцин, аргинин, метионин, валин, гистидин), которые являются наиболее важными для роста листерий и стимулирующими его, а 6 (триптофан, лизин, фенилаланин, глицин, аланин, треонин) также соответствуют питательным потребностям микроорганизма.
Из полученных лиофилизированных гидролизатов сконструировали 4 плотные ПС, в состав которых входили (г/л): NaCl — 3,0; агар микробиологический — 9,0; глюкоза — 10,0; карбонат натрия — 0,7; pH среды 7,3 ± 0,2.
Изучены биологические свойства приготовленных ПС по показателям прорастания микроорганизмов, чувствительности ПС, скорости роста микроорганизмов и стабильности культуры (таблица).
Биологические свойства тест-штамма L. monocytogenes 766, выращенного на плотных ПС с различными вариантами питательных основ
Biological properties of the test strain L. monocytogenes 766 cultured on solid nutrient media with different variants of nutrient bases
Питательная основа Nutrient base | Показатель прорастания микроорганизмов*, % (M ± т) Index of emergence of microorganisms*, % (M ± m) | Чувствительность (выросло колоний при посеве 10 м.к.) (М ± т) Sensitivity (grown colonies when 10 microbial cells were inoculated) (M±m) | Диаметр колоний, мм Colony diameter, mm | Скорость роста,ч Growth rate, |
Сельдь тихоокеанская Pacific Herring (Clиpea pallasii) | — | — | - | 18 |
100,0 ± 1,1 | 6,0 ±1,1 | 1,0-1,2 | 24 | |
100,0 ± 1,8 | 7,0 ±1,1 | 3,0-3,5 | 48 | |
Минтай Alaska Pollock (Gadus chalcogrammus) | - | - | - | 18 |
- | - | 1,0 | 24 | |
100,0 ± 1,4 | 8,0 ± 0,4 | 2,5-3,0 | 48 | |
Сорога Common Roach (Rutilus rutilus lacustris) | - | - | - | 18 |
110,0± 1,1 | 9,0 ± 0,4 | 1,0-1,5 | 24 | |
112,0 ± 1,6 | 10,0 ±0,4 | 3,0-4,0 | 48 | |
Кальмар европейский European Squid (Loligo vulgaris) | - | - | - | 18 |
- | - | < 1,0 | 24 | |
99,0 ± 1,8 | 7,0 ±1,1 | 2,0-2,5 | 48 |
Примечание. *Показатель прорастания микробных клеток — отношение среднего числа колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему числу колоний на контрольной среде, выраженное в процентах; «–» — подсчет колоний не проводился.
Note. *The index of the emergence of microbial cells is the ratio of the average number of colonies formed on the test medium to the average number of colonies on the control medium, expressed as a percentage; (–) — no colonies were counted.
Отчётливый видимый невооруженным глазом рост культуры L. monocytogenes 766 обнаружен через 18 ч инкубации на ПС на основе ПГ сельди и сороги, у других сред определен только через 24 ч. В ПС на основе сельди и сороги через 24 ч инкубации тест-штамма L. monocytogenes 766 отмечали типичный рост колоний в S-форме, достаточный для визуального подсчета (d = 1,0–1,5 мм). По сравнению с этим ПС на основе минтая и кальмара обеспечивали типичный рост культуры только через 48 ч инкубации.
Данные о количестве, диаметре и морфологии колоний L. monocytogenes 766 через 48 ч инкубации при 37 ± 1°С показывают, что по количеству выросших колоний L. monocytogenes 766 изучаемые ПС отличались между собой незначительно, за исключением ПС, включающей ПГ сороги, которая превосходила ПС на основе сельди, минтая и кальмара (р < 0,05). Также наблюдалось увеличение размера колоний листерий (3–4 мм) по сравнению с другими ПС. При этом тест-штамм L. monocytogenes 766 сохранял типичные культурально-морфологические и биохимические свойства.
Заключение
Таким образом, показано, что ПС на основе ПГ сороги обладает удовлетворительными ростовыми свойствами, достигнутыми за счет сочетанного использования оптимальных концентраций питательной основы и компонентов, стимулирующих рост листерий, что в совокупности обеспечивает в минимальные сроки значительное накопление бактериальной массы листерий.
Благодарность / Acknowledgments
Определение состава гидролизатов проводили с использованием оборудования Байкальского аналитического центра коллективного пользования СО РАН. / The main results were obtained using the equipment of the Baikal Analytical Center for Collective Use of the SB RAS
1. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. МУК 4.2.2316-08. М., 2008. 64 с.
2. URL: www.aist.go.jp; www.acdlabs.com
About the authors
N. M. Khaptanova
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8520-4720
Natal'ya M. Khaptanova — junior researcher, Laboratory of cultural medium.
Irkutsk
РоссияА. S. Ostyak
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9391-6779
Аleksandr S. Ostyak — researcher, Department of biological and technological control.
Irkutsk
РоссияS. V. Lukyanova
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Author for correspondence.
Email: svetalukyan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3687-1273
Svetlana V. Lukyanova — Cand. Sci. (Biol.), researcher, Laboratory of cultural medium.
Irkutsk
РоссияV. I. Kuznetsov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-2089-1771
Vladimir I. Kuznetsov — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of cultural medium.
Irkutsk
РоссияN. M. Аndreevskaya
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-8051-1809
Nina M. Аndreevskaya — Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Research and production department.
Irkutsk
РоссияS. N. Adamovich
Irkutsk А.Е. Favorsky Institute of Chemistry
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-1276-924X
Sergey N. Adamovich — D. Sci. (Chem.), leading researcher.
Irkutsk
РоссияI. A. Ushakov
Irkutsk А.Е. Favorsky Institute of Chemistry
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-0176-1699
Igor A. Ushakov — Cand. Sci. (Chem.), senior researcher.
Irkutsk
РоссияS. V. Yudenich
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6948-7633
Sergei V. Yudenich — senior researcher, Research and production department.
Irkutsk
РоссияS. V. Balakhonov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4201-5828
Sergey V. Balakhonov — D. Sci. (Med.), Prof., Director.
Irkutsk
РоссияReferences
- Ковтун Ю.С., Курилова А.А., Таран Т.В., Катунина Л.С., Чурикова Н.В. Сравнительная оценка потенциальных белковых основ микробиологических сред. Проблемы особо опасных инфекций. 2014, (3): 92–5.
- Шепелин А.П. Современное состояние и тенденции в разработке, производстве и применении питательных сред. Бактериология. 2016, 1(1): 42–7. https://doi.org/10.20953/2500-1027-2016-1-42-47
- Сизоненко М.Н., Тимченко Л.Д., Ржепаковский И.В., Катунина Л.С. Влияние биологически активных субстанций на основе эмбриональных тканей перепелов на биологические свойства Listeria monocytogenes. Ветеринарная патология. 2017, (1): 34–9.
- Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2008.
- Насыпаева Е.Н., Лещенко А.А. Сравнительный анализ способов приготовления питательных основ из продуктов переработки молока. В кн.: Всероссийская ежегодная научно-практическая конференция «Общество, наука, инновации». Киров, 2014: 154–5.
- Шепелин А.П., Шолохова Л.П., Марчихина И.И., Полосенко О.В. Панкреатический гидролизат рыбной кормовой муки – полноценная белковая основа питательных сред. В кн.: Материалы IV Национального конгресса бактериологов и Международного симпозиума «Микроорганизмы и биосфера "Microbios-2018"». Омск, 2018: 82–3.
- Дятлов И.А., Кутырев В.В., Храмов М.В. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы. М., 2012.
- Кузьмина Н.Е., Моисеев С.В., Крылов В.И., Кутин А.А., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Валидация методики определения аминокислотного состава фармацевтической субстанции «Глатирамера ацетат» методом ЯМР спектроскопии. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2017, 7(3): 175–81.
- Simmler C., Napolitano J.G., McAlpine J.B., Chen S.N., Pauli G.F. Universal quantitative NMR analysis of complex natural samples. Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 25: 51–9. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2013.08.004
- Fan T.W., Lane A.N. Applications of NMR spectroscopy to systems biochemistry. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2016, 92-93: 18–53. https://doi.org/10.1016/j.pnmrs.2016.01.005
Supplementary files
