Comparative evaluation of hydrolysates as a basis for the construction of a nutrient medium for the cultivation of  Listeria monocytogenes

N. M. Khaptanova; Хаптанова Н. М.; А. S. Ostyak; Остяк А. С.; S. V. Lukyanova; Лукьянова С. В.; V. I. Kuznetsov; Кузнецов В. И.; N. M. Аndreevskaya; Андреевская Н. М.; S. N. Adamovich; Адамович С. Н.; I. A. Ushakov; Ушаков И. А.; S. V. Yudenich; Юденич С. В.; S. V. Balakhonov; Балахонов С. В.

doi:10.36233/0372-9311-108

Сравнительная оценка гидролизатов как основы при конструировании питательной среды для культивирования Listeria monocytogenes

Авторы: Хаптанова Н.М.¹, Остяк А.С.¹, Лукьянова С.В.¹, Кузнецов В.И.¹, Андреевская Н.М.¹, Адамович С.Н.², Ушаков И.А.², Юденич С.В.¹, Балахонов С.В.¹
Учреждения:
1. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
2. Иркутский институт химии имени А.Е. Фаворского
Выпуск: Том 98, № 4 (2021)
Страницы: 481-485
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Дата подачи: 18.03.2021
Дата принятия к публикации: 18.03.2021
Дата публикации: 22.09.2021
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/1001
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-108
ID: 1001

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель работы — провести сравнительную оценку панкреатических гидролизатов, полученных из рыбы и кальмаров, для подбора оптимальной питательной среды для культивирования Listeria monocytogenes.

Материалы и методы. В работе использовали следующее сырье: сельдь тихоокеанскую (Clupea pallasii), минтай (Gadus chalcogrammus), плотву сибирскую (Rutilus rutilus lacustris) — сорогу, кальмар европейский (Loligo vulgaris). Сырье подвергали ферментативному гидролизу с помощью поджелудочной железы (по Хоттингеру). Проводили исследование физико-химических свойств панкреатических гидролизатов (аминный азот, кислотность, аминокислотный состав).Специфическую активность питательных сред при культивировании тест-штамма L. monocytogenes 766 оценивали комплексом микробиологических методов.

Результаты и обсуждение. Наибольшее содержание аминного азота в конце ферментативного гидролиза выявлено в панкреатическом гидролизате сороги (6%), кислотность гидролизата сороги оставалась стабильной с 6-х до 13-х суток процесса гидролиза (рН 7,2). Панкреатические гидролизаты содержали ряд аминокислот, которые являются наиболее существенными для роста листерий. При оценке биологических свойств питательных сред, приготовленных на основе полученных гидролизатов, наилучшие результаты отмечены у питательной среды на основе панкреатического гидролизата сороги. При культивировании L. monocytogenes 766 установлено, что тест-штамм сохранял морфологические и культуральные свойства и не проявлял признаков диссоциации.

Заключение. Результаты исследований показали, что панкреатический гидролизат сороги является перспективной белковой основой для конструирования экспериментальной листериозной среды.

Ключевые слова

Listeria monocytogenes, листериоз, панкреатический гидролизат, питательная среда, биологические свойства

Полный текст

Введение

При проведении бактериологических исследований, а также для производства медицинских изделий для диагностики in vitro требуются качественные питательные среды (ПС), обеспечивающие потребности роста Listeria monocytogenes. К наиболее часто применяемым компонентам микробиологических сред относятся питательные основы животного и растительного происхождения [1–3]. В настоящее время мясные основы в большинстве случаев уступили место более рентабельному сырью — рыбе и продуктам ее переработки. Так, в производстве отечественных ПС используют гидролизат рыбной муки, в связи с этим целесообразен поиск альтернативных источников сырья [4–6].

Цель — провести сравнительную оценку панкреатических гидролизатов (ПГ), полученных из рыбы и кальмаров, для подбора оптимальной ПС для культивирования L. monocytogenes.

Материалы и методы

Для получения ПГ в качестве исходного сырья использовали сельдь тихоокеанскую (Clupea pallasii), минтай (Gadus chalcogrammus), плотву сибирскую (Rutilus rutilus lacustris) — сорогу, кальмара европейского (Loligo vulgaris). В качестве фермента — поджелудочную железу крупного рогатого скота. ПГ готовили согласно методике [7]. Содержание аминного азота определяли формольным титрованием, значение рН гидролизатов исследовали потенциометрическим методом по МУК 4.2.2316-08¹.

Определение состава гидролизатов 1–4 проводили методом ¹Н, ¹³С, ¹⁵N ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР ¹H (400,1 МГц), ¹³С (100,6 МГц), ¹⁵N (40,5 МГц) записывали на спектрометрах «Bruker DPX400» (¹³С) и «Bruker AV400» (¹Н и 2М) без использования дейтерированных растворителей.

Определение биологических свойств проводили комплексом микробиологических методов в соответствии с МУК 4.2.2316-08. В работе использовали тест-штамм L. monocytogenes 766 из коллекции патогенных бактерий Иркутского научно-исследовательского противочумного института.

Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (m). При оценке достоверности различий сравниваемых данных за уровень значимости принимали р < 0,05.

Результаты и обсуждение

В процессе приготовления ПГ смешивали фарш из исходного сырья, бульон, добавляли поджелудочную железу крупного рогатого скота и хлороформ. Потеря в массе от исходного сырья составила 56% у кальмаров и 26–38% у рыбы.

Динамику ферментативного процесса определяли по нарастанию аминного азота. Во всех полученных ПГ наблюдали количественное изменение содержания аминного азота в течение 13 сут (в среднем до 5,7 ± 0,2%). Содержание 1,5–6,0% аминного азота в гидролизате говорит о высокой степени расщепления белка до аминокислот и пептидов. Прекращение нарастания аминного азота свидетельствует об окончании ферментативного процесса.

Наибольшее содержание аминного азота в конце гидролиза выявлено в ПГ сороги — 6%. Этот показатель оставался стабильным с 6-х до 13-х суток процесса гидролиза, что свидетельствует о более быстрой фазе гидролиза в этом образце. Наименьшие показания аминного азота отмечены в ПГ минтая (5,4%). Во всех образцах степень гидролиза наиболее интенсивно увеличивалась в течение первых 3 сут и на 7-е сутки (в среднем на 0,9 ± 0,2% и 1,2 ± 0,2% соответственно) по сравнению с 1-ми сутками ферментолиза, а в течение последующих 6 сут отмечалась стабилизация значений степени гидролиза (в среднем увеличение на 0,2%) по сравнению с 7-ми сутками.

Водородный показатель (рН) исследуемых проб в процессе гидролиза на 1-е сутки оставался нейтральным, а затем, на протяжении последующих 13 сут, изменялся в слабощелочную сторону (в среднем от 6,9 ± 0,1 до 7,4 ± 0,2).

Значения рН в гидролизате сороги оставалось стабильным с 6-х до 13-х суток процесса гидролиза (рН 7,2), что согласуется и с показателями аминного азота. В гидролизате сельди значения рН с 7-х по 13-е сутки были также близки к нейтральным значениям, а в гидролизатах кальмара и минтая, напротив, после 3 сут гидролиза стремились в слабощелочную сторону (от 7,4 до 7,7), что, вероятнее всего, связано с особенностями исходного сырья.

Для оценки качественного состава питательных основ был использован метод ЯМР-спектроскопии. Согласно данным [8–10] и спектральной базы органических соединений National Institute of Advanced Industrial Science and Technology², эти сигналы соответствуют группам СНNH₂, СН₂СНNH₂аминокислот. В области спектра 124–125 м.д. для всех образцов присутствуют наборы сигналов, характерные для замещённого ароматического кольца.

В области 174–188 м.д. наблюдаются наборы сигналов карбоксильных групп СООН, принадлежащих нескольким аминокислотам. Анализ 2М спектров ЯМР свидетельствует о наличии в образцах свободных аминокислот (аланин, валин, треонин, аргинин, лизин, лейцин, метионин, фенилаланин, глицин). Доля гистидина, тирозина, триптофана составляет 5%. В виде примесей в ПГ сельди присутствует глицерин (73,1 и 63,5 м.д.), а в ПГ минтая и кальмара — диметилкарбамид (3,3 м.д. в ¹Н-ЯМР и 60 и 157 м.д. в ¹³С). Наиболее свободным от примесей был ПГ сороги. Сигналы в спектрах ¹⁵N-ЯМР в области от –330 до –352 м.д. соответствуют свободным NH₂-группам.

Таким образом, из исследуемых аминокислот в ПГ выявлены 5 (лейцин, аргинин, метионин, валин, гистидин), которые являются наиболее важными для роста листерий и стимулирующими его, а 6 (триптофан, лизин, фенилаланин, глицин, аланин, треонин) также соответствуют питательным потребностям микроорганизма.

Из полученных лиофилизированных гидролизатов сконструировали 4 плотные ПС, в состав которых входили (г/л): NaCl — 3,0; агар микробиологический — 9,0; глюкоза — 10,0; карбонат натрия — 0,7; pH среды 7,3 ± 0,2.

Изучены биологические свойства приготовленных ПС по показателям прорастания микроорганизмов, чувствительности ПС, скорости роста микроорганизмов и стабильности культуры (таблица).

Биологические свойства тест-штамма L. monocytogenes 766, выращенного на плотных ПС с различными вариантами питательных основ
Biological properties of the test strain L. monocytogenes 766 cultured on solid nutrient media with different variants of nutrient bases

Питательная основа Nutrient base	Показатель прорастания микроорганизмов, % (M ± т)* Index of emergence of microorganisms, % (M ± m)*	Чувствительность (выросло колоний при посеве 10 м.к.) (М ± т) Sensitivity (grown colonies when 10 microbial cells were inoculated) (M±m)	Диаметр колоний, мм Colony diameter, mm	Скорость роста,ч Growth rate,
Сельдь тихоокеанская Pacific Herring (Clиpea pallasii)	—	—	-	18
	100,0 ± 1,1	6,0 ±1,1	1,0-1,2	24
	100,0 ± 1,8	7,0 ±1,1	3,0-3,5	48
Минтай Alaska Pollock (Gadus chalcogrammus)	-	-	-	18
	-	-	1,0	24
	100,0 ± 1,4	8,0 ± 0,4	2,5-3,0	48
Сорога Common Roach (Rutilus rutilus lacustris)	-	-	-	18
	110,0± 1,1	9,0 ± 0,4	1,0-1,5	24
	112,0 ± 1,6	10,0 ±0,4	3,0-4,0	48
Кальмар европейский European Squid (Loligo vulgaris)	-	-	-	18
	-	-	< 1,0	24
	99,0 ± 1,8	7,0 ±1,1	2,0-2,5	48

Примечание. *Показатель прорастания микробных клеток — отношение среднего числа колоний, образовавшихся на испытуемой среде, к среднему числу колоний на контрольной среде, выраженное в процентах; «–» — подсчет колоний не проводился.
Note. *The index of the emergence of microbial cells is the ratio of the average number of colonies formed on the test medium to the average number of colonies on the control medium, expressed as a percentage; (–) — no colonies were counted.

Отчётливый видимый невооруженным глазом рост культуры L. monocytogenes 766 обнаружен через 18 ч инкубации на ПС на основе ПГ сельди и сороги, у других сред определен только через 24 ч. В ПС на основе сельди и сороги через 24 ч инкубации тест-штамма L. monocytogenes 766 отмечали типичный рост колоний в S-форме, достаточный для визуального подсчета (d = 1,0–1,5 мм). По сравнению с этим ПС на основе минтая и кальмара обеспечивали типичный рост культуры только через 48 ч инкубации.

Данные о количестве, диаметре и морфологии колоний L. monocytogenes 766 через 48 ч инкубации при 37 ± 1°С показывают, что по количеству выросших колоний L. monocytogenes 766 изучаемые ПС отличались между собой незначительно, за исключением ПС, включающей ПГ сороги, которая превосходила ПС на основе сельди, минтая и кальмара (р < 0,05). Также наблюдалось увеличение размера колоний листерий (3–4 мм) по сравнению с другими ПС. При этом тест-штамм L. monocytogenes 766 сохранял типичные культурально-морфологические и биохимические свойства.

Заключение

Таким образом, показано, что ПС на основе ПГ сороги обладает удовлетворительными ростовыми свойствами, достигнутыми за счет сочетанного использования оптимальных концентраций питательной основы и компонентов, стимулирующих рост листерий, что в совокупности обеспечивает в минимальные сроки значительное накопление бактериальной массы листерий.

Благодарность / Acknowledgments

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4201-5828

Балахонов Сергей Владимирович — доктор медицинских наук, проф., директор.

Иркутск

Россия

Список литературы

Ковтун Ю.С., Курилова А.А., Таран Т.В., Катунина Л.С., Чурикова Н.В. Сравнительная оценка потенциальных белковых основ микробиологических сред. Проблемы особо опасных инфекций. 2014, (3): 92–5.
Шепелин А.П. Современное состояние и тенденции в разработке, производстве и применении питательных сред. Бактериология. 2016, 1(1): 42–7. https://doi.org/10.20953/2500-1027-2016-1-42-47
Сизоненко М.Н., Тимченко Л.Д., Ржепаковский И.В., Катунина Л.С. Влияние биологически активных субстанций на основе эмбриональных тканей перепелов на биологические свойства Listeria monocytogenes. Ветеринарная патология. 2017, (1): 34–9.
Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2008.
Насыпаева Е.Н., Лещенко А.А. Сравнительный анализ способов приготовления питательных основ из продуктов переработки молока. В кн.: Всероссийская ежегодная научно-практическая конференция «Общество, наука, инновации». Киров, 2014: 154–5.
Шепелин А.П., Шолохова Л.П., Марчихина И.И., Полосенко О.В. Панкреатический гидролизат рыбной кормовой муки – полноценная белковая основа питательных сред. В кн.: Материалы IV Национального конгресса бактериологов и Международного симпозиума «Микроорганизмы и биосфера "Microbios-2018"». Омск, 2018: 82–3.
Дятлов И.А., Кутырев В.В., Храмов М.В. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы. М., 2012.
Кузьмина Н.Е., Моисеев С.В., Крылов В.И., Кутин А.А., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Валидация методики определения аминокислотного состава фармацевтической субстанции «Глатирамера ацетат» методом ЯМР спектроскопии. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2017, 7(3): 175–81.
Simmler C., Napolitano J.G., McAlpine J.B., Chen S.N., Pauli G.F. Universal quantitative NMR analysis of complex natural samples. Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 25: 51–9. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2013.08.004
Fan T.W., Lane A.N. Applications of NMR spectroscopy to systems biochemistry. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2016, 92-93: 18–53. https://doi.org/10.1016/j.pnmrs.2016.01.005

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Имя пользователя
Пароль
Запомнить меня

Забыли пароль?	Регистрация

Сравнительная оценка гидролизатов как основы при конструировании питательной среды для культивирования Listeria monocytogenes

Полный текст

Аннотация

Ключевые слова

Полный текст

Введение

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Заключение

Благодарность / Acknowledgments

Об авторах

Список литературы

Дополнительные файлы

Данный сайт использует cookie-файлы