Характеристика Pseudomonas aeruginosa, выделенных из положительных проб гемокультур и ликвора у детей

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Инфекции кровотока и центральной нервной системы (ЦНС), вызванные Pseudomonas aeruginosa, связаны с тяжёлым состоянием пациентов и нередко сопровождаются высокой летальностью.

Цель — молекулярно-генетическая характеристика P. aeruginosa, выделенных из положительных проб гемокультур и ликвора пациентов до 18 лет из отделений реанимации и интенсивной терапии стационаров.

Материалы и методы. Проведено ретроспективное исследование случаев бактериемии и инфекции ЦНС, связанных с P. aeruginosa, с 2014 по 2021 г. Изучены 24 клинических изолята P. aeruginosa из положительных гемокультур и ликвора. В структуре пациентов были 16 детей с хирургической патологией и 8 пациентов соматического профиля. Минимальную подавляющую концентрацию антибиотиков определяли методом серийных микроразведений в бульоне. Карбапенемазы выявляли в ПЦР в режиме реального времени. Гены вирулентности определяли методом ПЦР. Популяционное разнообразие оценивали методом мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ).

Результаты. В 28% случаев при бактериемии и инфекции ЦНС, ассоциированной с P. aeruginosa, был летальный исход. Более 70% изолятов проявляли устойчивость к карбапенемным антибиотикам. Фенотипом множественной лекарственной устойчивости обладали 25% изолятов. Экстремальную резистентность проявляли 54% изолятов. Частота выявления металло-β-лактамаз составила 54%. При проведении ПЦР у 33% штаммов выявлен ExoU-тип, у 67% — ExoS-тип. По данным МЛСТ определено 16 генотипов. В структуре преобладали сиквенс-типы ST654 (29%) и ST235 (12,5%).

Заключение. Изоляты P. aeruginosa, выделенные из положительных гемокультур и проб ликвора, обладают высокой резистентностью к антибиотикам, гены вирулентности обнаружены у всех изолятов. Чаще в изученной выборке определялись штаммы высокого эпидемического риска. Более четверти описанных клинических случаев имели неблагоприятный исход.

Полный текст

Введение

Бактериальные инфекции кровотока и центральной нервной системы (ЦНС), вызванные Pseudomonas aeruginosa, являются серьёзными инфекциями, связанными со значительной заболеваемостью [1], смертностью пациентов и расходами на медицинское обслуживание [2]. P. aeruginosa — один из основных возбудителей оппортунистических нозокомиальных инфекций, в том числе сепсиса, пневмонии, инфекций мочевыводящих путей. В мире растёт устойчивость данного микроорганизма к антибактериальным препаратам, в том числе карбапенемам [3]. Большую роль в этом процессе играет P. aeruginosa [4].

Резистентность P. aeruginosa к антибиотикам может быть связана с мутациями в бактериальном геноме, приводящими к изменениям специфических пориновых каналов, гиперэкспрессией механизмов активного выведения — эффлюксных помп, изменениями в целевом сайте антибиотиков и приобретением генов резистентности на мобильных генетических элементах [5].

Основную роль в антибиотикорезистентности играет ферментативное воздействие на антибиотики. Для P. aeruginosa особенно важна продукция карбапенемаз, среди которых наиболее широкое распространение имеют металло-бета-лактамазы (МБЛ) [6].

Помимо механизмов антибиотикорезистентности, P. aeruginosa обладает факторами вирулентности, с помощью которых она скрывается от иммунологических реакций хозяина и проявляет свою патогенность [7]. Одной из наиболее значимых детерминант вирулентности P. aeruginosa является система секреции типа III. Этот аппарат зависит от контакта с клеткой, он направляет в клетку-мишень секрецию некоторых бактериальных белков, называемых экзоферментами (Exo) U, S, T и Y. Белки ExoS и ExoU токсичны для клеток [8]. По данным некоторых исследователей, ExoS не является цитотоксином, ответственным за изменение и гибель клеток, он играет иную роль в патогенезе инфекционного процесса [9].

Эпидемиология P. aeruginosa сложна. Инфекции, вызванные P. aeruginosa с множественной (МЛУ) и экстремальной (ЭЛУ) лекарственной устойчивостью, связаны с тяжёлыми неблагоприятными клиническими исходами [10]. Понимание эпидемиологии инфекций P. aeruginosa с МЛУ необходимо для разработки стратегий по ограничению их распространения.

Целью данной работы было проведение анализа чувствительности P. aeruginosa к антимикробным препаратам, механизмов резистентности к карбапенемам и клинического значения наличия генов вирулентности exoU и exoS системы секреции типа III.

Материалы и методы

В 2014–2021 гг. были отобраны 24 изолята P. aeruginosa из положительных гемокультур и ликвора. Изоляты были выделены от пациентов из двух московских детских больниц: НМИЦ здоровья детей и НИИ неотложной детской хирургии и травматологии.

Образцы крови инкубировали в анализаторе гемокультур «Bactec 9050» («Becton Dickinson»), «BacT/ALERT» («BioMerieux») до фиксации роста микроорганизмов, затем пробу отсевали на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя. Посевы производили на питательные среды: кровяной агар и Uri-select агар («BioRad»), инкубировали в термостате при 37°С в течение 24–48 ч. Возбудитель выявляли методом масс-спектрометрии MALDI-TOF («Bruker Daltonics»).

Антимикробными препаратами для определения чувствительности были меропенем, имипенем, колистин, азтреонам, ципрофлоксацин, амикацин, тобрамицин, цефтазидим, пиперациллин/тазобактам, цефталозан/тазобактам и цефтазидим/авибактам. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера–Хинтона («BioMerieux») «SensititreTM» («ThermoScinetific »). В качестве контроля использовали штамм P. aeruginosa ATCC 27653.

Результаты интерпретировали в соответствии с критериями Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам (EUCAST) версия 10.0.

Бактериальную ДНК из суточной культуры выделяли с использованием коммерческих наборов «ГК-экспресс» (ЦНИИ Эпидемиологии). Полученные образцы хранили до использования при –20°С.

Гены, отвечающие за продукцию карбапенемаз, идентифицировали с использованием наборов с гибридизационно-флюоресцентной детекцией «АмплиСенс® MDR MBL-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии). ПЦР осуществляли с помощью амплификатора «LightCycler 96» («Roche»). Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения графика флюоресценции с пороговой линией, отражающей экспоненциальный подъём сигнала. При значении Ct ≤ 32 результат оценивали как положительный.

Наличие генов вирулентности exoU и exoS определяли с помощью ПЦР. Праймеры для амплификации указаны в табл. 1 [11].

 

Таблица 1. Праймеры для амплификации генов exoU и exoS
Table 1. Primers for amplification of the exoU and exoS genes

Ген Gene

Праймер Primer

Последовательность 5'-3'

Sequence 5'-3'

Продукт, П.Н.

Product, bp

exoS

ExoS-F

ExoS-R

CTT GAA GGG ACT CGA CAA GG

TTC AGG TCC GCG TAG TGA AT

504

exo U

ExoU-F

ExoU-R

GGG AAT ACT TTC CGG GAA GTT

CGA TCT CGC TGC TAA TGT GTT

428

 

Компоненты ПЦР смеси: iQ Supermix, («BioRad») — 5 мкл; по 1 мкл каждого праймера (F и R); дистилированная вода — 1 мкл; проба ДНК — 2 мкл.

Условия ПЦР:

  • начальная денатурация при 94°C (2 мин);
  • денатурация при 94°C (30 с);
  • отжиг праймеров при 56°C (для exoU) и 55°C (для exoS) (30 с);
  • элонгация при 68°C (30 с);
  • заключительный этап элонгации при 68°C (7 мин).

ПЦР выполняли с помощью амплификатора «LightCycler 96» («Roche»); 5 мкл всех продуктов ПЦР подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле в буфере TBE при 120 В и визуализировали в ультрафиолетовом свете путём окрашивания бромидом этидия. В качестве положительного контроля использовали образцы с заведомо известным наличием соответствующих генов. В качестве отрицательного контроля использовали образец без ДНК.

Для типирования изолятов P. aeruginosa использовали метод мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ). Подготовка включала амплификацию участков 7 генов домашнего хозяйства: acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsAL и trpE. Использовали праймеры из общепринятой схемы МЛСТ1. Подготовку ампликонов осуществляли с помощью стандартных методик. Секвенирование проводили с помощью наборов реагентов и оборудования фирмы «Applied Biosystems». Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования, анализировали с помощью программы «SeqMan» («DNASTAR Inc.») и сравнивали с базой аллелей МЛСТ2. Генотип определяли по комбинации аллелей. Новые генотипы и типированные штаммы (номера 8048, 8052–8074) регистрировали у куратора сайта P. aeruginosa PubMLST Maria Lopez Martinez.

Результаты

В 2014–2021 гг. из положительных гемокультур или проб ликвора пациентов выделено 685 изолятов, синегнойная палочка выявлена в 24 (3,5%) из них. Большинство изолятов — 19 (79%) — получено из гемокультур.

При определении чувствительности к антибиотикам устойчивость к обоим карбапенемам (меропенем и имипенем) проявили 17 (71%) изолятов.

Чувствительность карбапенем-резистентных (карба-Р, согласно эпидемиологической точке отсечения) изолятов к другим препаратам представлена в табл. 2.

 

Таблица 2. Чувствительность к антибиотикам изолятов P. aeruginosa, резистентных к карбапенемам (n = 17)
Table 2. Antibiotic susceptibility of P. aeruginosa isolates resistant to carbapenems (n = 17)

Антибиотик Antibiotic

Чувствительный Sensitive

Чувствительные при увеличенной экспозиции Sensitive at increased exposure

Резистентный Resistant

n

%

n

%

n

%

Амикацин

Amikacin

10

59

-

-

7

41

Тобрамицин Tobramycin

2

12

-

-

15

88

Пиперациллин/тазобактам* Piperacillin/tazobactam*

-

-

7

41

10

59

Цефтазидим Ceftazidime

-

-

-

-

17

100

Цефтазидим/авибактам*

Ceftazidime/avibactam*

2

12

-

 

15

88

Цефталозан/тазобактам*

Ceftalosan/tazobactam*

-

-

-

-

17

100

Азтреонам

Aztreonam

-

-

12

71

5

29

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin

-

-

1

6

16

94

Примечание. *Для определения чувствительности использована фиксированная концентрация 4 мг/л.
Note. *A fixed concentration of 4 mg/L was used to determine sensitivity.

 

Два изолята были чувствительны при повышенной экспозиции к меропенему (МПК 4–8 мг/л) и устойчивы к имипенему (МПК > 8 мг/л), чувствительны к колистину и цефтазидим/авибактаму, чувствительны при повышенной экспозиции к азтреонаму и пиперациллин/тазобактаму, резистентны к ципрофлоксацину и цефтазидиму. Один из этих изолятов обладал чувствительностью к амикацину, тобрамицину и цефталозан/тазобактаму.

Анализ антибиотикорезистентности всей выборки изолятов к некарбапенемным антимикробным препаратам показал довольно высокий процент устойчивых изолятов к аминогликозидам, цефалоспоринам и фторхинолонам (табл. 3).

 

Таблица 3. Устойчивость P. aeruginosa к некарбапенемным антибиотикам (n = 24)
Table 3. Resistance of P. aeruginosa to non-carbapenem antibiotics (n = 24)

Антибиотик Antibiotic

МПК, мг/л1

Minimum inhibitory concentration, mg/l1

Число резистентных штаммов Number of resistant strains

чувствительный ≤

sensitive ≤

резистентный > resistant >

n

%

Амикацин

Amikacin

16

16

9

38

Тобрамицин Tobramycin

2

2

17

71

Пиперациллин/тазобактам* Piperacillin/tazobactam*

16

16

12

50

Цефтазидим Ceftazidime

0,001

8

19

79

Цефтазидим/авибактам*

Ceftazidime/avibactam*

8

8

16

67

Цефталозан/тазобактам*

Ceftalosan/tazobactam*

0,001

16

19

79

Азтреонам

Aztreonam

0,001

16

6

25

Ципрофлоксацин Ciprofloxacin

0,001

0,5

18

75

Примечание. 1В соответствии с EUCAST. *Для определения чувствительности использована фиксированная концентрация 4 мг/л.
Note. 1According to EUCAST. *A fixed concentration of 4 mg/L was used to determine sensitivity.

 

К колистину были чувствительны все исследованные штаммы.

В соответствии с международно принятыми критериями все изоляты были распределены по фенотипическим группам резистентности (рис. 1):

  • фенотип МЛУ, т.е. устойчивость как минимум к 1 препарату 3 и более классов антибиотиков;
  • фенотип ЭЛУ — чувствительность только к 2 и менее классам антибиотиков;
  • фенотип панрезистентности — резистентность ко всем классам антимикробных препаратов. Штаммов с фенотипом панрезистентности нами не выявлено.

Рис. 1. Фенотипические группы и продукция МБЛ blaVIM у P. aeruginosa. 1 — чувствительные; 2 — МЛУ; 3 — ЭЛУ. Светлые столбики — изоляты, не продуцирующие VIM; темные — продуценты VIM. Fig. 1. Phenotypic groups and production of MBL blaVIM in P. aeruginosa. 1 — sensitive; 2 — multiple drug resistance; 3 — extreme drug resistance. Light bars — isolates that do not produce VIM; dark — VIM producers.

 

Для штаммов, проявляющих резистентность хотя бы к одному из исследуемых карбапенемов, было проведено определение наличия карбапенемаз. Среди них частота выявления МБЛ составила 68%. Были выявлены только blaVIM. Другие карбапенемазы: blaNDM и blaIMP — не обнаружены. При этом 6 изолятов проявляли резистентность к имипенему и/или меропенему, но не имели МБЛ. К категории МЛУ относились 4 из 13 МБЛ+-изолята, другие 8 входили в группу ЭЛУ.

При ExoU/ExoS-типировании ген-эффектор exoU обнаружен у 8 изолятов. Половина карба-Ризолятов с ExoU-типом имели МБЛ blaVIM. ExoS-тип был определён у 16 изолятов, 13 из которых были резистентны к карбапенемам.

Большая часть (77%) карба-Р-изолятов с ExoS-типом обладала МБЛ blaVIM. ExoU- и ExoS-типы исследованных P. aeruginosa и их чувствительность к карбапенемам представлены на рис. 2. Наличие генов обоих эффекторов у одного и того же изолята не выявлено.

Рис. 2. ExoU- и ExoS-типы P. aeruginosa. Светлые столбики — чувствительные к карбапенемам; тёмные — резистентные. Fig. 2. ExoU- and ExoS-types of P. aeruginosa. Light bars — sensitive to carbapenems; dark bars — resistant to carbapenems.

 

Популяционная структура изолятов P. aeruginosa представлена 16 различными сиквенс-типами (табл. 4).

 

Таблица 4. Данные BURST-анализа P. aeruginosa [12]
Table 4. Data of BURST analysis of P. aeruginosa [12]

Группа Group

Сиквенс-тип

Sequence type

Частота

Frequency

Однолокусный вариант Single-locus variant

Двухлокусный вариант

Two-locus variant

1

155

1

1

 

 

3823*

1

1

 

2

235

3

1

 

 

3819*

1

1

 

3

654a

7

3

 

 

3821*

1

1

2

 

3824*

1

2

1

 

3825*

1

2

1

Синглетоны / Singletons

260

1

 

 

 

270

1

 

 

 

412

1

 

 

 

773

1

 

 

 

2326

1

 

 

 

3822*

1

 

 

 

3826*

1

 

 

 

3827*

1

 

 

Примечание. Определение группы: 5 или более совпадений. аЦентральный сиквенс-тип; *впервые выявленные сиквенс-типы.
Note. Group definition: 5 or more matches. aСentral sequence type; *sequence types identified for the first time.

 

В структуре лидировали представители двух сиквенс-типов: ST654 (29%) и ST235 (12,5%). Другие сиквенс-типы были представлены по одному изоляту. Впервые описаны 8 сиквенс-типов:

  • ST3819 — новая аллель mutL (однолокусный вариант ST235);
  • однолокусные варианты ST654: с новой аллелью ppsAL — ST3821 и с новыми аллелями mutL — сиквенс-типы 3824 и 3825;
  • однолокусный вариант ST155 — сиквенс-тип 3823 (новая аллель mutL);
  • сиквенс-типы, представленые синглетонами: 3822, 3826, 3827 (рис. 3).

Рис. 3. Популяционная структура P. aeruginosa. Серым цветом обозначены изоляты, резистентные к карбапенемам, белым — чувствительные. Fig. 3. Population structure of P. aeruginosa. Carbapenem-resistant isolates are indicated in grey, sensitive isolates are indicated in white.

 

Носителями blaVIM были все изоляты ST654 и его однолокусные варианты, а также 2/3 изолятов ST235. Сиквенс-тип 235 и его SLV составили 50% ExoU-положительных культур. Изоляты с ExoS-типом относились к 10 сиквенс-типам. Среди штаммов ExoS-типа преобладали ST654 и его SLV, ST155 и SLV.

Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика случаев бактериемии и инфекции ЦНС, ассоциированных c P. aeruginosa, представлена в табл. 5. Медиана возраста пациентов составила 3 года 10 мес (минимальный возраст — 16 сут, максимальный — 17 лет 11 мес). Бактериемии и инфекции ЦНС, вызванные P. aeruginosa, закончились летальным исходом в 5 случаях. Из 8 случаев при подтверждённом сепсисе 4 случая имели неблагоприятный исход.

 

Таблица 5. Характеристика случаев бактериемии и инфекции ЦНС, вызванных с P. aeruginosa
Table 5. Characteristics of cases of bacteremia and central nervous system infection caused with P. aeruginosa

№ No.

Стационар Hospital

Год выделения Year of allocation

Источник

Source

Патология Pathology

Исход Issue

Наличие МБЛ Presence of MBL

Ехо-тип

Exo-type

Сиквенс тип Sequence type

1

C1

2014

Кровь Blood

Соматическая Somatic

Выписан Discharged

+

U

235

2

C1

2015

Кровь, централь­ный венозный катетер (ЦВК) Blood, central venous catheter (CVC)

Хирургическая. Врождённый порок сердца Surgical. Congenital heart disease

Выписан Discharged

+

S

654

3

C1

2015

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Соматическая. Муковисцидоз Somatic.

Cystic fibrosis

Выписан Discharged

—

U

773

4

C1

2015

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Соматическая Somatic

Выписан Discharged

+

U

235

5

C1

2016

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Соматическая.

Буллёзный эпидермолиз. Сепсис Somatic. Epidermolysis bullosa. Sepsis

Выписан Discharged

 

S

3822

6

C1

2017

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Хирургическая.

Врождённый порок сердца. Surgical. Congenital heart disease

Летальный исход Fatal outcome

+

S

654

7

C1

2017

Кровь Blood

Хирургическая. Абдоминальная патология Surgical. Abdominal pathology

Выписан Discharged

—

S

155

8

C1

2017

Кровь Blood

Хирургическая. Абдоминальная патология Surgical. Abdominal pathology

Выписан Discharged

—

S

3823

9

C1

2017

Кровь Blood

Соматическая.

Буллёзный эпидермолиз Somatic. Epidermolysis bullosa

Выписан Discharged

—

S

412

10

C2

2017

Кровь Blood

Хирургическая. Абдоминальная патология Surgical. Abdominal pathology

Выписан Discharged

+

S

654

11

C1

2018

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Хирургическая. Абдоминальная патология. Сепсис Surgical. Abdominal pathology. Sepsis

Летальный исход Fatal outcome

+

S

654

12

C1

2018

Кровь, ЦВК Blood, CVC

Хирургическая. Врождённый порок сердца. Сепсис Surgical. Congenital heart disease. Sepsis

Летальный исход Fatal outcome

+

S

654

Примечание. C1 — НМИЦ здоровья детей; C2 — НИИ неотложной детской хирургии и травматологии.
Note. C1 — National Medical Research Center for Children's Health; C2 — Clinical and Research Institute of Emergency Pediatric Surgery and Trauma.

 

Обсуждение

В настоящем исследовании изучалась молекулярно-генетическая характеристика изолятов P. aeruginosa, а также клинические аспекты и исходы бактериемии и инфекции ЦНС, ассоциированной с P. aeruginosa, у детей в отделениях реанимации.

P. aeruginosa— один из основных микроорганизмов, способных вызывать нозокомиальные инфекции, она является третьим наиболее часто выделяемым патогеном при посеве крови среди грамотрицательных палочек и седьмым среди всех микробных агентов [13]. В нашем исследовании P. aeruginosa обнаружена в 3,5% исследованных изолятов.

Способность P. aeruginosa вызывать внутрибольничные инфекции связана с её устойчивостью и вирулентностью [14]. По данным исследования «МАРАФОН» за 2015–2016 гг., основная доля изолятов P. aeruginosa имела высокие уровни устойчивости к защищённым пенициллинам. Резистентность к антисинегнойным цефалоспоринам проявляли около половины изолятов. По новым критериям EUCAST 41,5% изолятов были резистентны к азтреонаму. Резистентность к карбапенемам была выявлена более чем у половины изолятов. Полимиксины проявили максимальную активность in vitro [15]. В другом исследовании отмечен значительный рост количества изолятов, резистентных к пиперациллину/тазобактаму и амикацину. У 1,7% штаммов P. aeruginosa, выделенных в 2017 г., выявлена резистентность к антимикробным препаратам всех исследуемых классов. У изолятов P. aeruginosa, выделенных в 2017 г., обнаружена более высокая устойчивость — около 70% ко всем анализируемым классам антибиотиков, кроме полимиксинов [16].

В нашем исследовании резистентными к пиперациллин/тазобактаму были 50% изолятов, к цефтазидиму — 79%. Резистентностью к аминогликозидам и фторхинолонам обладали до 75% штаммов. Устойчивость к защищенным цефалоспоринам составила 60%. Резистентность к карбапенемным антибиотикам достигала 79%. Нами не было выявлено изолятов P. aeruginosa, резистентных к колистину.

Карбапенемазы молекулярных классов А, В, D относятся к наиболее распространённым у грамотрицательных микроорганизмов [17]. В исследовании «МАРАФОН» в 2015–2016 гг. у P. aeruginosa была увеличена доля продукции карбапенемаз — преобладали МБЛ VIM и сериновые карбапенемазы (GES-5) [15]. В нашем исследовании МБЛ blaVIM обнаружена у 54% исследованных изолятов P. aeruginosa, других типов МБЛ не выявлено.

По данным V.H. Tam и соавт., синегнойная палочка, обладающая МЛУ, является независимым предиктором смертности при инфекциях кровотока [18]. В нашем исследовании во всех случаях неблагоприятного исхода были выделены изоляты, обладающие МЛУ и ЭЛУ к антибиотикам.

Помимо антибиотикорезистентности важную роль в патогенезе инфекции играют вирулентные свойства микроорганизмов. Цитотоксичность, связанная с секрецией III типа, является основным фактором, определяющим вирулентность P. aeruginosa [19]. Ген-эффектор exoU — главный фактор вирулентности с фосфолипазной активностью, отвечает за острое повреждение лёгких и септические состояния у пациентов со сниженным иммунитетом [20]. При инфекции, вызванной P. aeruginosa, у которой имеется ген exoU, увеличивается тяжесть заболевания [21]. Экспрессия генов exoS и exoU обусловливает цитотоксичность P. aeruginosa для клеток при инфекции [22]. За счёт ингибирования регенерации тканей и заживления ран ExoS может играть ключевую роль в хронических заболеваниях, поддерживая места колонизации [23]. В одном из исследований факторов вирулентности при бактериемии показано, что все штаммы обладали либо геном exoU, либо exoS [24]. Доля штаммов, ответственных за бактериемию, которые обладали exoU, составила 31,5% и была выше, чем сообщали ранее Y. Hirakata и соавт. — 10,8% [25].

Данные коллег указывают, что гены exoU и exoS практически исключают друг друга [24]. В отделениях интенсивной терапии ген-эффектор exoS был обнаружен у 36,2% пациентов, exoU — у 63,8% [26]. В других исследованиях наиболее частыми детерминантами вирулентности описаны lasB (98,7%) и exoS (98,7%) [27]. В нашей работе ген-эффектор exoU обнаружен в 33% изолятов, большинство из них проявляли ЭЛУ к антибиотикам. Ген exoS был выявлен в 67% случаев. Комбинации генов-эффекторов выявлено не было, что соответствует общемировым данным [24][26]. В случаях с неблагоприятным исходом у изолятов был определен ExoS-тип, хотя в литературе описывается большая токсичность изолятов ExoU-типа.

В нашем исследовании популяция P. aeruginosa представлена 16 сиквенс-типами. Преобладали два генотипа высокого эпидемического риска: ST654 (29%), ST235 (12,5%) и их однолокусные варианты. Однако, по данным международных исследователей, распространение ST654 ниже по сравнению с клоном ST235 [27]. По данным отечественных коллег [28], более 95% изолятов, обладающих МБЛ, представлены ST235. В нашем исследовании МБЛ+-изоляты относились к ST654 (7 из 13; 54%). По данным испанских исследователей, ST235 имеет высоковирулентный фенотип, связанный с высоким уровнем смертности, вероятно, из-за продукции цитотоксина exoU [29]. В другой работе сообщалось, что среди пациентов с бактериемией 45,8% случаев были связаны с клоном ST235, продуцирующим карбапенемазу и exoU [30]. В нашей выборке ST235 и его SLV составили 50% изолятов ExoU-типа. Среди штаммов ExoS-типа преобладал ST654 и его SLV (62,5%).

Колонизация пациентов нозокомиальными штаммами P. aeruginosa является сложной и многофакторной проблемой. До 90% пациентов с инфекциями кровотока, ассоциированными с P. aeruginosa, имеют тяжёлое основное заболевание, чаще это злокачественные новообразования, хронические заболевания, обширные оперативные вмешательства или снижение иммунного статуса [31]. В нашей работе 66% пациентов наблюдались с хирургической патологией и 34% составляли пациенты соматического профиля.

В настоящее время в литературе недостаточно данных, отражающих факторы риска неблагоприятного исхода у детей с инфекциями кровотока в России. В работах иностранных авторов описано, что P. aeruginosa встречается в основном у детей, нередко со сниженным иммунитетом [32].

Инфекции кровотока, вызванные P. aeruginosa, ассоциируются с высоким уровнем смертности. По некоторым данным, в настоящее время в детской практике общая летальность среди пациентов с инфекциями кровотока составляет около 37% [33]. В нашем исследовании из всех случаев бактериемии и инфекции ЦНС, связанных с P. aeruginosa, 28% имели неблагоприятный исход. Сепсис или септический шок во время бактериемии P. aeruginosa являются факторами риска смертности [34]. В нашей выборке сепсис был в диагнозе в 80% случаев летальных исходов. Некоторые исследователи показали, что хирургические вмешательства, сопровождающиеся бактериемией, имеют особенно плохой прогноз [35]. В нашем исследовании внутрибольничные инфекции кровотока и ЦНС в 66% случаев наблюдались у пациентов после обширных операций. При этом в 3 из 16 случаев имели летальный исход.

Заключение

Результаты этого исследования показывают широкое распространение резистентности к большинству антибактериальных препаратов среди штаммов P. aeruginosa, выделенных из крови и ликвора у детей. Особую настороженность вызывает высокая резистентность к карбапенемам. Большая часть изолятов была представлена продуцентами карбапенемаз МБЛ blaVIM. Наиболее высокую активность в отношении P. aeruginosa in vitro проявляли полимиксины. Все изоляты имели гены, отвечающие за вирулентные свойства, связанные с функционированием системы секреции цитотоксинов III типа. Преобладал ExoS-тип. Инфекции кровотока и ЦНС, вызванные P. aeruginosa, в основном встречаются у детей после обширных хирургических вмешательств или при наличии тяжёлой соматической патологии, сопровождающейся снижением иммунитета. Большинство инфекций ассоциированы с сиквенс-типами высокого риска.

1. PubMLST. Primers used for MLST of Pseudomonas aeruginosa. Available at: https://pubmlst.org/organisms/ pseudomonas-aeruginosa/primers

2. PubMLST. MLST Database. Pseudomonas aeruginosa. Available at: https://pubmlst.org/paeruginosa

×

Об авторах

З. З. Садеева

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей

Автор, ответственный за переписку.
Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4587-0902

Садеева Зульфиря Закиевна — младший научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии НМИЦ здоровья детей.

Москва

Россия

И. Е. Новикова

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4234-0209

Новикова Ирина Евгеньевна — младший научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии НМИЦ здоровья детей.

Москва

Россия

Н. М. Алябьева

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9365-9143

Алябьева Наталья Михайловна — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, зав. лаб. экспериментальной иммунологии и вирусологии НМИЦ здоровья детей.

Москва

Россия

А. В. Лазарева

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3896-2590

Лазарева Анна Валерьевна — доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаб. молекулярной микробиологии, зав. лаб. микробиологии НМИЦ здоровья детей.

Москва

Россия

О. В. Карасева

Научно-исследовательский институт неотложной детской хирургии и травматологии

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-9418-4418

Карасева Ольга Витальевна — доктор медицинских наук, зам. директора по научной работе, руководитель отдела сочетанной травмы, анестезиологии-реанимации НИИ неотложной детской хирургии и травматологии.

Москва

Россия

А. П. Фисенко

Национальный медицинский исследовательский центр здоровья детей

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0001-8586-7946

Фисенко Андрей Петрович — доктор медицинских наук, профессор, директор НМИЦ здоровья детей/

Москва

Россия

Список литературы

  1. Teelucksingh K., Shaw E. Clinical characteristics, appropriateness of empiric antibiotic therapy, and outcome of Pseudomonas aeruginosa bacteremia across multiple community hospitals. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2022; 41(1): 53–62. https://doi.org/10.1007/s10096-021-04342-y
  2. Jarlier V., Diaz Högberg L., Heuer O.E., Campos J., Eckmanns T., Giske C.G., et al. Strong correlation between the rates of intrinsically antibiotic-resistant species and the rates of acquired resistance in Gram-negative species causing bacteraemia, EU/EEA, 2016. Euro Surveill. 2019; 24(33): 1800538. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2019.24.33.1800538
  3. Козлов Р.С., Голуб А.В., Дехнич А.В., Сухорукова М.В. Антибиотикорезистентность грамотрицательных возбудителей осложненных интраабдоминальных инфекций в России. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015; 17(3): 227–34.
  4. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015; 17(3): 170–86.
  5. Breidenstein E.B., de la Fuente-Núñez C., Hancock R.E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 2011; 19(8): 419–26. https://doi.org/10.1016/j.tim.2011.04.005
  6. Saima S., Fiaz M., Manzoor M., Zafar R., Ahmed I., Nawaz U., et al. Molecular investigation of antibiotic resistant bacterial strains isolated from wastewater streams in Pakistan. 3 Biotech. 2020; 10(9): 378. https://doi.org/10.1007/s13205-020-02366-3
  7. Mokhtari A., Amini K. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa strains as a Multidrug Resistant (MDR) bacterium and evaluating the prevalence of Esbls and some virulence factors encoding genes by PFGE and ERIC-PCR methods. Iran J. Pharm. Res. 2019; 18(3): 1580–94. https://doi.org/10.22037/ijpr.2019.1100762
  8. Sato H., Frank D.W. ExoU is a potent intracellular phospholipase. Mol. Microbiol. 2004; 53(5): 1279–90. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2004.04194.x
  9. Hardy K.S., Tessmer M.H., Frank D.W., Audia J.P. Perspectives on the Pseudomonas aeruginosa type III secretion system effector ExoU and its subversion of the host innate immune response to infection. Toxins (Basel). 2021; 13(12): 880. https://doi.org/10.3390/toxins13120880
  10. Aloush V., Navon-Venezia S., Seigman-Igra Y., Cabili S., Carmeli Y. Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors and clinical impact. Antimicrob. Agents Chemother. 2006; 50(1): 43–8. https://doi.org/10.1128/AAC.50.1.43-48.2006
  11. Strateva T., Mitov I., Markova B. Prevalence of virulence genes among Bulgarian nosocomial and cystic fibrosis isolates of Pseudomonas aeruginosa. Braz. J. Microbiol. 2010; 41(3): 588–95. https://doi.org/10.1590/S1517-83822010000300008
  12. Jolley K.A., Bray J.E., Maiden M.C.J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 2018; 3: 124. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.14826.1
  13. Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S.M., Seifert H., Wenzel R.P., Edmond M.B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: Analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 2004; 39(3): 309–17. https://doi.org/10.1086/421946
  14. Sawa T., Shimizu M., Moriyama K., Wiener-Kronish J.P. Association between Pseudomonas aeruginosa type III secretion, antibiotic resistance, and clinical outcome: a review. Crit. Care. 2014; 18(6): 668. https://doi.org/10.1186/s13054-014-0668-9
  15. Эйдельштейн М.В., Сухорукова Е.А., Склеенова Е.Ю., Иван чик Н.В., Шайдулина Е.Р., Микотина А.В. и др. Устойчивость к антибиотикам, продукция карбапенемаз и генотипы внутрибольничных штаммов Pseudomonas aeru gi nosa в российских больницах: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН 2015–2016». Клиническая микробиология и антимикробная гемотерапия. 2019; 21(2): 160–70. https://doi.org/10.36488/cmac.2019.2.160-170
  16. Первухин С.А., Стаценко И.А., Иванова Э.Ю., Пальмаш А.В., Витковская И.В., Жидкова О.В. Антибиотикорезистентность грамотрицательных возбудителей нозокомиальной пневмонии у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019; 21(1): 62–8. https://doi.org/10.36488/cmac.2019.1.62-68
  17. Quillici M.C.B., Resende D.S., Gonçalves I.R., Royer S., Sabino S.S., Almeida V.F., et al. Gram-negative bacilli bacteremia: a 7 year retrospective study in a referral Brazilian tertiary-care teaching hospital. J. Med. Microbiol. 2021; 70(1). https://doi.org/10.1099/jmm.0.001277
  18. Tam V.H., Rogers C.A., Chang K.T., Weston J.S., Caeiro J.P., Garey K.W. Impact of Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Bacteremia on Patient Outcomes. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(9): 3717–22. https://doi.org/10.1128/aac.00207-10
  19. Sawa T., Hamaoka S., Kinoshita M., Kainuma A., Naito Y., Akiyama K., et al. Pseudomonas aeruginosa type III secretory toxin ExoU and its predicted homologs. Toxins (Basel). 2016; 8(11): 307. https://doi.org/10.3390/toxins8110307
  20. Zhuo C., Wang L.X., Xiao S.N., Li H.Y., Qiu G.X., Zhong N.S. Clinical significance of virulence-related genes of type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2010; 26(5): 354–9. (in Chinese)
  21. Foulkes D.M., McLean K., Haneef A.S., Fernig D.G., Winstanley C., Berry N., et al. Pseudomonas aeruginosa toxin ExoU as a therapeutic target in the treatment of bacterial infections. Microorganisms. 2019; 7(12): 707. https://doi.org/10.3390/microorganisms7120707
  22. Springer T.I., Reid T.E., Gies S.L., Feix J.B. Interactions of the effector ExoU from Pseudomonas aeruginosa with short-chain phosphatidylinositides provide insights into ExoU targeting to host membranes. J. Biol. Chem. 2019; 294(50): 19012–21. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010278
  23. Wagener B.M., Hu R., Wu S., Pittet J.F., Ding Q., Che P. The role of Pseudomonas aeruginosa virulence factors in cytoskeletal dysregulation and lung barrier dysfunction. Toxins (Basel). 2021; 13(11): 776. https://doi.org/10.3390/toxins13110776
  24. Lomholt J.A., Poulsen K., Kilian M. Epidemic population structure of Pseudomonas aeruginosa: evidence for a clone that is pathogenic to the eye and that has a distinct combination of virulence factors. Infect. Immun. 2001; 69(10): 6284–95. https://doi.org/10.1128/IAI.69.10.6284-6295.2001
  25. Hirakata Y., Finlay B.B., Simpson D.A., Kohno S., Kamihira S., Speert D.P. Penetration of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa through MDCK epithelial cell monolayers. J. Infect. Dis. 2000; 181(2): 765–9. https://dx.doi.org/10.1086/315276.
  26. Zarei O., Mahmoudi H., Bardbari A.M., Karami P., Ali khani M.Y. Detection of virulence factors and antibiotic resistance pattern of clinical and intensive care unit environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa. Infect. Disord. Drug Targets. 2020; 20(5): 758–62. https://doi.org/10.2174/1871526520666191231124717
  27. Elmouaden C., Laglaoui A., Ennanei L., Bakkali M., Abid M. Virulence genes and antibiotic resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients in the Northwestern of Morocco. J. Infect. Dev. Ctries. 2019; 13(10): 892–8. https://doi.org/10.3855/jidc.1067
  28. Del Barrio-Tofiño E., López-Causapé C., Oliver A. Pseudomonas aeruginosa epidemic high-risk clones and their association with horizontally-acquired β-lactamases: 2020 update. Int. J. Antimicrob. Agents. 2020; 56(6): 106196. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.106196
  29. Edelstein M.V., Skleenova E.N., Shevchenko O.V., D’souza J.W., Tapalski D.V., Azizov I.S., et al. Spread of extensively resistant VIM-2-positive ST235 Pseudomonas aeruginosa in Belarus, Kazakhstan, and Russia: a longitudinal epidemiological and clinical study. Lancet Infect. Dis. 2013; 13(10): 867–76. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(13)70168-3
  30. Recio R., Villa J., Viedma E., Orellana M.Á., Lora-Tamayo J., Chaves F. Bacteraemia due to extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa sequence type 235 high-risk clone: Fa cing the perfect storm. Int. J. Antimicrob. Agents. 2018; 52(2): 172–9. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2018.03.018
  31. Vidal F., Mensa J., Almela M., Martínez J.A., Marco F., Casals C., et al. Epidemiology and outcome of Pseudomonas aeruginosa bacteremia, with special emphasis on the influence of antibiotic treatment. Arch. Intern. Med. 1996; 156(18): 2121–6. https://doi.org/10.1001/archinte.1996.00440170139015
  32. Xu H., Cheng J., Yu Q., Li Q., Yi Q., Luo S., et al. Prognostic role of time to positivity of blood culture in children with Pseudomonas aeruginosa bacteremia. BMC Infect. Dis. 2020; 20(1): 665. https://doi.org/10.1186/s12879-020-05257-3
  33. Santoro A., Franceschini E., Meschiari M., Menozzi M., Zona S., Venturelli C., et al. Epidemiology and risk factors associated with mortality in consecutive patients with bacterial bloodstream infection: impact of MDR and XDR bacteria. Open Forum Infect. Dis. 2020; 7(11): ofaa461. https://doi.org/10.1093/ofid/ofaa461
  34. Pilmis B., Alby-Laurent F., Fasola M.L., Seegers V., Guery R., Guet-Revillet H., et al. Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections in children: a 9-year retrospective study. Eur. J. Pediatr. 2020; 179(6): 1247–54. https://doi.org/10.1007/s00431-020-03598-4
  35. Barbosa C., Mahrt N., Bunk J., Graßer M., Rosenstiel P., Jansen G., et al. The genomic basis of rapid adaptation to antibiotic combination therapy in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Biol. Evol. 2021; 38(2): 449–64. https://doi.org/10.1093/molbev/msaa233
  36. Chiong F., Wasef M.S., Liew K.C., Cowan R., Tsai D., Lee Y.P., et al. The impact of infectious diseases consultation on the mana gement and outcomes of Pseudomonas aeruginosa bacte raemia in adults: a retrospective cohort study. BMC Infect. Dis. 2021; 21(1): 671. https://doi.org/10.1186/s12879-021-06372-5

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Фенотипические группы и продукция МБЛ blaVIM у P. aeruginosa. 1 — чувствительные; 2 — МЛУ; 3 — ЭЛУ. Светлые столбики — изоляты, не продуцирующие VIM; темные — продуценты VIM.

Скачать (11KB)
Метаданные
3. Рис. 2. ExoU- и ExoS-типы P. aeruginosa. Светлые столбики — чувствительные к карбапенемам; тёмные — резистентные.

Скачать (15KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Популяционная структура P. aeruginosa. Серым цветом обозначены изоляты, резистентные к карбапенемам, белым — чувствительные

Скачать (66KB)
Метаданные

© Садеева З.З., Новикова И.Е., Алябьева Н.М., Лазарева А.В., Карасева О.В., Фисенко А.П., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах