USING OF UNIVERSAL PLASMID CONSTRUCTIONS FOR DESIGN OF RECOMBINANT ANTIBODIES WITH DEFINED SPECIFICITY IN EUKARYOTIC CELLS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Для защиты от чужеродных патогенов иммунная система позвоночных
постоянно вырабатывает молекулы иммуноглобулинов. Они представля -
ют собой сложные белковые молекулы, которые способны идентифици -
ровать и нейтрализовать антигены, такие как бактерии, вирусы, токсины,
яды и др.
Чаще всего для получения антител используют донорскую кровь и кровь
иммунизированных животных, но их применение ограничивают различные
факторы. Для человеческих антисывороток существует дефицит сырьевой
базы донорских сывороток, имеет место сложность стандартизации, а также
риск заражения пациента редкими патогенами, например, малоизученными
вирусами или прионами. Антисыворотки, полученные от животных, вызыва-
ют различные побочные эффекты в виде аллергических реакций вплоть до
анафилактического шока или образование собственных антител к белкам
сыворотки животного, что существенно снижает эффективность препаратов
животного происхождения при длительной терапии [7].
В 1975 году Кёлер и Мильштейн разработали процедуру эффективного
производства мышиных моноклональных антител желаемой антигенной
специфичности, что положило начало развитию гибридомной технологии [6].
Полученные мышиные антитела не взаимодействовали должным образом с
компонентами иммунной системы человека, и их использование было строго
ограничено.
Достижения в области молекулярной биологии способствовали развитию
генетической инженерии, целью которой было создание на основе генов им-
муноглобулинов плазмидных конструкций, кодирующих рекомбинантные
антитела с заданными свойствами. В зависимости от поставленной задачи
стало возможным изменение размеров антител, их специфичности, аффин-
ности, валентности. Открылись перспективы получения мини-антител, хи-
мерных и гуманизированных антител, которые широко используются в на-
учных исследованиях и медицине [2].
В настоящее время для клинического применения зарегистрированы более
30 препаратов на основе рекомбинантных антител. Из них около 90% пред-
назначены для лечения онкологических заболеваний, например, рака молоч-
ной железы, рака кишечника, В-клеточной лимфоцитарной лейкемии,
Неходжкинской лимфомы, миелолейкоза и др. Также антитела используют в
трансплантологии, для лечения сердечно-сосудистых, аутоиммунных и, в
редких случаях, инфекционных заболеваний [1].
В основе рекомбинантных антител, применяемых в терапии заболеваний
человека, лежат генетические конструкции в виде плазмидных векторов,
адаптированных для эукариотических систем экспрессии, которые чаще все-
го создаются под конкретное антитело каждый раз заново, что увеличивает
стоимость разработки новых конструкций и повышает трудовые и временные
затраты [5, 8]. Ранее были сконструированы и синтезированы последователь-
ности генов легкой и тяжелой цепей химерного антитела, нейтрализующего
дифтерийный токсин — DT-17, которые были клонированы в эукариотиче -
ском векторе pCI-neo («Promega», США) [3]. Нуклеотидные последователь-
ности генов вариабельных областей были получены из мышиной гибридомы,
секретирующей моноклональные антитела DT-17. Особенность сконструи-
рованных плазмидных векторов была в том, что каждый фрагмент гена: ли-
дерная, вариабельная и константная области были фланкированы сайтами
редкощепящих эндонуклеаз рестрикции. Таким образом, были созданы кон-
струкции, которые потенциально позволяют заменять гены вариабельных и
константных областей с целью получения антител другой специфичности,
другого класса или видовой принадлежности. Ранее нами также была получе-
на мышиная гибридома DT-22, продуцирующая антитела к другому эпитопу
дифтерийного токсина (ДТ), чем DT-17 и также обладающая токсиннейтра-
лизующей активностью.
Целью настоящей работы было получение плазмидных конструкций, ко-
дирующих химерные моноклональные антитела к дифтерийному токсину (ДТ)
DT-22, на основе полученных ранее универсальных векторов pLK DT-17 и
pHG DT-17, кодирующих химерные антитела к ДТ DT-17, но связывающих-
ся с другим эпитопом, путем замены в векторах генов вариабельных областей
DT-17 на вариабельные области DT-22.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовалась гибридома DT-22, продуцирующая моно-
клональные антитела, которые обладают нейтрализующей активностью в
отношении дифтерийного токсина.
Гибридомы-продуценты антител к дифтерийному токсину культивирова-
ли на среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и глута-
мина. После восстановления криоконсервированных гибридных клонов перед
выделением из них мРНК их культивировали при 37°С в СО2 инкубаторе в
течение нескольких суток. Морфологию клеток оценивали под инвертиро-
ванным микроскопом, их антитело-образующую способность и активность
антител в культуральной среде — в ИФА. При сохранности специфичных для
каждого клона характеристик, клетки, взятые на стадии экспоненциального
роста, осаждали центрифугированием; осадок клеток использовали для вы-
деления суммарной РНК с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit
(«Qiagen», Германия).
Праймеры для амплификации участков генов, кодирующих вариабельные
фрагменты тяжелой и легкой цепей мышиных IgG, подбирали, руководствуясь
[4]. Олигонуклеотиды синтезировали в компании «Синтол» (Россия).
Получение кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ), амплификацию
доменов вариабельных участков иммуноглобулинов мыши, а также встраива-
ние их в плазмиду, секвенирование ампликонов и плазмиды для контроля
правильности полученной конструкции проводили в соответствии со стан-
дартными методами генной инженерии.
Культуру клеток СНО культивировали на питательных средах RPMI
(«Панэко», Россия) или Opti-MEM («Invitrogen», США) с добавлением и без
добавления фетальной бычьей сыворотки («Gibco», США) в количестве 2,5-
5%. Для трансфекции клеток использовали реактив Lipofectamine 2000
(«Invitrogen», США) согласно рекомендациям производителя, а для аффинной
очистки иммуноглобулинов — протеин-G сефарозу («Биалекса», Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Из гибридомы DT-22, продуцирующей моноклональные антитела к диф-
терийному токсину, выделяли суммарную РНК, в реакции ОТ получали кДНК
с использованием олиготимидинового праймера Т18. Для амплификации
генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G
мыши использовали универсальные праймеры, описанные в [4]. Полученные
ПЦР-продукты секвенировали. На основе нуклеотидных последовательностей
вариабельных генов легкой (L) и тяжелой (H)-цепей были подобраны прай-
меры, которые на 5’-концах содержали «довески», включающие в себя сайты
рестрикции для клонирования в векторы pLK DT-17 и pHG DT-17, получен-
ные ранее и содержащие гены химерного антитела к ДТ (DT-17), направлен-
ного к другому эпитопу токсина [3]. Полученные таким образом ПЦР-продукты
обрабатывали рестриктазами NruI и Bsp13I («СибЭнзим», Россия) для клони-
рования вариабельной области тяжелой цепи антитела DT-22 в вектор pHG
DT-17 и EgeI, Sfr274I («СибЭнзим», Россия) для клонирования вариабельной
области легкой цепи каппа в вектор pLK DT-17 (рис. 1). Соответствующими
рестриктазами также обрабатывали векторы, избавляясь от вырезаемых вста-
вок L и H-цепей вариабельных областей DT-17. Для этого обработанные ре-
стриктазами векторы разделяли в агарозном геле, а затем вырезали из геля
высокомолекулярные фрагменты, представляющие собой плазмидные векто-
ры без вариабельных участков антител DT-17. Затем проводили лигирование
вектора с подготовленными ПЦР-продуктами.
Так как векторные конструкции pLK DT-17 и pHG DT-17 уже содержали
в своем составе нуклеотидные последовательности константных областей
иммуноглобулина G человека, то их клонировать не требовалось.
Для анализа работоспособности полученных рекомбинантных векторов
pLK DT-22 и pHG DT-22 в эукариотической системе ими была проведена
трансфекция клеток CHO. При проведении трансфекции по отдельности и
ко-трансфекции обеими плазмидами был использован реагент для трансфек-
ции Lipofectamine 2000 («Invitrogen», США), согласно инструкции произво-
дителя. Одновременно с трансфекцией был произведен контроль эффектив-
ности трансфекции плазмидой pTurboRFP-C («Евроген», Россия). На третьи
сутки после трансфекции культуральную жидкость отбирали в отдельные про-
бирки и центрифугировали. Полученные осветленные образцы анализирова-
ли методом ИФА. На поверхности планшетов для ИФА был адсорбирован
дифтерийный анатоксин. Планшеты обрабатывали 2-кратными разведениями
препаратов, полученных в результате трансфекции в трех повторах. После
инкубации планшеты промывали и инкубировали с пероксидазным конъю-
гатом, специфичным к Fc-фрагментам человеческих иммуноглобулинов G,
реакцию проявляли ТМВ.
Исследования показали, что в культуральной жидкости после временной
трансфекции обеими плазмидами накапливались антитела, специфичные к
дифтерийному анатоксину. Титры антител составили 1:64. В то же время, до-
стоверной разницы в оптической плотности по результатам ИФА между от-
рицательным контролем — СНО, трансфицированные pTurboRFP-C, образа-
ми культуральной жидкости от нетрансфицированных клеток и в препаратах,
полученных в результате трансфекции каждой плазмидой по отдельности,
выявлено не было. Таким образом, было установлено, что только при одно-
временной транфекции плазмидами, cодержащими L и H-цепи DT-22, детек-
тировалось накопление специфичных антител в супернатантах клеток.
На следующем этапе из двух рекомбинантных плазмид, кодирующих ну-
клеотидные последовательности легкой (pLK DT-22) и тяжелой (pHG DT-22)
цепей химерного антитела к ДТ, был получен супервектор pSV DT-22, объеди-
няющий эти гены в одной плазмидной конструкции. Для этого вектор pLK
DT-22 обрабатывали рестриктазами BamHI и BglII, и фрагмент, содержащий
нуклеотидные последовательности вариабельной и константной областей
легкой цепи химерного антитела, вырезали из геля и очищали с помощью
специализированного набора реагентов («Евроген», Россия). Вектор pHG
DT-22 обрабатывали рестриктазой BamHI. Подготовленные таким образом
векторы лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы («СибЭнзим», Россия).
Получен ной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки
Escherichia coli штамм XL1-Blue. Клоны бактерий для накопления плазмиды
отбирали на основании рестрикционного анализа плазмид выделенных из
отдельных колоний с использованием коммерческого набора фирмы
«ZymoResearch» (США) — ZR Plasmid Miniprep. Отобранные плазмиды сек-
винировали и использовали для трансфекции клеток СНО с целью получения
стабильно трансфицированной культуры клеток. Стабильно трансфициро-
ванную культуру клеток СНО получали методом выращивания клеток в ток-
сичной дозе антибиотика G418 в течение 14 дней.
Химерные антитела к дифтерийному токсину, полученные в результате
временной и стабильной трансфекции «супервектором» pSV DT-22, были
проанализированы в реакции ИФА. При временной трансфекции титр спец-
ифических антител против ДТ составил 1:128, а при стабильной — 1:16.
Из стабильно-трансфицированной культуры были получены 40 клонов,
самый продуктивный из которых секретировал антитела в титре 1:1024, что в
64 раза больше по сравнению с исходной стабильно трансфицированной
культурой СНО.
Для оценки выхода антител от высокопродуктивного клона собранную на
4 сутки культуральную среду центрифугировали для избавления от дебриса и
клеток, а супернатант собирали для аффинного выделения химерных антител
к ДТ на протеин-G сефарозе. Выход антител в элюате составил около 4 мг с
каждого литра культуральной среды (рис. 2).
Сконцентрированные антитела диализова-
ли, проводили стерилизующую фильтрацию
через фильтр с мембраной PES и диаметром
пор 0,2 мкм и использовали для оценки ток-
синнейтрализующей активности в реакции
нейтрализации ДТ в культуре клеток СНО
(табл.).
Оценку токсиннейтрализующей активно-
сти химерных антител DT-22 проводили в
96-луночном планшете. Для этого готовили
2-кратные разведения химерных антител и
вносили препараты в лунки в объеме 100 мкл/
лунку, после чего добавляли в каждую лунку по
4 цитотоксические дозы ДТ (0,0025 Lf/мл) в
объеме 50 мкл и 100 мкл среды RPMI-1640.
Далее вносили по 100 мкл суспензии предва-
рительно снятых 0,25% раствором трипсина-
ЭДТА и отмытых центрифугированием клеток
СНО в концентрации 106 клеток на планшет
(104 на лунку). Планшет помеща-
ли в СО2 инкубатор при 37°С. Для
контроля брали стандартную про-
тиводифтерийную сыворотку, ко -
торую также титровали с 2-крат-
ным шагом, начиная с 0,01 МЕ/
мл. Учет результатов реакции про-
водили через 48 час под микро-
скопом и через 72 часа — колори-
метрически. Закисление среды
свидетельствовало о пролифера-
ции клеток в лунках с полностью
нейтрализованным исследуемы -
ми препаратами ДТ. В результате
нейтрализующая активность хи-
мерных антител DT-22 с дифте-
рийным токсином в культуре клеток СНО наблюдалась при концентрации
антител 22 мкг/мл.
Таким образом, общепринятыми молекулярно-биологическими и генно-
инженерными методами были получены рекомбинантные векторы pLK DT-22
и pHG DT-22, кодирующие соответственно вариабельные области легкой и
тяжелой цепей химерного антитела DT-22. Векторные конструкции были
спроектированы таким образом, чтобы не требовалось при изменении спец-
ифичности антител синтезировать гены вариабельных участков легкой и тя-
желой цепей, а достаточно было получить ПЦР-продукты генов H и L-цепей
с «довесками», содержащими сайты рестрикции для клонирования в универ-
сальный вектор.
Для получения «супервектора» pSV DT-22 вектор pLK DT-22 обрабатыва-
ли рестриктазами BamHI (G^GATCC) и BglII (A^GATCT), а pHG DT-22 —
только BamHI. Особенность данного подхода в том, что «липкие» фрагменты,
получаемые при рестрикции вектора pLK DT-22 двумя разными рестриктаза-
ми, одинаковые — GATC. Таким образом, лигирование гена легкой цепи в
pHG DT-22 может происходить как в прямой, так и в обратной ориентации,
при этом в зависимости от ориентации сайт рестрикции BamHI может менять
локализацию, в то же время, сайт рестрикции BglII пропадает при любой
ориентации гена легкой цепи. Эта особенность позволяет рестрикционным
анализом оценивать ориентацию встраиваемого гена. Нами были получены
оба варианта «супервекторов». Достоверной разницы в выходе специфических
антител к ДТ в культуре клеток СНО в зависимости от ориентации генов от-
носительно друг друга при временной трансфекции выявлено не было.
«Супервектор» pSV DT-22 содержит ген устойчивости к антибиотику G418,
что позволило использовать его для получения стабильно трансфицированной
культуры клеток и последующего клонирования. С целью увеличения выхода
целевого продукта из стабильно трансфицированной культуры клеток СНО
был выделен высокопродуктивный клон DT-22-7-С20, его продуктивность в
64 раза превышала выход специфических антител из исходной культуры кле-
ток. Экспериментально показано, что получаемые антитела являются химер-
ными, то есть содержат мышиные антиген-распознающие вариабельные
фрагменты и человеческий Fc-фрагмент, они секретируются из клеток и об-
ладают специфичностью к дифтерийному токсину/анатоксину.
Перед оценкой токсиннейтрализующей активности химерных антител их
предварительно очищали с использованием аффинной очитки на протеин-G
сефарозе. После чего проводили диализ и фильтрацию через фильтр с мем-
браной PES и размером пор 0,2 мкм, на каждом этапе полученный материал
анализировали в ИФА. Очистка и концентрирование антител имели решающее
значение, так как низкая концентрация антител в образце не позволяла
определить их токсиннейтрализующие свойства.
Показано, что применение аффинной очистки увеличивает титр антител
с 1:1024 до 1:12800. При этом некоторое количество антител теряется при
фильтрации, хотя PES мембрана обладает пониженной белковой сорбцией.

About the authors

T. G. Samartseva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. S. Oksanich

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

N. F. Gavrilova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

I. V. Yakovleva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

V. V. Sviridov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

V. V. Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files