ПРИМЕНЕНИЕ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ЗАДАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ
Для защиты от чужеродных патогенов иммунная система позвоночных
постоянно вырабатывает молекулы иммуноглобулинов. Они представля -
ют собой сложные белковые молекулы, которые способны идентифици -
ровать и нейтрализовать антигены, такие как бактерии, вирусы, токсины,
яды и др.
Чаще всего для получения антител используют донорскую кровь и кровь
иммунизированных животных, но их применение ограничивают различные
факторы. Для человеческих антисывороток существует дефицит сырьевой
базы донорских сывороток, имеет место сложность стандартизации, а также
риск заражения пациента редкими патогенами, например, малоизученными
вирусами или прионами. Антисыворотки, полученные от животных, вызыва-
ют различные побочные эффекты в виде аллергических реакций вплоть до
анафилактического шока или образование собственных антител к белкам
сыворотки животного, что существенно снижает эффективность препаратов
животного происхождения при длительной терапии [7].
В 1975 году Кёлер и Мильштейн разработали процедуру эффективного
производства мышиных моноклональных антител желаемой антигенной
специфичности, что положило начало развитию гибридомной технологии [6].
Полученные мышиные антитела не взаимодействовали должным образом с
компонентами иммунной системы человека, и их использование было строго
ограничено.
Достижения в области молекулярной биологии способствовали развитию
генетической инженерии, целью которой было создание на основе генов им-
муноглобулинов плазмидных конструкций, кодирующих рекомбинантные
антитела с заданными свойствами. В зависимости от поставленной задачи
стало возможным изменение размеров антител, их специфичности, аффин-
ности, валентности. Открылись перспективы получения мини-антител, хи-
мерных и гуманизированных антител, которые широко используются в на-
учных исследованиях и медицине [2].
В настоящее время для клинического применения зарегистрированы более
30 препаратов на основе рекомбинантных антител. Из них около 90% пред-
назначены для лечения онкологических заболеваний, например, рака молоч-
ной железы, рака кишечника, В-клеточной лимфоцитарной лейкемии,
Неходжкинской лимфомы, миелолейкоза и др. Также антитела используют в
трансплантологии, для лечения сердечно-сосудистых, аутоиммунных и, в
редких случаях, инфекционных заболеваний [1].
В основе рекомбинантных антител, применяемых в терапии заболеваний
человека, лежат генетические конструкции в виде плазмидных векторов,
адаптированных для эукариотических систем экспрессии, которые чаще все-
го создаются под конкретное антитело каждый раз заново, что увеличивает
стоимость разработки новых конструкций и повышает трудовые и временные
затраты [5, 8]. Ранее были сконструированы и синтезированы последователь-
ности генов легкой и тяжелой цепей химерного антитела, нейтрализующего
дифтерийный токсин — DT-17, которые были клонированы в эукариотиче -
ском векторе pCI-neo («Promega», США) [3]. Нуклеотидные последователь-
ности генов вариабельных областей были получены из мышиной гибридомы,
секретирующей моноклональные антитела DT-17. Особенность сконструи-
рованных плазмидных векторов была в том, что каждый фрагмент гена: ли-
дерная, вариабельная и константная области были фланкированы сайтами
редкощепящих эндонуклеаз рестрикции. Таким образом, были созданы кон-
струкции, которые потенциально позволяют заменять гены вариабельных и
константных областей с целью получения антител другой специфичности,
другого класса или видовой принадлежности. Ранее нами также была получе-
на мышиная гибридома DT-22, продуцирующая антитела к другому эпитопу
дифтерийного токсина (ДТ), чем DT-17 и также обладающая токсиннейтра-
лизующей активностью.
Целью настоящей работы было получение плазмидных конструкций, ко-
дирующих химерные моноклональные антитела к дифтерийному токсину (ДТ)
DT-22, на основе полученных ранее универсальных векторов pLK DT-17 и
pHG DT-17, кодирующих химерные антитела к ДТ DT-17, но связывающих-
ся с другим эпитопом, путем замены в векторах генов вариабельных областей
DT-17 на вариабельные области DT-22.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовалась гибридома DT-22, продуцирующая моно-
клональные антитела, которые обладают нейтрализующей активностью в
отношении дифтерийного токсина.
Гибридомы-продуценты антител к дифтерийному токсину культивирова-
ли на среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и глута-
мина. После восстановления криоконсервированных гибридных клонов перед
выделением из них мРНК их культивировали при 37°С в СО2 инкубаторе в
течение нескольких суток. Морфологию клеток оценивали под инвертиро-
ванным микроскопом, их антитело-образующую способность и активность
антител в культуральной среде — в ИФА. При сохранности специфичных для
каждого клона характеристик, клетки, взятые на стадии экспоненциального
роста, осаждали центрифугированием; осадок клеток использовали для вы-
деления суммарной РНК с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit
(«Qiagen», Германия).
Праймеры для амплификации участков генов, кодирующих вариабельные
фрагменты тяжелой и легкой цепей мышиных IgG, подбирали, руководствуясь
[4]. Олигонуклеотиды синтезировали в компании «Синтол» (Россия).
Получение кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ), амплификацию
доменов вариабельных участков иммуноглобулинов мыши, а также встраива-
ние их в плазмиду, секвенирование ампликонов и плазмиды для контроля
правильности полученной конструкции проводили в соответствии со стан-
дартными методами генной инженерии.
Культуру клеток СНО культивировали на питательных средах RPMI
(«Панэко», Россия) или Opti-MEM («Invitrogen», США) с добавлением и без
добавления фетальной бычьей сыворотки («Gibco», США) в количестве 2,5-
5%. Для трансфекции клеток использовали реактив Lipofectamine 2000
(«Invitrogen», США) согласно рекомендациям производителя, а для аффинной
очистки иммуноглобулинов — протеин-G сефарозу («Биалекса», Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Из гибридомы DT-22, продуцирующей моноклональные антитела к диф-
терийному токсину, выделяли суммарную РНК, в реакции ОТ получали кДНК
с использованием олиготимидинового праймера Т18. Для амплификации
генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина G
мыши использовали универсальные праймеры, описанные в [4]. Полученные
ПЦР-продукты секвенировали. На основе нуклеотидных последовательностей
вариабельных генов легкой (L) и тяжелой (H)-цепей были подобраны прай-
меры, которые на 5’-концах содержали «довески», включающие в себя сайты
рестрикции для клонирования в векторы pLK DT-17 и pHG DT-17, получен-
ные ранее и содержащие гены химерного антитела к ДТ (DT-17), направлен-
ного к другому эпитопу токсина [3]. Полученные таким образом ПЦР-продукты
обрабатывали рестриктазами NruI и Bsp13I («СибЭнзим», Россия) для клони-
рования вариабельной области тяжелой цепи антитела DT-22 в вектор pHG
DT-17 и EgeI, Sfr274I («СибЭнзим», Россия) для клонирования вариабельной
области легкой цепи каппа в вектор pLK DT-17 (рис. 1). Соответствующими
рестриктазами также обрабатывали векторы, избавляясь от вырезаемых вста-
вок L и H-цепей вариабельных областей DT-17. Для этого обработанные ре-
стриктазами векторы разделяли в агарозном геле, а затем вырезали из геля
высокомолекулярные фрагменты, представляющие собой плазмидные векто-
ры без вариабельных участков антител DT-17. Затем проводили лигирование
вектора с подготовленными ПЦР-продуктами.
Так как векторные конструкции pLK DT-17 и pHG DT-17 уже содержали
в своем составе нуклеотидные последовательности константных областей
иммуноглобулина G человека, то их клонировать не требовалось.
Для анализа работоспособности полученных рекомбинантных векторов
pLK DT-22 и pHG DT-22 в эукариотической системе ими была проведена
трансфекция клеток CHO. При проведении трансфекции по отдельности и
ко-трансфекции обеими плазмидами был использован реагент для трансфек-
ции Lipofectamine 2000 («Invitrogen», США), согласно инструкции произво-
дителя. Одновременно с трансфекцией был произведен контроль эффектив-
ности трансфекции плазмидой pTurboRFP-C («Евроген», Россия). На третьи
сутки после трансфекции культуральную жидкость отбирали в отдельные про-
бирки и центрифугировали. Полученные осветленные образцы анализирова-
ли методом ИФА. На поверхности планшетов для ИФА был адсорбирован
дифтерийный анатоксин. Планшеты обрабатывали 2-кратными разведениями
препаратов, полученных в результате трансфекции в трех повторах. После
инкубации планшеты промывали и инкубировали с пероксидазным конъю-
гатом, специфичным к Fc-фрагментам человеческих иммуноглобулинов G,
реакцию проявляли ТМВ.
Исследования показали, что в культуральной жидкости после временной
трансфекции обеими плазмидами накапливались антитела, специфичные к
дифтерийному анатоксину. Титры антител составили 1:64. В то же время, до-
стоверной разницы в оптической плотности по результатам ИФА между от-
рицательным контролем — СНО, трансфицированные pTurboRFP-C, образа-
ми культуральной жидкости от нетрансфицированных клеток и в препаратах,
полученных в результате трансфекции каждой плазмидой по отдельности,
выявлено не было. Таким образом, было установлено, что только при одно-
временной транфекции плазмидами, cодержащими L и H-цепи DT-22, детек-
тировалось накопление специфичных антител в супернатантах клеток.
На следующем этапе из двух рекомбинантных плазмид, кодирующих ну-
клеотидные последовательности легкой (pLK DT-22) и тяжелой (pHG DT-22)
цепей химерного антитела к ДТ, был получен супервектор pSV DT-22, объеди-
няющий эти гены в одной плазмидной конструкции. Для этого вектор pLK
DT-22 обрабатывали рестриктазами BamHI и BglII, и фрагмент, содержащий
нуклеотидные последовательности вариабельной и константной областей
легкой цепи химерного антитела, вырезали из геля и очищали с помощью
специализированного набора реагентов («Евроген», Россия). Вектор pHG
DT-22 обрабатывали рестриктазой BamHI. Подготовленные таким образом
векторы лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы («СибЭнзим», Россия).
Получен ной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки
Escherichia coli штамм XL1-Blue. Клоны бактерий для накопления плазмиды
отбирали на основании рестрикционного анализа плазмид выделенных из
отдельных колоний с использованием коммерческого набора фирмы
«ZymoResearch» (США) — ZR Plasmid Miniprep. Отобранные плазмиды сек-
винировали и использовали для трансфекции клеток СНО с целью получения
стабильно трансфицированной культуры клеток. Стабильно трансфициро-
ванную культуру клеток СНО получали методом выращивания клеток в ток-
сичной дозе антибиотика G418 в течение 14 дней.
Химерные антитела к дифтерийному токсину, полученные в результате
временной и стабильной трансфекции «супервектором» pSV DT-22, были
проанализированы в реакции ИФА. При временной трансфекции титр спец-
ифических антител против ДТ составил 1:128, а при стабильной — 1:16.
Из стабильно-трансфицированной культуры были получены 40 клонов,
самый продуктивный из которых секретировал антитела в титре 1:1024, что в
64 раза больше по сравнению с исходной стабильно трансфицированной
культурой СНО.
Для оценки выхода антител от высокопродуктивного клона собранную на
4 сутки культуральную среду центрифугировали для избавления от дебриса и
клеток, а супернатант собирали для аффинного выделения химерных антител
к ДТ на протеин-G сефарозе. Выход антител в элюате составил около 4 мг с
каждого литра культуральной среды (рис. 2).
Сконцентрированные антитела диализова-
ли, проводили стерилизующую фильтрацию
через фильтр с мембраной PES и диаметром
пор 0,2 мкм и использовали для оценки ток-
синнейтрализующей активности в реакции
нейтрализации ДТ в культуре клеток СНО
(табл.).
Оценку токсиннейтрализующей активно-
сти химерных антител DT-22 проводили в
96-луночном планшете. Для этого готовили
2-кратные разведения химерных антител и
вносили препараты в лунки в объеме 100 мкл/
лунку, после чего добавляли в каждую лунку по
4 цитотоксические дозы ДТ (0,0025 Lf/мл) в
объеме 50 мкл и 100 мкл среды RPMI-1640.
Далее вносили по 100 мкл суспензии предва-
рительно снятых 0,25% раствором трипсина-
ЭДТА и отмытых центрифугированием клеток
СНО в концентрации 106 клеток на планшет
(104 на лунку). Планшет помеща-
ли в СО2 инкубатор при 37°С. Для
контроля брали стандартную про-
тиводифтерийную сыворотку, ко -
торую также титровали с 2-крат-
ным шагом, начиная с 0,01 МЕ/
мл. Учет результатов реакции про-
водили через 48 час под микро-
скопом и через 72 часа — колори-
метрически. Закисление среды
свидетельствовало о пролифера-
ции клеток в лунках с полностью
нейтрализованным исследуемы -
ми препаратами ДТ. В результате
нейтрализующая активность хи-
мерных антител DT-22 с дифте-
рийным токсином в культуре клеток СНО наблюдалась при концентрации
антител 22 мкг/мл.
Таким образом, общепринятыми молекулярно-биологическими и генно-
инженерными методами были получены рекомбинантные векторы pLK DT-22
и pHG DT-22, кодирующие соответственно вариабельные области легкой и
тяжелой цепей химерного антитела DT-22. Векторные конструкции были
спроектированы таким образом, чтобы не требовалось при изменении спец-
ифичности антител синтезировать гены вариабельных участков легкой и тя-
желой цепей, а достаточно было получить ПЦР-продукты генов H и L-цепей
с «довесками», содержащими сайты рестрикции для клонирования в универ-
сальный вектор.
Для получения «супервектора» pSV DT-22 вектор pLK DT-22 обрабатыва-
ли рестриктазами BamHI (G^GATCC) и BglII (A^GATCT), а pHG DT-22 —
только BamHI. Особенность данного подхода в том, что «липкие» фрагменты,
получаемые при рестрикции вектора pLK DT-22 двумя разными рестриктаза-
ми, одинаковые — GATC. Таким образом, лигирование гена легкой цепи в
pHG DT-22 может происходить как в прямой, так и в обратной ориентации,
при этом в зависимости от ориентации сайт рестрикции BamHI может менять
локализацию, в то же время, сайт рестрикции BglII пропадает при любой
ориентации гена легкой цепи. Эта особенность позволяет рестрикционным
анализом оценивать ориентацию встраиваемого гена. Нами были получены
оба варианта «супервекторов». Достоверной разницы в выходе специфических
антител к ДТ в культуре клеток СНО в зависимости от ориентации генов от-
носительно друг друга при временной трансфекции выявлено не было.
«Супервектор» pSV DT-22 содержит ген устойчивости к антибиотику G418,
что позволило использовать его для получения стабильно трансфицированной
культуры клеток и последующего клонирования. С целью увеличения выхода
целевого продукта из стабильно трансфицированной культуры клеток СНО
был выделен высокопродуктивный клон DT-22-7-С20, его продуктивность в
64 раза превышала выход специфических антител из исходной культуры кле-
ток. Экспериментально показано, что получаемые антитела являются химер-
ными, то есть содержат мышиные антиген-распознающие вариабельные
фрагменты и человеческий Fc-фрагмент, они секретируются из клеток и об-
ладают специфичностью к дифтерийному токсину/анатоксину.
Перед оценкой токсиннейтрализующей активности химерных антител их
предварительно очищали с использованием аффинной очитки на протеин-G
сефарозе. После чего проводили диализ и фильтрацию через фильтр с мем-
браной PES и размером пор 0,2 мкм, на каждом этапе полученный материал
анализировали в ИФА. Очистка и концентрирование антител имели решающее
значение, так как низкая концентрация антител в образце не позволяла
определить их токсиннейтрализующие свойства.
Показано, что применение аффинной очистки увеличивает титр антител
с 1:1024 до 1:12800. При этом некоторое количество антител теряется при
фильтрации, хотя PES мембрана обладает пониженной белковой сорбцией.

Об авторах

Т. Г. Самарцева

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: fake@neicon.ru

105064, Москва, М.Казенный пер., 5а,

(495)917-49-00

Россия

А. С. Оксанич

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Н. Ф. Гаврилова

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

И. В. Яковлева

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

В. В. Свиридов

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

В. В. Зверев

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Email: fake@neicon.ru
Москва Россия

Список литературы

Дополнительные файлы