Bioconjugation as a promising method for vaccine development

Full Text

Введение

В ноябре 2024 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) уточнила список приоритетных эндемичных патогенов, в вакцинах против которых существует наибольшая необходимость [1], отметив при этом, что вакцинация позволяет не только сократить заболеваемость, но и уменьшить употребление антибиотиков, тем самым снижая смертность, вызванную антибиотикорезистентными штаммами. Согласно расчётам ВОЗ, вакцинация против 23 патогенов может снизить потребность в антибиотиках на 22% [2]. Более того, масштабное применение уже существующих вакцин против пневмококка, гемофильной палочки типа b и брюшного тифа потенциально позволит каждый год предотвращать до 106 тыс. смертей, обусловленных распространением устойчивости к противомикробным препаратам. Разработка и глобальное внедрение новых вакцин против Mycobacterium tuberculosis и Klebsiella pneumoniae в перспективе позволят ежегодно предотвращать более 500 тыс. случаев смертей, вызванных устойчивостью к противомикробным препаратам. Для изготовления наиболее эффективных вакцин в настоящий момент используются самые разные подходы. Одним из них является биоконъюгация, или технология рекомбинантного бактериального гликозилирования (protein glycan coupling technology, PGCT).

Цель данного обзора — анализ и обобщение актуальных данных как о самом методе биоконъюгации, так и о биохимических процессах, лежащих в его основе, а также о разрабатываемых с его использованием вакцинах.

При подготовке обзора был проведён анализ как англо-, так и русскоязычной литературы, представленной в научных базах PubMed, Scopus, Google Scholar, eLIBRARY.RU по состоянию на февраль 2025 г. Для поиска использовали следующие ключевые слова: bioconjugation, vaccines, PGCT, биоконъюгация, конъюгированные вакцины, бактериальное гликозилирование. На первом этапе при запросе «bioconjugation» за 1968–2025 гг. было обнаружено более 6000 источников, число которых путём комбинирования запросов было уменьшено до 250. Из них сначала были отобраны работы 2010–2025 гг., что сократило количество до 178, вслед за чем был добавлен ряд релевантных статей без временны́х ограничений для максимально полного освещения исследуемой проблемы. В связи с ограничением по объёму статьи отобрано 59 наиболее релевантных источника. Также из подборки были исключены работы, для которых невозможно было получить полный текст статьи, источники не на английском языке, а также те русскоязычные статьи, в которых затронутая проблема упоминалась, но не освещалась подробно, ограничиваясь ссылками на уже использованные в обзоре иностранные источники.

Ключевые особенности биоконъюгации

PGCT была создана на основе описанной в 1999 г. [3] способности микроорганизма Campylobacter jejuni осуществлять N-гликозилирование белков с помощью олигосахарилтрансферазы (ОСТ) PglB, экспрессируемой наряду с другими ферментами кластером, получившим название pgl (protein glycosylation). PglB является мембранным ферментом с активным центром, обращённым в периплазматическое пространство. Он способен присоединять олигосахарид, состоящий в основном из мономеров N-ацетилгалактозамина (GalNac), к остатку аспарагина, расположенному в центре так называемой акцепторной последовательности [4]. Акцепторная последовательность PglB следующая: Asp/Glu — Y — Asn — X — Ser/Tre, где X и Y — любые аминокислоты, кроме пролина [5]. Присоединение олигосахарида идёт через амидную группу аспарагина и относится к N-гликозилированию. Кластер pgl успешно клонирован в Escherichia coli и продемонстрировал способность экспрессировать весь набор необходимых для гликозилирования ферментов, а также — при наличии белков с необходимой акцепторной последовательностью — осуществлять собственно гликозилирование [6]. Таким образом, появилась возможность получать гликозилированные белки непосредственно в E. coli. Этот процесс получил название биоконъюгации, или технологии PGCT (рисунок).

 

Общая схема PGCT в клетках E. coli ([18], с изменениями).

а — этап трансформации бактерий плазмидами, содержащими нуклеотидные последовательности, кодирующие, соответственно, белок-носитель с акцепторной последовательностью, специфичной для используемой ОСТ, набор углеводов, необходимых для его гликозилирования, а также кластер, содержащий необходимые для гликозилирования ферменты; б — процесс собственно гликозилирования, протекающий на внутренней мембране модифицированных для более эффективного синтеза биоконъюгатов клеток E. coli.

WaaL — О-антиген лигаза E. coli, конкурирующая с рекомбинантной ОСТ за олигосахара; WecA — фермент, катализирующий биосинтез нативных гликанов бактерии-продуцента; флиппаза — фермент, переносящий углеводную последовательность в периплазматическое пространство.

 

Исторически в производстве вакцин на базе полисахаридных антигенов используются углеводы, химическим способом ковалентно присоединенные к белку-носителю, выполняющему функции Т-клеточного антигена и частично адъюванта. Открытие бактериального N-гликозилирования и возможности его функционального переноса в E. coli позволило начать разработку препаратов, в которых и получение антигенов, и их конъюгация происходит непосредственно в организме-продуценте, что упрощает и удешевляет процесс.

Первые попытки создать вакцину с помощью технологий PGCT появились в 2010 г. [7]. J. Ihssen и соавт. опубликовали сообщение об успешном получении в E. coli конъюгатов, состоящих из О-антигена Shigella dysenteriae серотип 1 и белков AcrA C. jejuni и экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa (EPA) соответственно. После этого сообщения о разработке новых вакцин против самых разных патогенов на базе PGCT стали поступать регулярно. Однако сразу возникли трудности, связанные прежде всего с тем, что PglB способен переносить только олигосахариды с редуцирующим концевым остатком, катализируя образование связи по ацетамидной группе во 2-м положении, что резко ограничивает количество углеводных антигенов, которые можно использовать. Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи стали применять О-гликозилирующие бактериальные ОСТ, которые были обнаружены в таких видах как P. aeruginosa, Neisseria meningitides, Francisella tularensis, Acinetobacter baylyi.

В случае P. aeruginosa функции ОСТ выполняет фермент PilO, который переносит гликаны на белок PilA (пилин IV типа) [8]. N. meningitides экспрессирует белок PglL, кодируемый геном pglL, также гликозилирующий пилины [9]. F. tularensis содержит фермент PglA, осуществляющий присоединение пентасахаридов к белку PilA [10]. Фермент PglS из A. baylyi — О-гликозилтрансфераза, переносящая углеводные остатки на пилиноподобный белок ComP [11]. Все перечисленные белки при клонировании в E. coli продемонстрировали способность гликозилировать свои нативные субстраты [12]. При этом PilO переносил только короткие олигосахариды, тогда как PglL осуществлял гликозилирование длинными олигосахаридами, а кроме того, взаимодействовал с такими гликанами, которые для PglB недоступны, например, с О4 О-антигеном Salmonella typhimurium. Относительно PglS было выяснено, что он способен переносить олигосахариды с глюкозой в качестве редуцирующего концевого сахара, что выгодно выделяет его среди других бактериальных ОСТ [13]. Используя эти ферменты, исследователи смогли разработать и получить биоконъюгаты, способные вызывать иммунные реакции как у лабораторных животных, так и у людей. В настоящий момент в разной степени готовности находятся потенциальные биоконъюгатные вакцины против шигелл, патогенной E. coli, клебсиелл, пневмококка, бруцелл, золотистого стафилококка и других патогенов, составляющих наибольшую угрозу здравоохранению [2].

Биоконъюгированные вакцины против Shigella

Шигеллёз, или бактериальная дизентерия, вызывается микробами рода Shigella. Это грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, которые проникают в желудочно-кишечный тракт, инфицируют слизистую оболочку толстой кишки и вызывают воспаление. Шигеллёз является одной из основных причин смертей от диареи во всём мире. Больше всего страдают дети в возрасте до 5 лет в странах с низким и средним уровнем дохода [14]. В настоящий момент известно четыре вида шигелл: S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae и S. boydii. Наибольшую угрозу представляет вид S. flexneri. Известны 15 серотипов S. flexneri, наиболее распространённым из которых является S. flexneri 2а, за которым следуют S. flexneri 3а и S. flexneri 6. S. sonnei — доминирующий вид шигелл в промышленно развитых странах, для него известен один серотип. Несмотря на большое количество разработок, вышедших на стадию клинических испытаний [15] (таблица), лицензированной международной вакцины против шигеллёза пока не существует.

 

Биоконъюгированные вакцины против различных патогенов, разрабатываемые в настоящее время

Патоген	Название препарата/характеристика биоконъюгата	Этап	Источник
Shigella spp.	GVXN SD133	Фаза I клинических испытаний	[17]
	Flexyn 2a	Фаза 2b клинических испытаний	[19]
	S4V	Фаза 1/2 клинических испытаний	NCT04056117 — ClinicalTrials.gov
Патогенная E. coli (E. coli O157)	Конъюгат О-антигена и МВР E. coli O157, ОСТ — PglB	Доклинические испытания на мышах	[23]
	Конъюгат О-антигена и белка CmeA Citrobacter sedlakii NRC6070, ОСТ — PglB	Лабораторные испытания	[25]
Внекишечная патогенная E. coli	ExPEC9V	Фаза III клинических испытаний	NCT04899336 — ClinicalTrials.gov
	ExPEC10V	I и II фазы клинических испытаний	NCT04306302, NCT03819049 — ClinicalTrials.gov
	Конъюгат O25B-антиген ExPEC и EPA, ОСТ — PglB	Лабораторные испытания	[32]
K. pneumoniae гипервирулентного типа (hvKp)	Конъюгат капсульных полисахаридов серотипов К1 и К2 с белком ЕРА-ComP, ОСТ — PglS	Доклинические испытания на мышах	[34]
K. pneumoniae	Конъюгат О-антигенов липополисахарида и белка ЕРА, ОСТ — PglS	Доклинические испытания на мышах	[36]
K. pneumoniaе О1	KPO1-VLP	Доклинические испытания на мышах	[37]
S. pneumonia	Конъюгат капсульного полисахарида серотипа 4 и белка AcrA, ОСТ — PglB	Доклинические испытания на мышах	[39]
	Конъюгаты капсульного полисахарида ST4 и белков NanA, Sp-148, PiuA, ОСТ PglB	Доклинические испытания на мышах	[43]
	CPS8-EPAiGTcc	Доклинические испытания на мышах	[44]
S. agalactiae	Конъюгат полисахаридов серотипов Ia, Ib и III с белком ЕРА-ComP, ОСТ — PglS	Доклинические испытания на мышах	[47]
B. abortus	Конъюгат О-полисахаридов Yersinia enterocolitica и холерного токсина В, ОСТ — PglL	Доклинические испытания на мышах	[52]
	Конъюгат О-полисахаридов Brucella и наночастиц Nano-B5, ОСТ — PglL	Доклинические испытания на мышах	[54]
S. aureus	CP5-ЕРА, CP8-ЕРА и CP5-Hla	Доклинические испытания на мышах	[56]
F. tularensis	Конъюгат О-антигена F. tularensis и ЕРА	Доклинические испытания на мышах	[58]
	Конъюгат О-антигена F. tularensis и белка CmeA Citrobacter sedlakii NRC6070, ОСТ — PglB	Лабораторные испытания	[25]

 

Первой биоконъюгированной вакциной, протестированной на людях, была кандидатная вакцина против S. dysenteriae [16]. При её создании полисахарид О-антигена S. dysenteriae типа О1 был биоконъюгирован в E. coli с рекомбинантной версией ЕРА и кластером PglB, получил название GVXN SD133 и прошел фазу I клинических испытаний [17]. Результаты показали, что вне зависимости от способа введения препарат хорошо переносился и обладал приемлемым уровнем безопасности. В крови вакцинированных было выявлено статистически значимое повышение уровня антител классов IgG и IgA против полисахарида О1 [16].

Затем была создана другая моновалентная вакцина против шигелл на основе О-антигена S. flexneri 2a, разработанная также на базе PglB. В качестве белкового носителя был выбран тот же rEPA. Биоконъюгат получил название Flexyn 2a. Были подтверждены безопасность и иммуногенность этого прототипа вакцины. Аналогично результатам, полученным в ходе исследования вакцины против S. dysenteriae, иммунизация препаратом Flexyn 2a выявила значительное повышение титров антител классов IgG и IgA против липополисахарида S. flexneri 2а [18]. Рандомизированное двойное слепое и плацебо-контролируемое исследование фазы 2b [19] показало достаточный уровень безопасности и иммуногенности вакцины. Эффективность биоконъюгата Flexyn 2a была дополнительно подтверждена и другими методами, включая оценку степени тяжести протекания шигеллёза. Было показано, что у вакцинированных этот показатель был ниже, чем у пациентов, получавших плацебо [20].

Многообещающие результаты, продемонстрированные при создании и испытании Flexyn 2a, способствовали разработке поливалентной вакцины. S4V — это четырёхвалентная биоконъюгированная вакцина, которая содержит О-антигены S. flexneri серотипов 2а, 3а, 6, а также S. sonnei, соединённые с белком-носителем EPA. В настоящее время в Кении проводится двойное слепое исследование S4V по подбору дозы и возрастной категории (взрослые, дети, младенцы). Данные, собранные в ходе этого исследования, станут важным шагом в разработке вакцины против шигелл [21].

Биоконъюгированные вакцины против патогенных штаммов Escherichia coli

Патогенные штаммы E. coli делятся на две группы: внекишечная патогенная E. coli (ExPEC) и кишечная патогенная E. coli (InPEC). Штаммы ExPEC в основном связаны с неонатальным менингитом и инфекциями мочевыводящих путей у взрослых (ИМП). Штаммы InPEC вызывают различные диарейные заболевания и подразделяются на 6 патотипов, в том числе энтерогеморрагические штаммы E. coli. Одним из наиболее распространённых представителей штаммов группы ЕНЕС является энтерогеморрагическая кишечная палочка O157:H7 (E. coli O157), она вызывает диарею, геморрагический колит и гемолитико-уремический синдром [22]. Потребность в вакцинах для профилактики E. coli O157 очень высока. Работы по их созданию ведутся уже довольно давно, ряд препаратов проходит доклинические и клинические испытания, в том числе биоконъюгированная вакцина [23]. В качестве белка-носителя авторы выбрали мальтозосвязывающий белок, поскольку недавние исследования показали, что он является агонистом TLR4 и индуцирует активацию сигнального пути NF-κB, а также секрецию ряда провоспалительных цитокинов [24]. Конъюгацию осуществляли, используя PglB, к белку присоединяли О-антиген E. coli O157, организмом-продуцентом выступал штамм E. coli W3110. Полученный в результате биоконъюгат вызывал активацию как гуморального, так и клеточного звена иммунитета [23].

Ещё один прототип биоконъюгированной вакцины против E. coli O157 был создан с использованием экспериментальной технологии MAGIC (Mobile-element Assisted Glycoconjugation by Insertion on Chromosome) [25]. Суть метода заключается в использовании мобильных генетических элементов, в частности транспозона tn5, для интеграции сконструированных генетических последовательностей в хромосому E. coli. Разработчики MAGIC утверждают, что такая конструкция в значительной степени облегчает метаболическую нагрузку и способствует прямому увеличению биомассы продуцента и выхода биоконъюгата. Чтобы добиться такого результата, они использовали транспозон tn5, в нуклеотидную последовательность которого встроены участки, кодирующие PglB, белок-носитель C. jejuni AcrA и ферменты, участвующие в биосинтезе полисахаридов [26]. Биоконъюгированный прототип MAGIC-вакцины был получен в непатогенной бактерии Citrobacter sedlakii NRC6070. Белок-носитель, использованный для создания препарата, — CmeA 6xHis, полисахаридный компонент — О-антиген C. sedlakii, аналогичный таковому у E. coli O157, в качестве ОСТ использовался PglB. По своим биохимическим показателям биоконъюгат соответствовал заявленным требованиям. К сожалению, пока нет данных о каких-либо клинических испытаниях полученного препарата.

Внекишечные штаммы патогенной E. coli (ExPEC) также довольно опасны, т. к. способны вызывать заболевания разного характера. Штаммы ExPEC относят к 3 основным патотипам: уропатогенная E. coli (UPEC), вызывающая сепсис E. coli (SEPEC), и E. coli, ассоциированная с неонатальным менингитом [27]. К сожалению, ИМП, вызванные ExPEC, крайне тяжело поддаются излечению. Создание эффективных вакцин, предотвращающих подобное развитие событий, является крайне важной задачей. Для её решения, наряду с другими подходами, применены и методы PGCT. Работы начались с создания 4-валентного прототипа, в состав которого входили 4 конъюгированные с EPA варианта О-антигена. Продемонстрирована хорошая переносимость прототипа и достоверное повышение уровня антител класса IgG против всех антигенов, снижение количества зарегистрированных случаев ИМП среди участников испытаний [28, 29]. На основе 4-валентного прототипа создана 9-валентная вакцина ExPEC9V, содержащая конъюгированный полисахарид и проходящая в настоящее время клинические испытания III фазы (NCT04899336).

Продолжается изучение безопасности и иммуногенности 10-валентного препарата ExPEC10V среди пожилых людей в возрасте 60–85 лет (I и II фазы, NCT04306302, NCT03819049). Как и четырёхвалентный прототип, этот препарат хорошо переносится и индуцирует выработку антигенспецифических антител у большинства участников, несмотря на их преклонный возраст [30].

Схожий подход был применён при создании прототипа вакцины на базе О25В антигена ExPEC. Хотя О-антиген E. coli насчитывает более 180 серотипов, среди изолятов, полученных от носителей ИМП, значительное число относится к серотипу О25В [31]. Поэтому группой исследователей была предпринята попытка создать вакцину на базе именно этого антигена. Кластер О-антигена был встроен в геном E. coli W3110, после чего экспрессированный полисахарид был ферментативно конъюгирован с EPA ферментом PglB. Детальная характеристика конъюгата O25B-EPA с использованием физико-химических методов, включая ядерно-магнитный резонанс и газовую хроматографию — масс-спектрометрию, подтвердила соответствие структуре O25B, открывая тем самым возможность разработки поливалентной конъюгированной вакцины против ExPEC [32].

Биоконъюгированные вакцины против Klebsiella pneumoniae

Грам-отрицательная бактерия K. pneumoniae является вторым по распространённости условно-патогенным микроорганизмом после E. coli. Она вызывает неонатальный сепсис, ИМП и внутрибольничные пневмонии, плохо поддающиеся лечению из-за устойчивости к противомикробным препаратам — бактерии приобретают такие факторы устойчивости, как β-лактамазы расширенного спектра действия и карбапенемазы K. pneumoniae. ВОЗ присвоила самые высокие уровни опасности изолятам, содержащим эти факторы [33], что подтверждает острую необходимость в создании эффективной и безопасной вакцины.

С использованием технологии PGCT разрабатывается несколько вакцинных препаратов. M.F. Feldman и соавт. сосредоточились на создании вакцины против K. pneumoniae гипервирулентного типа (hvKp), поскольку именно эта разновидность патогена является наиболее опасной. Если другие серотипы, как правило, вызывают заболевания у пациентов, находящихся в стационарах, пожилых людей, младенцев или людей с иммунодефицитами различной природы, то hvKp представляют угрозу и для здоровых людей [34]. Механизмы гипервирулентности до конца не выяснены, но предполагается, что основной причиной является избыток капсульного полисахарида, затрудняющий выведение патогена из организма. В качестве основной ОСТ исследователи выбрали PglS из A. baylyi, в качестве белка-носителя — ЕРА, слитый с белком ComP. В качестве углеводного компонента были использованы капсульные полисахариды наиболее распространённых серотипов К1 и К2, кластеры синтеза которых клонировали в клетки-продуценты E. coli с частично заблокированными естественными гликозилтрансферазами. Полученные гликопротеины при введении мышам показали способность к индукции синтеза протективных антител класса IgG1, значительно повышающих выживаемость мышей при последующем заражении.

Ещё одна вакцина разрабатывается против классических серотипов K. pneumonia. В качестве углеводного компонента используются О-антигены бактериального липополисахарида. В отличие от капсульных полисахаридов, в настоящий момент известно всего 11 серотипов О-антигенов, экспрессируемых K. pneumoniae [35]. На основе 7 наиболее часто встречающихся серотипов О-антигенов была сконструирована гептавалентная биоконъюгатная вакцина. В качестве ОСТ был выбран фермент PglS, белок-носитель — рекомбинантный ЕРА со вставкой акцепторной последовательности для PglS. В качестве продуцента использовали штамм E. coli CLM24. После выделения и очистки гликопротеины всех 7 типов были использованы для иммунизации мышей, что сопровождалось выработкой высокого уровня антител класса IgG ко всем гликопротеинам. Однако бактерицидность антител против различных штаммов K. pneumoniae оказалась невысокой, что свидетельствует о необходимости доработки вакцины. В связи с этим авторы предлагают ввести в состав вакцины капсульные антигены [36].

Ещё одна вакцина против K. pneumoniae с использованием PGCT разрабатывается на базе PglL. В качестве белка-акцептора использован универсальный рекомбинантный белок SpyCather4573 и специально модифицированный штамм E. coli, в геном которого интегрированы оба ключевых компонента: SC4573 и PglL. Гликопротеины, полученные таким образом, могут спонтанно связываться с белковыми наноносителями in vitro с помощью системы SpyTag с образованием конъюгированных нановакцин. Для повышения эффективности экспрессии гликопротеинов был удалён кластер генов yfdGHI. Полученная конъюгированная нановакцина против K. pneumoniae O1 (KPO1-VLP) продемонстрировала свою эффективность в экспериментах, где после трёхкратной иммунизации наблюдались высокие титры антител и 100-процентная защита от заражения вирулентным штаммом [37].

Биоконъюгированные вакцины против Streptococcus pneumoniaе

S. pneumoniaе, пневмококк, — один из самых распространенных и вредоносных возбудителей бактериальных пневмоний, менингитов и сепсиса. Несмотря на наличие вакцин, S. pneumoniae по-прежнему является причиной более 1 млн смертей в год, главным образом среди детей в возрасте до 5 лет из стран с низким и средним уровнем дохода [38]. Поскольку большая часть капсульных полисахаридов S. pneumoniaе содержат в качестве концевого остатка сахар, который не переносится с помощью PglB, первые попытки создать биоконъюгированную вакцину были сосредоточены на серотипе 4, где концевым остатком был распознаваемый GalNac. Акцептором был выбран нативный белок C. jejuni AcrA, в качестве ОСТ использовали PglB, клонированный в хромосому E. coli W3110. Полученный препарат защищал мышей при последующем инфицировании S. pneumoniaе серотип 4 [39].

Следующий вариант биоконъюгированной вакцины создавался на базе нативных белков S. pneumoniae. Предполагалось, что это позволит создать гетерологичную защиту от неохваченных вакцинами серотипов и повысить иммунную защиту слизистых, стимулируя активацию Th17. Авторы протестировали на мышиных моделях эффективность 3-валентного биоконъюгата, в состав которого входили капсульный полисахарид ST4 и 3 белковых антигена S. pneumoniae: N-концевой фрагмент NanA, фактор вирулентности, который способствует росту и выживанию в носоглоточном тракте, инвазии эндотелиальных клеток головного мозга [40], Th17-стимулирующий антиген Sp0148 [41] и АВС-транспортер липопротеин PiuA [42]. Полученные с помощью PglB в E. coli биоконъюгаты индуцировали у мышей синтез антикапсулярных антител на уровне, соответствующем уже имеющимся вакцинам, а также вызывали сильные ответы на белковые антигены, которые распространялись и на другие, гетерологичные серотипы. Авторы отметили также, что экспрессия нескольких серотипов капсульных полисахаридов в E. coli открывает новые возможности для конструирования вакцин против S. pneumoniae. Например, в качестве платформы можно использовать гликозилированные везикулы наружных мембран (glyOMV) [43].

Ещё один прототип, на этот раз поливалентный, был создан с использованием в качестве основной ОСТ фермента PglS из A. baylyi, способного переносить глюкозный концевой остаток. В качестве белкового акцептора выступал естественный субстрат PglS, пилиноподобный белок ComP, который в E. coli гликозилировался капсульными полисахаридами S. pneumoniae CPS8, CPS9V и CPS14. Полученный препарат показал в предварительных тестах иммуногенность, сравнимую с иммуногенностью вакцины Превнар13. Кроме того, сыворотки мышей, иммунизированных полученным препаратом, проявляли бактерицидную активность против S. pneumoniae серотипов 14 и 8. Развивая идею, авторы сконструировали биоконъюгат на базе белкового носителя ЕРА, модифицировав его С-конец путём присоединения к нему акцепторной последовательности из 23 аминокислот белка ComP, и пневмококкового полисахарида CPS8. Полученный биоконъюгат вызывал у мышей активное образование антител класса IgG и обладал протективным действием [13]. В 2022 г. было показано, что полученный авторами биоконъюгат, получивший название CPS8-EPA^iGTcc, обладает высокой иммуногенностью, вызывает у мышей образование специфических для серотипа CPS8 антител класса IgM и IgG и обеспечивает защиту от инфицирования S. pneumoniae серотипа 8 [44].

Биоконъюгированные вакцины против других видов стрептококков

Разрабатываются также биоконъюгированные вакцины против патогенных стрептококков. Стрептококк группы В (СГВ, S. agalactiae, β-гемолитический стрептококк В) — это грамположительная условно-патогенная бактерия, которая чаще всего колонизирует нижние отделы желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Порядка 10–35% женщин заражены СГВ, что может приводить к различным острым заболеваниям у беременных и рожениц, а также к мертворождению [45]. СГВ также может передаваться новорождённому. Он обычно проявляется в виде В-стрептококковой болезни и может вызвать менингит, сепсис и пневмонию. Более того, недавние исследования показали, что СГВ также является причиной значительного числа заболеваний у взрослых людей, особенно старше 65 лет [46]. Всё это делает разработку вакцины против СГВ крайне необходимой. В связи с этим была сконструирована вакцина на базе PGCT. Характеристика 3-валентной биоконъюгированной вакцины, нацеленной на три наиболее распространённых в клинике серотипа СГБ: Ia, Ib, III, опубликована в работе J.A. Duke и соавт. [47]. Авторы внедрили в E. coli локусы, необходимые для экспрессии белка PglS из A. baylyi, что позволило провести гликозилирование сконструированного белка-носителя на базе EPA и белка ComP сиаловыми остатками согласно серотипам СГВ Ia, Ib и III. Дальнейшая иммунизация мышей полученным препаратом показала, что 3-валентная биоконъюгированная вакцина против СГВ вызывает продукцию специфических для задействованных серотипов антител класса IgG, которые обладают нейтрализующей способностью. Однако эффективность антител против разных серотипов, использованных при создании вакцины, различалась, и авторы предположили, что подобный эффект можно устранить путём изменения степени гликозилирования белка-носителя.

Технологии PGCT также могут быть применены и для создания вакцины от стрептококка группы А (S. pyogenes, или стрептококк А). S. pyogenes является чрезвычайно распространённым патогеном, вызывающим широкий круг заболеваний: от острого фарингита и импетиго до скарлатины и инвазивных заболеваний, таких как синдром токсического шока или некротизирующий фасцит. Они приводят к развитию вторичных заболеваний аутоиммунной природы, например ревматических заболеваний сердца [48]. Кроме того, человек является единственным естественным хозяином S. pyogenes, следовательно, блокирование передачи этого патогена может привести к его полной элиминации. Стрептококк А, подобно S. pneumoniae, обладает высокой антигенной гетерогенностью. Серотипы определяются различиями в главном факторе вирулентности, белке М. Вследствие такой гетерогенности в поверхностных белках S. pyogenes исследователи сосредоточились на разработках конъюгированных вакцин на базе наружных полисахаридов патогена, в частности, полисахарида группы А. Однако R. Di Benedetto и соавт. показали, что для большей эффективности будущей вакцины необходимо сохранять белковые эпитопы носителей, т. к. случайное конъюгирование не влияло на синтез IgG к компоненту полисахарида группы А, но значительно снижало ответ на белковый компонент [49]. В результате случайной конъюгации полисахарида группы А с тремя белками S. pyogenes (SLO, SpyAD и SpyCEP) были получены конъюгаты, иммунизация которыми приводила к наработке антител, не блокирующих активность одного из использованных для конъюгации белков — SpyCEP. Он сохранял способность расщеплять интерлейкин-8. По-видимому, для создания эффективной вакцины на базе собственных белков S. pyogenes и его же полисахарида группы А потребуется обеспечить чрезвычайно высокую точность присоединения полисахарида к определённым участкам белков, что вполне может быть обеспечено при использовании PGCT [50].

Другие биоконъюгированные вакцины

Технологии PGCT используются при создании вакцины против B. abortus [51]. Данный патоген, хотя и является возбудителем преимущественно заболеваний сельскохозяйственных животных, тем не менее представляет опасность и для людей. Лицензированной вакцины, защищающей от инфицирования B. abortus, в настоящий момент нет. Существуют аттенуированные препараты, применяемые для защиты крупного (S19 и RB51) и мелкого (Rev1) рогатого скота [52]. Однако эти вакцины являются патогенными для человека, обладают остаточной токсичностью для животных и не защищают от всех известных видов возбудителя. Кроме того, для всех манипуляций с культурами бруцелл требуется оборудование высокого уровня биобезопасности из-за риска аэрозольной передачи. Чтобы избежать этих трудностей, для синтеза гликозилированных по типу B. abortus гликопротеинов нередко используют Y. enterocolitica, менее опасный оппортунистический патоген, поскольку О-полисахариды Brucella и Y. enterocolitica схожи [53]. В настоящий момент в высокой степени готовности находятся прототипы вакцин на основе холерного токсина В в качестве белкового носителя и О-полисахаридов Y. enterocolitica, синтезируемых в генетически модифицированных E. coli [52], а также на основе наночастиц Nano-B5 в качестве платформы и О-полисахаридов Brucella [54]. Продуцентом в последнем случае является Y. enterocolitica. В обеих вакцинах использована О-гликозилирующая система с центральной ОСТ PglL из N. meningitides. В обоих случаях исследователи сообщают об успешном применении полученных прототипов в доклинических исследованиях на мышах. При введении их животным наблюдались как повышенная продукция антител, так и активация клеточного иммунитета. Кроме того, оба прототипа продемонстрировали яркий защитный эффект иммунизации с последующим заражением мышей, а в случае нановакцины — даже против нескольких видов Brucella. Дальнейшие клинические исследования, очевидно, покажут применимость полученных препаратов для иммунизации людей.

Staphylococcus aureus является причиной многочисленных заболеваний человека, включая эндокардит, пневмонию и раневые инфекции. Особую опасность представляет собой метициллинрезистентный S. aureus (так называемые штаммы MRSA) [55]. В связи с этим существует острая необходимость в эффективной вакцинации против стафилококковой инфекции. В работе М. Wacker и соавт. привели результаты тестирования на мышах 3 конъюгатов, полученных с использованием технологий PGCT. По наименованию входящих в их состав компонентов они названы CP5-ЕРА, CP8-ЕРА и CP5-Hla, где СР5 и СР8 — капсульные полисахариды S. aureus серотипов 5 и 8 соответственно, ЕРА — экзотоксин А P. aeruginosa, а Hla — α-токсин S. aureus. В работе использовали PglB из C. jejuni. Биоконъюгаты были синтезированы в E. coli, после чего введены мышам. Все три прототипа вызывали индукцию антител на высоком уровне. При оценке защитной эффективности препаратов наилучшие результаты показал конъюгат CP5-Hla; введение CP5-Epa и CP8-Epa значительно снижало бактериемию; биоконъюгированная вакцина CP5-Hla защищала как от бактерий, так и от пневмонии со смертельным исходом.

Технология PGCT была применена для создания прототипов вакцин против Francisella tularensis, внутриклеточного патогена, вызывающего туляремию — потенциально смертельное заболевание. Для человека наиболее опасны два подвида: F. tularensis tularensis (тип A) и F. tularensis holarctica (тип B) [57]. Авторы с помощью PglB получили в E. coli биоконъюгат, состоящий из О-антигена F. tularensis и ЕРА, и испытали его на мышиной модели. Полученный рекомбинантный биоконъюгат отличался высоким выходом, стимулировал выработку специфических антител и обеспечивал защиту от последующего заражения вирулентным диким штаммом F. tularensis subsp. holarctica [58]. Авторы в дальнейшем провели модификацию носителя ЕРА, внеся в него дополнительно 8 акцепторных последовательностей, чтобы увеличить степень его гликозилированности [59]. Новый биоконъюгат действительно эффективнее стимулировал образование специфических антител, защищая крыс от развития заболевания при инфицировании F. tularensis. Исследователи планируют дальнейшие работы над представленным прототипом вакцины, намереваясь заменить белок-носитель ЕРА на нативные белковые антигены F. tularensis.

Ещё одна попытка создать новую вакцину против F. tularensis была сопряжена с использованием уже упоминавшейся экспериментальной технологии MAGIC [25]. В качестве ОСТ использовался PglB, белок-носитель — периплазматический Cmea из C. jejuni, для удобства выделения оснащённый вставкой 6His, полисахарид — О-антиген F. tularensis. Организм-продуцент — E. coli, все компоненты внедрялись в бактериальную хромосому. Работа продемонстрировала эффективность технологии MAGIC в получении высокоиммуногенных биоконъюгатов.

Заключение

Таким образом, биоконъюгация, равно как и другие современные технологии, активно применяется в разработке новых и совершенствовании уже имеющихся вакцин. Несмотря на существующие ограничения, данный метод может быть использован для создания препаратов, предотвращающих инфекционные заболевания, тем самым снижая распространение антибиотикорезистентных микроорганизмов.

About the authors

Maria I. Tsyganova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: maria_che@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2811-6844

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunochemistry

Россия, Nizhny Novgorod

Dmitry V. Novikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: novikov.dv75@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7049-6935

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunochemistry

Россия, Nizhny Novgorod

Viktor V. Novikov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: mbre@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2449-7213

Dr. Sci. (Biol.), Professor, Head, Laboratory of immunochemistry

Россия, Nizhny Novgorod

Alexander V. Karaulov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: drkaraulov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1930-5424

Dr. Sci. (Med.), Professor, RAS Full Member, Head, Laboratory of immunopathology, Institute of Molecular Medicine, Head, Department of clinical immunology and allergy, N.V. Sklifosovsky Institute of Clinical Medicine

Россия, Moscow

References

Supplementary files