EFFECT OF INTACT BIONANOSTRUCTURES - LIPOSOMES ON BIOCHEMICAL AND IMMUNOLOGICAL STATUS OF THE ORGANISM

Full Text

Использование липидных бионаноструктур - липосом в качестве транспортных контейнеров для доставки лекарственных и вакцинных препаратов предопределяет необходимость изучения их действия на показатели гомеостаза. Актуальность подобных исследований становится очевидной по мере расширения списка выпускаемых коммерческих и разрабатываемых липосомальных препаратов для людей и животных [6, 9, 15, 20, 26 - 30, 32 - 34, 38, 41, 43]. Такая тенденция обусловлена уникальностью свойств липосом. Для них характерны химическая инертность, биосовместимость, биодеградируемость, отсутствие токсичных и антигенных свойств, способность предохранять заключенные в них вещества от действия ряда факторов, ферментов и целенаправленно преодолевая при введении в организм анатомические и клеточные барьеры пролонгировано взаимодействовать с клеточными системами органов и тканей, обеспечивая внутриклеточную доставку заключенных в липосомы веществ [8]. Липосомы получают различными способами из фосфолипидов и липидов, которые формируют одну бислойную мембрану (моноламеллярные липосомы), или несколько мембран, отделенных друг от друга водной фазой (мультиламеллярные липосомы). Гидрофобная часть фосфолипидов интегрирована внутрь мембраны, а гидрофильная находится снаружи, контактируя с водной фазой, расположенной внутри и снаружи липосом. Соответственно при формировании липосомальных лекарственных или вакцинных препаратов их гидрофильные компоненты оказываются внутри липидных везикул в водной фазе, а гидрофобные встраиваются в липидные мембраны. В зависимости от способов приготовления диаметр мембран колеблется от нескольких десятков до сотен нм. При этом толщина каждой из них не превышает 8 - 10 нм, поэтому в соответствии с «Научным нано-рубрикатором» Госкорпорации РОСНАНО липосомы относят к наноструктурам. С растительной и животной пищей взрослый человек в сутки потребляет в пределах 7 г фосфолипидов, обладающих широким спектром биологического действия. Они участвуют в построении мембран клеток человека и животных, в транспорте различных веществ и ионов через эти мембраны, влияют на процесс свертываемости крови, на созревание эритроцитов и накопление в них гемоглобина, предупреждают жировую инфильтрацию печени, регулируют обмен холестерина, ограничивая его накопление на стенках сосудов, активно участвуют в процессах биологического окисления, в деятельности различных систем организма. Оценить же биологическое действие не включенных в липосомы комплексов фосфолипидов и липидов, из которых образуются бислойные везикулы, оказывается затруднительным, так как их растворы в органических растворителях практически не вводят в организм. Суспендирование же этих химических соединений в водных средах приводит к формированию липосо-мальных структур, в которых амфифильные вещества начинают занимать энергетически выгодное положение, образуя бислойные мембраны, приобретая способность при попадании в организм преодолевать анатомические и клеточные барьеры, накапливаясь в определенных органах и тканях, оказывая там, в первую очередь, свое биологическое действие. Липосомы из-за идентичности отдельных молекул имеют высокую тропность к клеткам ретикулоэндотелиальной системы и при введении в организм быстро накапливаются в органах и тканях, содержащих эти клетки [2, 8, 12]. Однако существенное влияние на распределение липосом и заключенные в них препараты способны оказывать их химический состав, электростатический заряд, размеры и способ введения в организм, а также наличие на поверхности векторных молекул. В качестве векторных молекул используют производные хитина, предотвращающие фагоцитирование бислойных липидных везикул, полиэтиленгликоль, способствующий их накоплению в очагах воспаления. Для направленной доставки липосомальных препаратов к антигенам органов и тканей на поверхности липосом фиксируют специфические антитела. Наличие в структуре мембран липидных везикул ганглиозидов повышает их тропность к клеткам селезенки, а сфингомиелина - к клеткам легких и т.д. [8]. Сравнительное изучение распределения по органам и тканям мышей интактных липосом, мембрана которых представлена фосфатидилхолином, радиоактивно меченным по углероду холестерилолеатом и дицетилфосфатом, показало существенные отличия в зависимости от способа введения их в организм экспериментальных биологических моделей. При внутрибрюшинном введении липосомы преимущественно локализовались в печени, где с 4 по 24 ч эксперимента находилось от 20 до 38% от введенной дозы. В крови определялось их наличие только в течение первых четырех часов. При подкожном введении наблюдался более низкий процент содержания ли-посом в паренхиматозных органах, тогда как в крови их нахождение регистрировали в течении 24 ч [8]. Изучение комплексного влияния вводимых различными путями интактных липосом на биохимические и физиологические процессы в организме экспериментальных животных показало, что они обладают выраженной биологической активностью. «Пустые» липосомы готовили из смеси фосфатидилхолина и холестерина, а также из фосфолипидов и липидов головного мозга крупного рогатого скота [10]. Полученная липидная смесь состояла из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина, фосфа-тидилинозитола, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидных кислот, кардиолипина, сфингомиелина, цереброзида, холестерина и нейтральных липидов. Мышам липосомы вводили внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или перорально 6 раз через сутки. Было установлено, что у животных происходили статистически достоверные функциональные изменения биохимических показателей крови, восстанавливающихся к обычным значениям в течение 10 сут после прекращения введения препарата. Выраженность биохимических изменений зависела от пути поступления препаратов в организм. В большей степени эти изменения регистрировались при внутрибрюшинном способе введения, затем при внутримышечном и подкожном, тогда как при пероральном они были незначительны. При этом липосомы, мембраны которых были построены из фосфолипидов и липидов головного мозга, вызывали более выраженные биохимические изменения в организме, чем фосфатидилхолиновые везикулы, особенно при внутрибрюшинном поступлении препаратов. При введении животным интактных липосом в сыворотке крови на фоне гипогликемии увеличивалось содержание общего белка, достигая максимума к 9 - 11 суткам эксперимента. При внутрибрюшинном и внутримышечном поступлении препаратов у мышей в крови повышался уровень мочевины. Гиперхолестеролемия наблюдалась при внутрибрюшинном введении липосом, а при внутримышечном и подкожном - гипохолестеролемия. При любом способе введения препаратов, кроме перорального, регистрировались гипертриглицеринемия, повышение уровня липопротеидов очень низкой плотности и уменьшение количества липопротеидов низкой плотности. В ответ на введение липосом в крови животных происходило снижение активности щелочной фосфатазы и повышение уровня аланинаминотрансферазы, показатели же аспартатаминотрансферазы менялись незначительно. Поступление интактных липосом в организм мышей сопровождалось увеличением активности миелопероксидазы, повышением содержания катионных белков и гликогена в полиморфоядерных лейкоцитах. При этом регистрировали незначительную обратимую жировую дистрофию гепатоцитов печени и эпителия извитых канальцев почек. В ранние сроки наблюдения отмечали гиперплазию клеточных элементов лимфоидной ткани и развитие макрофагальной реакции в региональных лимфоти-ческих узлах и селезенке [22]. «Пустые» липосомы, имеющие различный состав мембраны, оказывали выраженный мембраностабилизирующий эффект в отношении перекисного гемолиза эритроцитов, снижали накопление манолового диальдегида и тормозили трансформацию эритроцитов [24]. Инфузия интактных фосфатидилхолиновых липосом крысам в момент снятия стресса, обусловленного синдромом длительного раздавливания, приводила к нормализации в организме перекисного окисления липидов, повышению активности антиоксидантных систем в различных органах и снижению летальности до 4%. При этом показатель летальности животных, которым не вводили липосомы, составлял 84% [7]. Таким образом, «пустые» бислойные липидные везикулы, имеющие различный состав мембран, при попадании в организм активно включаются в биохимические процессы, обеспечивая в ряде случаев повышение сопротивляемости макроорганизма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Установлено антибактериальное и антивирусное действие интактных липосом, состоящих из фосфатидилхолина и холестерина, к широкому спектру условно патогенных и патогенных микроорганизмов. Подкожное введение животным таких ли-посом дистальнее огнестрельной раны приводило к уменьшению уровня микробной обсемененности раны и снижению инвазивности бактерий в глубь тканей раневого канала [21]. «Пустые» липосомы, приготовленные из фосфолипидов и липидов, выделенных из головного мозга крупного рогатого скота, и вводимые перорально мышам за 48 ч до заражения вирулентным штаммом сибиреязвенного микроба в дозе 10 LD50, обладали протективным действием, обеспечивая выживание 20% животных, а у остальных увеличивали средний срок жизни на 1,1±0,2 сут при 100% гибели контрольных зараженных мышей. Аналогичный эффект (20% выживших животных) регистрировали при введении интактных липосом внутримышечно в течение 3 дней (по 1 инъекции в сут), начиная через 24 ч после инфицирования мышей возбудителем сибирской язвы. При этом средний срок жизни зараженных животных увеличивался на 1,9±0,3 сут [25]. Нативные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и дипальмитоилфосфа-тидилхолина, а также из фосфатидилхолина и холестерина, вводимые мышам различными способами, включая интраназальный, ежедневно в течение 7 сут после заражения животных штаммами возбудителя гриппа обеспечивали статистически достоверное снижение смертности [16]. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что липосомы, попав в организм, начинают оказывать воздействие на его гомеостаз, активируя различные клеточные и биохимические системы, в результате чего повышается его резистентность к возбудителям инфекций бактериальной и вирусной природы, включая такую особо опасную инфекцию, как сибирская язва. Это предопределяет необходимость изучения действия интактных липосом при различных патологиях человека и животных, требующих коррекции гомеостаза организма (онкозаболевания, иммунодефицитные и другие аномальные состояния). Обнаружение Allison A.C. в начале семидесятых годов ХХ века у липосом адъювантных свойств явилось поводом к изучению различных аспектов их использования в иммунологии. Была определена высокая эффективность липосомальных вакцин, содержащих антигены простейших, бактерий, вирусов. Оказалось, что при этом возможно снижение общего количества фиксированного в бислойные липидные везикулы антигена, способного вызывать выраженную иммунную реакцию организма. Включение в липосомы различных иммуномодуляторов позволяет увеличить эффективность их действия, так как они перестают быстро выводиться из организма, а также исключить некоторые побочные реакции [13, 14, 23, 31, 35 - 37, 39, 40, 42, 44]. Однако сведений о действии «пустых» липосом на иммунологический статус организма не много. В литературе приводятся отдельные данные о способности интактных липосом усиливать зависимую от интерлейкина-2 пролиферацию цитотоксических лимфоцитов, о повышении протективности живой чумной вакцины, вводимой в организм экспериментальных животных параллельно с нативными липосомами, состоящими из фосфатидилхолина и холестерина, а также результаты исследований, когда нативные липидные везикулы вводили в качестве контроля, анализируя эффективность липосомальных лекарственных или вакцинных препаратов [8]. Выраженной биологической активностью обладали «пустые» липосомы, в состав которых входили покровные липиды нерпы. Эти бислойные липидные везикулы оказывали повышенный иммуномодулирующий и противовоспалительный эффект, а также мембраностабилизирующее действие в модельных экспериментах по воспроизведению иммунодефицитного состояния, воспалительных процессов в тканях лабораторных животных и деструкции мембран эритроцитов. Установлено, что замена в структуре мембран нативных липосом яичных фосфолипидов на липиды печени нерпы, содержащие оптимальное соотношение полиненасыщенных жирных кислот, обеспечивает усиление их иммунобиологической и мембраностабилизирующей активности [1, 17 - 19]. Изучение в течение 28 сут влияния интактных липосом, состоящих из фосфати-дилхолина и холестерина, вводимых однократно перорально мышам, определило их выраженное динамичное влияние на отдельные показатели иммунного статуса организма. Максимально высокий уровень комплемента, относящегося к гуморальным факторам иммунитета и выполняющего функции активации лейкоцитов, определялся на 7 сут после введения липосом, превышая аналогичный показатель у животных контрольной группы на 40,85%. В последующие сроки прослеживалась тенденция к постепенному снижению этого уровня - до 30% к концу эксперимента. Введение интактных липосом также сопровождалось увеличением количества популяции Т-лимфоцитов, экспрессирующих СД3+ антиген, который ассоциирован с антиген-распознающим рецептором Т-клеток. Если на 7 сут количество таких лимфоцитов мало отличалось от контроля, то к 14 сут этот показатель увеличивался на 22,1 - 25,3%, постепенно возвращаясь к уровню контрольной группы к 28 сут от начала опыта. Отмечалось незначительное увеличение количества Т-клеток, несущих на своей поверхности СД4+ маркер, являющийся корецептором для связи антиген-распознающего рецептора с мононуклеарной системой. При этом количество СД4+ клеток статистически значимо возрастало к 7 сут (на 14%), а начиная с 14 сут и в последующие сроки наблюдения количество таких клеток снижалось, достоверно не отличаясь от данных в контрольной группе животных. Не было отмечено заметного влияния на количество Т-клеток с маркером СД8+ с функцией корецептора для связи антиген-распознающего рецептора с монону-клеарами, а также на количество В-клеток [4, 11]. Интактные липосомы оказывали длительное стимулирующее действие, регистрируемое до 28 сут (срок наблюдения), на фагоцитарную активность нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, а также на миелопероксидазную активность и содержание лизосомальных катионных белков, непосредственно участвующих в стадии киллин-га фагоцитированных объектов (пекарских дрожжей). Реакцию с полиморфоядерными лейкоцитами проводили в спонтанном и индуцированном состояниях при стимуляции лейкоцитов коммерческим пирогеналом. В результате исследований установлено, что фагоцитарная активность у контрольных мышей составляла 85 - 87%, при активации лейкоцитов пирогеналом - 92 - 95%. Введение интактных липосом сопровождалось повышением фагоцитарной активности до 93 - 94% в спонтанном и до 96 - 98% в индуцированном состояниях во все сроки наблюдения (от 7 до 28 сут). В ответ на однократное пероральное введение интактных липосом мышам содержание катионных белков в нейтрофилах крови опытных животных было значительно выше (1,1 ±0,08) во все сроки наблюдения, чем в контрольной группе (0,81±0,07). Одновременно в нейтрофилах возрастала активность миелопероксидазы, достоверное увеличение активности которой, по сравнению с показателями контрольной группы (0,94±0,03), регистрировали в отдаленные сроки наблюдения - 21 - 28 сут (1,16±0,07). На 7 - 14 сут после введения липосом данные цитохимические показатели были недостоверно выше, чем у контрольных животных [5]. При этом во все сроки наблюдения в органах и тканях экспериментальных животных не было выявлено каких-либо макроскопических патоморфологических изменений [11]. Более выраженное влияние интактных липосом на отдельные показатели иммунитета экспериментальных животных обнаружено при введении мышам бислойных липидных везикул, мембрана которых сформирована из фосфолипидов и липидов, выделенных из головного мозга свиньи [10]. Максимальный показатель содержания комплемента у опытной группы животных определялся на 5 сут после введения интактных липосом, превышая контрольный на 70,2% при пероральном и на 37,1% при внутрибрюшинном введении. В последующие сроки наблюдения, начиная с 7 сут и до конца эксперимента (28 сут), прослеживалась тенденция к постепенному снижению данного показателя до 25,7% при пероральном и до 13,1 % при внутрибрюшинном путях введения. Отмечено увеличение популяции Т-лимфоцитов, экспрессирующих СД3+ антиген. Их количество возрастало к 14 сут эксперимента, превышая контрольные значения на 23,7 и 28,2% при пероральном и внутрибрюшинном введении липосом соответственно. Затем происходило постепенное снижение данного показателя, и к 28 сут он практически не отличался от контрольной величины. Максимальное количество Т-клеток, несущих СД4+ маркер, регистрировалось на 5 сут от начала эксперимента, превышая контрольные значения на 45,5 и 52,2% при введении липосом перорально и внутрибрюшинно соответственно. В дальнейшем их количество снижалось и к концу эксперимента практически сравнивалось со значениями в контрольной группе животных. Количество Т-клеток с маркером СД8+ при пероральном введении липосом на 5 сут возрастало на 25%, но уже к 7 сут достигало фоновых контрольных показателей. При внутрибрюшинном введение к 5 сут данный показатель увеличивался на 17%, затем постепенно снижался, достигая контрольных значений к 21 сут от начала эксперимента. Число В-лимфоцитов при пероральном введении липосом к 5 сут эксперимента снижалось на 22,3%, возвращаясь к значениям в контрольной группе животных к 14 сут. При внутрибрюшинном пути введения к 5 сут количество В-клеток уменьшалось на 52,1%, затем к 7 сут возрастало, превышая контрольный уровень на 15,8%, а к 14 сут практически достигало контрольных значений. В ответ на однократное пероральное введение интактных липосом на 5 сут содержание катионных белков в нейтрофилах крови животных достигало уровня 1,12±0,04, а активность миелопероксидазы определялась в пределах 0,99±0,06, что превышало показатели контрольной группы (0,81±0,07 и 0,94±0,03 соответственно). На 7 - 14 сут количество катионных белков повышалось до 1,18±0,06, а на 21 - 28 сут миелопероксидазная активность возрастала до 1,21±0,12. При внутрибрюшинном введении липосом в нейтрофилах крови максимальное содержание катионных белков (1,19±0,04) и активность миелопероксидазы (1,12±0,07) наблюдали на 5 сут от начала эксперимента. В последующие сроки (с 7 по 28 сут) эти показатели снижались, однако превышали значения контрольных групп животных [3]. Таким образом, представленные в обзоре материалы свидетельствуют, что интактные липосомальные бионаноструктуры сами по себе являются биологически активными образованиями и при попадании в организм активно влияют на различные биохимические и иммунологические показатели, несмотря на то, что они не являются инородными объектами для организма, так как структура их мембран состоит из идентичных ему биомолекул. При этом степень влияния липосом на гомеостаз организма зависит от путей и кратности их введения, состава фосфолипидов и липидов их мембран, вводимой дозы и некоторых других факторов. Все это необходимо учитывать при разработке различных липосомальных лекарственных и вакцинных препаратов, а также при планировании программы их испытаний. Л ИТЕРАТУРА

About the authors

V. I Efremenko

Stavropol Institute of Plague Control

References

Supplementary files