SENSITIVITY OF CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE STRAINS TO ANTIBACTERIAL PREPARATIONS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Масштабное и бесконтрольное применение антибиотиков в медицине и ветеринарии привело к возникновению резистентности к ним у большинства условно патогенных и облигатно патогенных микроорганизмов. Удельный вес штаммов, устойчивых к действию антибактериальных препаратов, увеличивается с каждым годом. Многие заболевания микробного генеза, в недавнем прошлом поддававшиеся терапии антибиотиками, теперь становятся трудно излечимыми. В связи с этим, изучение феномена резистентности бактерий к антибиотикам является актуальной задачей медицинской микробиологии и основой рациональной антибиотикотерапии инфекционных болезней. Антибиотики применяются для санации дифтерийных бактерионосителей, в комплексной терапии отдельных форм дифтерии, а также для лечения инвазивных заболеваний, вызванных нетоксигенными C. diphtheriae [1, 4, 6, 9]. Препаратами выбора являются пенициллин и макролиды. Однако даже повторные курсы антибиотикотерапии часто оказываются неэффективными. Это может объясняться врожденным или приобретенным нарушением колонизационной резистентности слизистых оболочек, дисбиоза ротоглотки и носа [4], а также резистентностью штаммов C.diphtheriae к применяемым антибиотикам. Учитывая общую тенденцию к росту антибиотикорезистентности микроорганизмов целью исследования явилось изучение распространенности и механизмов данного явления у циркулирующих штаммов C.diphtheriae. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования явились 664 штамма C.diphtheriae, которые были выделены в 1987 - 2013 гг. в различных регионах России (гг. Москва, Санкт-Петербург, Краснодар, Уфа, Пенза; Московская, Владимирская, Калининградская, Омская, Мурманская, Астраханская, Тульская, Ярославская, Ивановская, Воронежская, Кемеровская, Новосибирская, Челябинская, Брянская, Тверская, Смоленская области). Из них 367 штаммов биовара gravis и 297 штаммов биовара mitis как токсигенные (370 штаммов), так и нетоксигенные (294 штаммов). Идентификацию штаммов С. diphtheriae проводили по «Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции» МУ 4.2.698-98. Изучение антибиотикочувствительности штаммов С. diphtheriae осуществляли согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам» и проводили двумя методами: диско-диффузионным с использованием антимикробных препаратов - эритромицин, азитромицин, рифампицин, пенициллин, ампициллин, имипенем, линкомицин, клиндамицин, офлоксацин, ципро-флоксацин и методом E-test (HIMEDIA, Индия). В работе использовали питательную среду АГВ-агар (ГНЦПМБ, пос. Оболенск) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. В качестве контрольных штаммов использовали Staphylococcus aureus 25923 и токсигенный штамм C.diphtheriae биовара gravis 665, полученные в государственной коллекции патогенных микроорганизмов Научного центра экспертизы средств медицинского применения. ПЦР проводили в соответствии с [3]. Дизайн праймеров был осуществлен на основе информации GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). ПЦР смесь содержала 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,0 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1 мкл ДНК и 1 ед. Taq DNA-полимеразы в окончательном объеме 25 мкл. Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК штаммов C.diphtheriae определяли с помощью ABI PRISM Big Terminator cycling sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ BLAST и базы данных EMBL/GenBank. РЕЗУЛЬТАТЫ Результаты исследования активности антибактериальных препаратов в отношении C.diphtheriae показали, что большинство изученных штаммов оказались чувствительными ко всем используемым антибактериальным препаратам. Все штаммы C.diphtheriae были чувствительными к имипенему и офлоксацину. Промежуточный уровень устойчивости имели: 6,0% штаммов - к пенициллину, 1,7% штаммов - к ампициллину, 0,45% штаммов - к эритромицину и по 0,6% - к азитромицину и ципрофлоксацину. Также были выявлены антибиотикорезистентные штаммы C.diphtheriae. Причем, устойчивость была обнаружена ко всем группам изучаемых антибиотиков - препаратам пенициллинового ряда, макролидам, линкозамидам и рифампицину: 1,2% штаммов оказались устойчивыми к пенициллину и 1,7% штаммов - к ампициллину; 4,4% штаммов - к эритромицину (14-членному природному макролиду) и 4,0% - к азитромицину (15-членному полусин-тетическому макролиду); 1,2% штаммов - к линкомицину и 2,4% штаммов - к клиндами-цину; 4,7% штаммов - к ри-фампицину. Нами не было обнаружено штаммов C.diph-theriae, резистентных к ци-профлоксацину. Множественной резистентностью, то есть устойчивостью к двум, трем или более антибактериальным препаратам, обладали 2,0% исследованных штаммов C.diphtheriae. Все они были устойчивы к макро-лидам - эритромицину и азитромицину; 0,3% и 0,9% штаммов характеризовались устойчивостью к трем антибиотикам: пенициллину-эритромицину-азитромицину и эритромицину-азитромицину-клиндамицину, соответственно. Было также обнаружено 1,5% штаммов C.diphtheriae, обладающих устойчивостью к 4 антибиотикам - пенициллину, эритромицину, азитромицину и рифампицину, и 1,5% штаммов - к эритромицину, азитромицину, клиндамицину и рифампицину. Типичная электрофо-реграмма продуктов ПЦР-ДНК фрагментов гена erm(X) штаммов C.diphtheriae. 1 - маркер молекулярных масс 100 bp DNA Ladder Plus (Fer-mentas, Литва); 2 - 6 - ДНК штаммов C.diphtheriae, резистентных к эритромицину; 7 - отрицательный контроль. С помощью Е-теста нами была изучена минимальная подавляющая концентрация (МПК) к антибиотикам у штаммов C.diphtheriae, резистентных по результатам дискодиффузионного теста к эритромицину и азитромицину. Установлено, что у 12 из 20 таких штаммов МПК к эритромицину составила 16 - 32 мкг/мл, а у остальных восьми штаммов МПК была >256 мкг/мл. Для расшифровки молекулярных механизмов резистентности к эритромицину штаммы C.diphtheriae, устойчивые к этому антибиотику, были проанализированы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими ErmХ-F - ErmХ-R праймерами, фланкирующими ген erm^). После проведения электрофореза продуктов ПЦР в агарозном геле во всех образцах, содержавших ДНК резистентных штаммов C.diphtheriae, был выявлен фрагмент размером 855 п.н., соответствующий амплифицируемому участку гена erm(X) (рис.). Для валидации полученных результатов и установления специфичности выявленных нами фрагментов ДНК гена erm(X) было проведено прямое и обратное секвенирование полученных ампликонов (см. ниже). В результате секвенирования были идентифицированы нуклеотидные последовательности, которые полностью соответствовали последо- СI j V V СООМ АД 7 TT СОСТ7 А Т С С C003IC С С С13 Li ACM Т G UU039T Ч ТОО, CCftTC й С 7 7 LjUUi-L вСП 1 GOG СГ (зсгетАтсааьия^гомагс1£1изк5самооалтсьс1ыайтосссссагсйАС&ттгоостота<зссоаллА а с ?, ел-: с т т а а т я сос&ь а лас с смет с лад т с- г:-аас с ас а gooac с ас т алон; a т с ас ад г ил с с с т а с-зс-с lACTOOGGCCCGGCflGCGAGCGACriCCCACTGCAr.bAGGAGCACAGCdCAGrrCATGCCGGOGC.MGCJiGCAA:! TTCGMGftATGDClimraOTGAGarEblUljGGGMIATTTCCnaCMTEbOKlEOGbffrGGCGGlJrAftCCBGllGrrA AG I’ ЛДДТС Al C1TB 5ДС: АС T 7 г БДССК С С G L L GAGSftfi GTTT7 ГТ171G1G ЛI’ Г ггэ: С AG г TJ". G ГТТТЙС G Г НШС 7 7 г: МСГЭС Г G Г Т il, TCGC С L Т П П П еллет G G G С CJL ГСМ G 7 G Л 5 ТЕНЯМ Г л Г Г-5СТ1 С C7GGTC OSATC 7 С М1 Г Eft 75етязетг5*ЕСТ7тетттицсмс^тс»тслтемйГ1сшблтсттт;7ет?1ч®г1™Е1Ааитттти;ссд’Г5 ТТССТ'ЕЙ^^™СКЛТОетЛ7вС»««ЖТ^МИЛЧС?1СТ7Бта™ТТ577Е11Е11ДАЛЛЛИТТТОТГМБ7СаУ1 ?^™таи^етгесстА^дтллдсот5аЕспт1ЛТАдаггсри1Т5ДАТл.трг1?5гтдд1С7СТСАда:ть1Епгтт СЛГСКЙ^7РИГЛ™ВС1аТТСТЧ5С7Га1ТВДЕ1ТЛЛТ1аТАЛГ7ГД^ГГТТЛ™Ж7ГТАЛТСЫАТТ7ГСДТТГС М с; VAlfАп с 1 ft г; гаиДТтт; г: с СЛТД'^ГГТДИ? с^Т К ТЛСГАСТАЛ С TAc£vIl:_l.Ai; ftftTCVI'IVAA СГТ R.T ЫССЙОТАТСАШЛТСД'ИСМКСГДТСЛТИеТССТСЙСТСОСТЖЩЯЖ СТОГА вательности гена erm(X), опубликованной в GenBank (access. no. {“type”:”entrez-nuc-leotide”,”attrs”:{“text”:”U21300”,”term_id”:”4019167”}}U21300). Таким образом, установлено, что циркулируют штаммы C.diphtheriae, резистентные к пенициллинам, макролидам, линкозамидам и рифампицину. Более 4% штаммов являются устойчивыми к препарату выбора - эритромицину; такая устойчивость обусловлена наличием гена erm(X). ОБСУЖДЕНИ Е Пенициллины и макролиды стали применяться для лечения дифтерийных бактерионосителей и дифтерии (с целью ингибирования размножения возбудителя и уменьшения продукции им токсина) еще в 1950-х годах. Первые результаты изучения чувствительности штаммов C.diphtheriae к пенициллину и эритромицину показали, что значения МПК могут варьировать в достаточно широких пределах [10, 26]. McLaughlin J. et al. [16] усовершенствовали методику постановки антибиограммы и показали отсутствие корреляции между биологическими свойствами C.diphtheriae (биовар, способность к продукции токсина) и их чувствительностью к антибиотикам. Штаммы C.diphtheriae, резистентные к эритромицину, были впервые выявлены в начале 1970-х годов в Сиетле (США) и Канаде у больных с кожной формой дифтерии [11, 19]. К этому же периоду относится и первое сообщение об обнаружении в Индонезии значительного числа штаммов C.diphtheriae (до 86%), резистентных к терациклинам. Данные штаммы также были выделены от больных с кожной формой заболевания [22]. В дальнейшем были описаны случаи выделения в разных странах мира штаммов C. diphtheriae, резистентных к пенициллину, оксациллину, тетрациклину, эритромицину, рифампицину и клиндамицину [2, 8, 12, 13, 17, 25]. В настоящее время отмечается тенденция к росту невосприимчивости штаммов к пенициллину. Пропорция таких штаммов достигает 15% [18, 20, 25]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о снижении чувствительности к эритромицину и циркуляции до 27% штаммов C.diphthe-riae, резистентных к этому препарату, причем наибольший процент таких штаммов регистрируется у больных с кожной формой дифтерии и дифтерийных бактерионосителей [12, 13, 17, 25]. Кроме того, выявляется до 17% штаммов C.diphtheriae, резистентных к клин-дамицину. В большинстве случаев резистентность к клиндамицину коррелирует с устойчивостью к эритромицину [14, 15, 18]. По данным отечественных авторов, среди штаммов C.diphtheriae, выделенных в 2005 - 2007 гг., регистрировали рост МПК к эритромицину до 23% и пенициллину до 21% [2]. В проведенном нами исследовании было выявлено 1,2% штаммов C.diphtheriae, резистентных к пенициллину, в то время как 6,0% штаммов имели промежуточный уровень устойчивости к этому антибиотику. Все штаммы, устойчивые к пенициллину были чувствительны к цефалоспоринам. Полученные данные о чувствительности к имипенему и цефалоспоринам согласуются с данными других исследователей [15, 20]. Макролидные антибиотики - эритромицин и азитромицин - обладали практически одинаковой активностью в отношении всех изученных штаммов C.diphtheriae. Промежуточный уровень устойчивости к макролидам имели 0,4 - 0,6% штаммов, а резистентными оказались 4,0 - 4,4% штаммов. Следует также отметить, что соотношение между чувствительными, промежуточно устойчивыми и резистентными к 14- и 15-членным макролидам штаммами было практически таким же, как и для обоих линкозамидов. Среди других возбудителей, вызывающих инфекции дыхательных путей, резистентность к эритромицину составляет от 15% до 25% в различных странах Европейского региона и достигает 68% в странах ЮгоВосточной Азии, а также превалирует над устойчивостью к пенициллинам [5]. В нашем исследовании резистентность штаммов C.diphtheriae к макролидным антибиотикам также была выше, чем к пенициллинам. Кроме того, не было выявлено закономерности между устойчивостью к пенициллинам и макролидам, что согласуется с данными других исследователей [20] и обусловливает необходимость параллельного тестирования штаммов C.diphtheriae к обоим препаратам. Интересными представляются данные об увеличении циркуляции мультирезистентных штаммов C.diphtheriae, устойчивых сразу к нескольким антибактериальным препаратам, удельный вес которых варьирует от 2,3% до 20% в разных странах мира [12, 20]. Полученные нами результаты также свидетельствуют о наличии в циркулирующей популяции C.diphtheriae до 2% таких штаммов. Резистентность к макролидам у штаммов C.diphtheriae, выделенных от больных с кожной формой дифтерии, оказалась связанной с наличием R-плазмид, несущих ген резистентности к эритромицину - ermX [7, 23, 24]. Эритромицин ингибирует синтез бактериальных белков, взаимодействуя с 23S рРНК большой субъединицы рибосомы. Устойчивость к эритромицину обусловлена защитным действием фермента эритроми-цинметилазы, продукта гена erm, метилирующей остаток аденина в молекуле 23S рибо-сомной РНК, что предотвращает связывание антибиотика. Подобный механизм резистентности к макролидам получил широкое распространение и среди других возбудителей инфекций дыхательных путей, таких как Staphylococcus и Streptococcus [5]. Проведенная в настоящем исследовании erm(Х)-специфическая ПЦР показала, что все резистентные к макролидным антибиотикам штаммы C.diphtheriae несут ген erm^). То есть, резистентность российских штаммов C.diphtheriae к эритромицину обусловлена наличием аллели erm(X)cd, которая, согласно номенклатуре Roberts M.C. et al. [21], относится к классу Х генов erm. Несмотря на достаточно высокий уровень гомологии между генами erm(X), выявленный у различных видов коринебактерий (C.diphtheriae, C.jeikeium, C.xerosis и др.), их нуклеотидные последовательности имеют отличия и могут являться составной частью плазмид, транспозонов или быть интегрированными в хромосому [21, 23, 24]. Постоянная циркуляция возбудителя дифтерии среди населения России и других стран мира [1] свидетельствует о существовании угрозы возникновения вспышек дифтерийной инфекции. Результаты исследований указывают на достаточно высокий уровень распространенности штаммов C.diphtheriae, устойчивых к антибиотикам. Следовательно, целесообразно продолжать мониторинг антибиотикорезистентности штаммов, что позволит клиницистам правильно оценивать потенциальную эффективность лекарственных препаратов.

About the authors

I. A Chagina

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

O. Yu Borisvoa

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

V. G Melnikov

International Scientific-Technical Centre, Moscow, Russia

G. A Ivashinnikova

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

A. S Pimenova

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

E. E Donskikh

Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

L. I Kafarskaya

Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

V. A Aleshkin

Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

References

Supplementary files