ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF VAGINAL LACTOBACILLI PRODUCING HYDROGEN PEROXIDE

Full Text

Лактобациллы являются частью нормальной вагинальной микрофлоры женщин репродуктивного возраста. Гликоген, который появляется в эпителии при половом созревании, служит идеальным субстратом для роста лактобацилл, ферментирующих его в молочную кислоту. В результате этого pH влагалища снижается до уровня 3,8 - 4,0, при котором подавляется развитие других микроорганизмов [1, 3]. В норме во влагалище преобладают лактобациллы, являющиеся сильными антагонистами по отношению ко многим патогенным и условно патогенным микроорганизмам [4, 6]. Под влиянием различных факторов (антибиотики, стрессы, ослабленный иммунитет) происходят качественное и количественное изменения вагинальной нормофлоры, известные под общим названием вагиноз. Он характеризуется резким снижением содержания лактобацилл или полным их отсутствием, высоким содержанием условно патогенных бактерий и грибов рода Candida и высоким значением pH [2]. Наиболее эффективным способом лечения и профилактики вагинозов служит колонизация влагалища активными пробиотическими лактобациллами. Эффективность пробиотических лактобацилл, предназначенных для лечения и профилактики ваги-нозов, в основном зависит от скорости колонизации и закисления ими влагалища, микробицидной активности и способности адгезировать к эпителиальным клеткам. Исследования, проведенные в Африке, показали, что женщины, у которых доминирует вагинальная лактобациллярная микрофлора, продуцирующая Н2О2, реже заражаются ВИЧ [5]. Показано также, что при конкуренции между собой за места обитания лактобактерии, продуцирующие Н2О2, колонизируют влагалище, вытесняя оттуда непродуцирующие Н2О2 лактобактерии, а также условно патогенные микроорганизмы, не обладающие каталазной активностью [4]. Из известных видов лактобацилл всего 3 - L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii упоминаются как продуценты Н2О2 [1, 4]. Для профилактики и лечения воспалительных процессов инфекционной этиологии, в частности вагинитов и вагинозов, протекающих на фоне высокого уровня эндотоксинемии и вторичного вариабельного иммунодефицита у женщин при торпидных формах бактериального ваги-ноза, существует необходимость поиска вагинальных лактобацилл, продуцирующих Н2О2 и проявляющих антибактериальные и антивирусные свойства широко спектра действия [2, 6]. Цель работы - выделение и характеристика вагинальных лактобацилл, образующих Н2О2 и обладающих высокой антагонистической активностью. В качестве штаммов-мишеней использовали Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca и Candida albicans, полученные из Республиканского центра депонирования микроорганизмов НАН Армении. Культивирование лактобацилл проводили на среде MRS и в снятом молоке; для культивирования остальных бактерий использовали питательный бульон (Serva) и декстроз агар (Ferak), а для дрожжей - среду Сабуро (Serva). Лактобациллы выращивали в среде MRS при 37°C в водяной бане с шейкером. Динамику роста культуры определяли измерением оптической плотности при длине волны 590 нм, а кислотность - с помощью pH-метра plONneer 45 (Radiometer). При определении антибактериальной активности лактобациллы выращивали в жидкой среде MRS в условиях интенсивной аэрации, затем центрифугировали при 3000 об/ мин, полученные надосадочные жидкости по 0,3 мл добавляли в лунки диаметром 6 мм, сделанные в агаре и засеянные тест-культурой [3]. Опыты по изучению продукции перекиси водорода в аэрируемых условиях проводили в водяной бане с шейкером в 250 мл колбах Эрленмейера с ватными пробками при 37°C. Количество Н2О2 определяли с помощью полосок Merckoquant peroxide test (Merck), согласно инструкции производителя. Адгезивную способность лактобацилл изучали на клетках урогенитального тракта, изолированных из мочи здоровых женщин. Образцы мочи центрифугировали, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере, смешивали с клеточной суспензией лактобацилл в соотношении 1:10 и инкубировали при 37°C в течение 2 ч. Затем эпителиальные клетки осаждали при 1000 об/мин, окрашивали по Граму и изучали с помощью микроскопа. Степень адгезии определяли по соотношению исходного титра бактерий с титром бактерий в на-досадочной жидкости. Из влагалища здоровых женщин было изолировано 12 штаммов лактобацилл, обладающих способностью ферментировать молоко. Из них был отобран 1 штамм, который по результатам анализа последовательности генов 16S рРНК и а-субъединицы РНК полимеразы, проведенного в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (Москва), был отнесен к L. delbrueckii MH-10. Штамм был депонирован в Республиканском центре депониривания микроорганизмов (РЦДМ) НАН Армении под номером ИНМИА 9614. Последовательности нуклеотидов 16S рДНК и rpoА генов зарегистрированы в GenBank под номерами HQ379171 и HQ379180, соответственно. Клетки L. delbruеcкii MH-10 в стационарной фазе роста имели форму длинных изогнутых, слегка завитых филаментов длиной более 20 мкм; хорошо росли и длительно сохраняли жизнеспособность при посеве двухслойным агаровым методом, образуя при этом слегка выпуклые беловато-матовые колонии диаметром 1 - 2 мм. Изучение роста культур при разных температурах и значениях pH показало, что L. delbrueckii MH-10 одинаково хорошо растет при температуре 37 и 45°C, плохо растет при 30 и 52°С и не растет при температуре ниже 25°C и выше 55°C. Этот микроорганизм довольно хорошо растет при pH 3,5 - 5,0, что служит важным фактором для выживания и размножения в вагинальной среде, где в норме pH не должен превышать 4,5. По достижении культурой стационарной фазы роста рН MRS-среды снижается до 3,8. Бактерии L. delbrueckii MH-10 ферментируют целлобиозу, эскулин, фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, мальтозу, маннозу, салицин, тригалозу и сахарозу; не разжижают желатин, не редуцируют нитраты и не образуют индол, каталазу, уреазу и лецитиназу. При 37-40°C бактерии в течении 5 - 6 ч сквашивают молоко, образуя однородный, сметанообразный сгусток с приятным сладковатым вкусом. При изучении скорости роста и образовании H2O2 в среде MRS в аэробных условиях при интенсивном перемешивании было показано, что культура L. del-brueckii MH-10 за 4 - 4,5 ч доходит до стационарной фазы роста, снижая pH среды до 4,0. В течение этого времени уровень H2O2 достигает 100 мкг/мл и более. В анаэробных условиях после 3 сут роста концентрация H2O2 не превышает 10 мкг/мл. При оценке антибактериальной активности бактерий L. delbrueckii MH-10 было установлено, что зоны подавления на газоне E. соН составляли 25 мм, S. aureus - 20 мм, K. pneumoniae - 8 мм, зон подавления роста C. albicans не обнаружено. В опытах с урогенитальными клетками показано, что клетки L. delbrueckii MH-10 обладают высокой адгезивной способностью в отношении эпителиальных клеток (уровень адгезии in vitro достигал 70%). Штамм L. delbrueckii MH-10, образующий H2O2 и обладающий высокой скоростью роста и закисления культуральной среды, является кандидатом для разработки нового пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения вагинитов и вагинозов.

About the authors

M. M Pashayan

Geratsi Yerevan State Medical University

Armenia

G. G Oganesyan

Geratsi Yerevan State Medical University

Armenia

References

Supplementary files