DEVELOPMENT AND USE OF TEST-SYSTEMS FOR MOLECULAR-GENETIC DETECTION OF OUT-OF-HOSPITAL PNEUMONIA AGENTS

Full Text

Этиологию внебольничной пневмонии (ВП) нельзя признать установленной, поскольку частой находкой при этом являются представители нормальной микробиоты, колонизирующей верхние отделы дыхательных путей. При ВП обнаруживаются Streptococcus pneumoniae (30 - 50% случаев заболевания) и Haemophilus influenzae (до 10%). Определенное значение имеют (8 - 30%) Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae и Legionella pneumophila, к относительно редко встречающимся (3 - 5%) возбудителям относят Staphylococcus aureus, Kbbsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa (у больных муковисцидозом, брон-хоэктазами), Branhamella catarrhalis, Listeria monocytogenes, респираторные вирусы [1, 3]. Все это исключительно усложняет задачу, с одной стороны, выделения безусловных патогенов (например, L.pneumophila, B.catarrhalis, L.mono-cytogenes и др.), а с другой - оценки этиологической значимости условно патогенных микроорганизмов (например, S.aureus, K.pneumoniae, Paeruginosa) [2]. Для достижения указанных целей в последние годы всё шире используются различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако даже в этих случаях пока высок процент ложноположительных результатов, что предопреде- ляет необходимость поиска новых генов-мишеней для уверенной диагностики ВП [3]. Проведен сравнительный множественный анализ нуклеотидных последовательностей (EMBL/GenBank/DDBJ) основных возбудителей ВП (S.pneumo-niae, H.influenza, K.pneumoniae, P.aeruginosa, B.catarrhalis) и подобраны соответствующие олигонуклеотидные праймеры. Материалом для исследования послужила мокрота от 103 больных (48 мужчин, 55 женщин) в возрасте от 18 до 80 лет (средний возраст - 51,38±1,3 лет) с диагнозом ВП различной степени тяжести и мокрота 15 практически здоровых людей. Предварительно мокроту в соответствии с действующими протоколами обследования больных исследовали бактериологическим методом (БМ). Для выделения тотальной ДНК из мокроты использовали наборы реагентов «ДНК-сорб-АМ» («Интерлабсервис», РФ). Амплификацию осуществляли на термоциклере «Терцик МС-2» («ДНК-техно-логия», РФ) с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Для сравнения бинарных признаков зависимых групп применяли критерий Мак-Нимара (%2). В ходе проведенного бактериологического исследования мокроты при внебольничной пневмонии в 26 случаях (25,2%) была выявлена смешанная бактериальная флора. У 14 больных (13,6%) в мокроте обнаружена B.catarrhalis, у 12 пациентов (11,6%) - S.pneumoniaе, что существенно меньше, чем упомянуто в литературе [6], H.influenzae была выявлена у 11 обследуемых (10,7%), K.pneumo-niae в 8 случаях (7,9%). Однако в каждом третьем случае (32 случая, 30%) бактериологически этиологию ВП расшифровать не удалось. В связи со значительным количеством этиологически нерасшифрованных случаев ВП нами была проведена серия исследований, направленных на конструирование диагностической системы для молекулярногенетической детекции труднокультивируемых возбудителей ВП и сопоставления впоследствии полученных данных с результатами культуральных исследований. Анализ данных литературы по указанной проблеме показал, что разработано несколько тест-систем для обнаружения S. рneumoniae ПЦР-методом на основании детекции фрагментов генов пневмолизина, аутолизина, РВР2в, lytA, не обеспечивающих однако необходимую специфичность при идентификации данных возбудителей ВП. Известны праймеры для детекции фрагментов генов 16S rRNA, omp P6, rnpB и bexA H. influenzae [4 - 6]. Предложены олигонуклеотиды для ПЦР типирования K. pneumoniae, P. aeruginosa, B. catarrhalis на основании детекции фрагментов генов ряда факторов патогенности указанных бактерий. Предпринимаются попытки создания мультиплексных диагностических систем для одновременного обнаружения нескольких пневмопатогенов, однако их чувствительность в настоящее время невысока [7]. Учитывая вышеизложенное, а также тот факт, что анализ генов рибосомальных РНК и межгенного транскрибируемого спейсера на сегодняшний день является самым точным инструментом в определении филогенетического положения микроорганизмов, нами был проведен сравнительный множественный анализ найденных последовательностей (EMBL/ GenBank/DDBJ) с применением программ «MegAlign» и «PrimerSelect» из пакета компьютерных программ «Laser-gene» («DNASTAR, Inc.», США), что позволило нам подобрать несколько пар праймеров к генам 16S рРНК ряда возбудителей ВП: S.pneumoniae (StreppF/ StreppR; размер ампликонов - 290 пн; температура отжига - 62°С), H.influenzae (HemF/ HemR; размер ампликонов - 292 пн; температура отжига - 60°С), K. pneumoniae (KlebF/ KlebR; размер ампликонов - 843 пн; температура отжига - 60°С), P. aeruginosa (AeruginF/AeruginR; размер ампликонов - 292 пн; температура отжига - 60°С), B.catarrhalis (MaraF/ MaraR; размер ампликонов - 489 пн; температура отжига - 60°С). Перед применением разработанных нами праймеров они были протестированы на музейных штаммах S.pneumoniae, H.influenzae, K.pneumoniae, P.aeruginosa, B.catarrhalis. В 100% были получены положительные результаты, тогда как с бактериями S. аureus и Escherichia шН результаты были отрицательными. В результате исследования образцов мокроты, ранее исследованных культуральным методом, с помощью ПЦР с использованием разработанных нами праймеров у 19 (18,5%) больных ВП в мокроте были выявлены специфические фрагменты ДНК B.catarrhalis, что статистически значимо различается по сравнению с результатом выявления этого возбудителя бактериальным посевом (Х2=6,67, р=0,0098); у 17 (16,5%) больных - S.pneumoniaе, что также статистически значимо отличалось от результатов бактериологического исследования (%2=4,90, р=0,0269). Частота выявления в образцах мокроты методом ПЦР H.influenzaе и K. pneumoniae статистически значимо возросла до 14,5 и 12,6% (15 и 13 пациентов) (Х2=4,08, р=0,0433; х2=6,75, р=0,0094) соответственно. В 16,5% случаев (17 больных) методом ПЦР были получены положительные результаты одновременно к нескольким видам бактерий (%2=4,50, р=0,0339). Следует отметить, что у этих пациентов заболевание протекало в тяжелой форме. В 3,9% случаев (4 больных) в ПЦР в мокроте была обнаружены P.aeruginosa, тогда как при бактериологическом исследовании указанные микроорганизмы в образцах мокроты не выявлены. Из 32 образцов мокроты от больных с ВП неустановленной бактериологически этиологией методом ПЦР выявить возбудитель с использованием наших праймеров не удалось только у 18 больных (17,5%). При исследовании образцов мокроты контрольной группы не был обнаружен ни один из исследуемых пневмопатогенов. В целом же применение ПЦР позволило увеличить количество положительных результатов в сравнении с бактериологическим исследованием на 40% случаев. Работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

About the authors

A. R Mavzyutov

Bashkiria State Medical University

Ufa, Russia

I. A Mirsayapova

Bashkiria State Medical University

Ufa, Russia

A. Kh Baymiev

Research Institute of Biochemistry and Genetics

Ufa, Russia

G. F Khasanova

Bashkiria State Medical University

Ufa, Russia

G. A Mavzyutova

Bashkiria State Medical University

Ufa, Russia

R. A Ochilova

Bashkiria State Medical University

Ufa, Russia

References

Supplementary files