Development of a method for molecular subtyping Bacillus anthracis using HRM PCR

Full Text

Введение

Возбудитель сибирской язвы имеет особый жизненный цикл, связанный с образованием исключительно устойчивых спор и длительным сохранением Bacillus anthracis в почве в покоящемся состоянии. В результате накопление мутаций ограничивается относительно редкими событиями инфицирования организма чувствительного хозяина, что приводит к небольшим генетическим вариациям внутри вида [1].

Несмотря на высокую генетическую однородность B. anthracis, выбраны и широко используются маркеры для генотипирования: VNTR (тандемные повторы) [2], SNR (однонуклеотидные повторы) [3] и SNP (однонуклеотидные полиморфизмы) [4].

SNP являются более стабильными генетическими маркерами, степень обратных мутаций и гомоплазии существенно меньше, чем, например, для VNTR, что удобно при изучении эволюции бактерии и определении специфичных генетических линий штаммов [5]. Такие особенности способствуют активному поиску и обнаружению информативных SNP.

Первые SNP B. anthracis были описаны при секвенировании изолятов штамма Ames, изолированного из биологического материала жертвы атаки 2001 г. (штамм Florida) и от лабораторного штамма (штамм Porton). Сравнение штаммов показывало их высокое родство [6]. Отбор SNP и их проверка на 88 штаммах B. anthracis позволили выявить 6 специфичных для группы Ames SNP, 4 хромосомных, а также по одной для плазмид pXO1 и pXO2 [7].

В глобальном исследовании 1033 штаммов B. anthracis из 42 стран группой исследователей во главе с Van Ert были открыты 13 «канонических» SNP, разделяющих штаммы B. anthracis на 12 генетических групп. Каноническое генотипирование является ключевым и широко используется в генотипировании [4]. Позже был найден дополнительный SNP A.Br.011, который разделил самую многочисленную группу A.Br.008/009 на подгруппы A.Br.008/011 и A.Br.011/009 [8].

Группа японских исследователей на основе 19 полногеномных сиквенсов, в том числе 2 японских штаммов, классифицировали 2965 SNP на 80 групп SNP (tag типов) и выбрали среди них 3 специфичных для штаммов из Японии [9].

Новые SNP помогают в эпидемиологической расшифровке вспышек сибирской язвы; так, при инциденте заражения B. anthracis через инъекции героина были секвенированы геном штамма Ba4599 от пациента и 2 генома близкородственных штамма из Турции. При сравнении геномов были найдены специфичные SNP для этой вспышки, а также для дополнительного разделения группы A.Br.008 [10].

Таким образом, уже описаны 13 канонических и по меньшей мере 57 дополнительных SNP, специфичных к определённым генетическим группам [4, 6–17]. В то же время было известно, что родственные генетические линии могут находиться на достаточно большом географическом расстоянии. Например, группа A.Br.008/009 встречается в странах Европы, Азии и Южной Америки, а линия A.Br.Aust.94 — в Австралии, странах Азии и Африки. C накоплением штаммов различного географического происхождения закономерным было увеличение количества генетических групп [4]. В частности, при исследовании 193 геномов B. anthracis на основе 5663 парсимоничных SNP выделили 16 основных генетических групп и 330 ветвей с указанием специфичных SNP для групп штаммов и отдельных штаммов [18]. В результате возникает необходимость в идентификации новых специфичных маркеров и разработке метода их определения.

SNP-генотипирование проводится преимущественно методами аллель-специфичной амплификации (TaqMan MGB (Minor Groove Binder), LNA, Melt-MAMA) и плавлением ампликонов с высоким разрешением (High Resolution Melting, HRM) ПЦР [19–21]. Для проведения TaqMan MGB и LNA используют специфичные зонды для SNP. Melt-MAMA основана на соответствии/несоответствии специальных праймеров к локусу с SNP. Принцип HRM-ПЦР построен на детекции разницы температур плавления амликонов. Чувствительность метода достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью HRM-анализа можно проводить детекцию SNP [22]. SNP- и VNTR-локусы применяются для комбинированного генотипирования штаммов методами HRM-ПЦР [23].

С появлением методов высокопроизводительного секвенирования полных геномов (WGS) основным подходом к определению генетического родства штаммов стал анализ SNP корового генома (WGS-SNP-типирование). WGS-SNP-типирование, хотя и позволяет получить исчерпывающую информацию о геномах исследуемых штаммов, является достаточно дорогим и требующим наличия соответствующего оборудования [24].

Данное исследование является логическим продолжением работы [25]. В ней на основе WGS-SNP-анализа корового генома набора штаммов были подробно описаны генетические сублинии, распространённые на территории России и приграничных стран. В ходе исследования было выяснено, что из 66 исследованных штаммов в коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора 49 относились к линии A, остальные 17 штаммов — к линии B. Штаммы линии A неравномерно распределялись между 5 каноническими группам. Больше всего, 35 штаммов, относилось к группе A.Br.008/011, 6 штаммов — к A.Br.Ames, 5 штаммов — к A.Br.Aust94, 2 штамма — к A.Br.001/002, 1 штамм — к A.Br.005/006. Все штаммы основной линии B принадлежали к канонической группе B.Br.001/002. Наиболее типичными для территории России и ближайших стран, имеющими наибольшую эпидемиологическую значимость, являются генетические субкластеры A.Br.STI, A.Br.Tsiankovskii в группе A.Br.008/011, а также новые — A.Br.CEA в группе A.Br.Aust94 и B.Br.Europe, B.Br.Sibеria, B.Br.Asia, B.Br.018 в группе B.Br.001/002. Однако метод молекулярного субтипирования для дифференциации этих субкластеров без использования WGS-SNP не разработан.

Цель исследования — выбор маркерных SNP для типирования генетических субкластеров B. anthracis и разработка метода в формате HRM-ПЦР для их лабораторного определения.

Материалы и методы

Для построения дендрограммы было использовано 222 генома из коллекции GenBank и 66 геномов штаммов из коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора.

Коровое выравнивание осуществлялось с помощью программ «Parsnp» из пакета Harvest suit с референсным геномом Ames Ancestor (GCF_000008445.1). Из коровых SNP удаляли позиции, имеющие неизвестный нуклеотид «N». Далее SNP из файла VCF конкатенировали в файл FASTA. Филогенетическое дерево строили в программе «MEGA X» методом максимального правдоподобия с моделью замен Tamura-Nei.

SNP группировали в типы алгоритмом на основе языка программирования Python с модулями pandas, numpy, scipy и matplotlib.

Праймеры подбирали в программе «Primer-BLAST»¹ и синтезировали в Ставропольском противочумном институте.

ДНК B. anthracis получали согласно МУ 1.3 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности».

Штаммы для валидации метода HRM включали представителей различных генетических групп.

Реакцию ПЦР для маркеров snp.cea, snp.sti, snp.tsian проводили набором «Type-it HRM PCR Kit» («Qiagen»), а для маркеров snp.sib, snp.eursib, snp.012 — «KAPA HRM FAST qPCR Kit» («Roche»). ПЦР-смесь готовили согласно инструкциям к наборам. Количество праймеров в реакции — 0,3 мкM. Режим термоциклирования: первый этап — активация — 95^оС 5 мин 1 цикл, второй этап — денатурация 95^оС 10 с, отжиг 56^оС 30 с, элонгация 72^оС 10 с — 45 циклов, 3 этап — плавление от 60 до 85^оС.

Анализ кривых плавления выполняли в среде разработки языка Python с модулями numpy, scipy, pandas. При анализе данных плавления последовательно использовали операции: интерполяция, вычисление производной, сглаживание и нормализация. Интерполяция данных производилась функциями numpy.linspace() и scipy.interpolate.make_interp_spline().

Производную вычисляли при помощи функции numpy.diff() и формулы –dF/dT, где F — массив данных флуоресценции, T — массив данных температур. Сглаживание данных осуществляли функцией numpy.convolve(). Нормализацию выполняли методом Max–Min c формулой:

(X – X_min)/(X_max – X_min),

где X — массив данных флуоресценции.

Сопоставление найденных генетических групп c филогенетической дендрограммой и визуализацию данных осуществляли в среде языка R с библиотеками ggtree и ggplot2.

Результаты и обсуждение

Исследование состояло из двух этапов: биоинформатического анализа геномных данных и создания лабораторной методики молекулярного субтипирования B. anthracis с использованием HRM-ПЦР.

Биоинформатический анализ геномных данных

На первом этапе исследования было выполнено коровое выравнивание на основе 288 геномов B. anthracis различных генетических групп. В итоге получены 7242 коровых SNP, на их основе построена филогенетическая дендрограмма.

Найденные SNP группировали в типы SNP. Тип SNP можно определить как SNP, разделяющие геномы штаммов на одинаковые подмножества, при этом одно подмножество имеет специфический нуклеотид, другое — альтернативный. Таким образом, один тип SNP обладает одинаковой специфичностью. Технически типом SNP являются SNP с одинаковым набором 0 или 1 (референсных и альтернативных нуклеотидов) в строках VCF-файла. В алгоритме группировки сначала определяются уникальные группы строк, затем каждой уникальной группе и соответствующим отдельным SNP присваивается название (тег или номер SNP). Найденные типы SNP сопоставляли с дендрограммой, построенной на основании SNP корового выравнивания, и определяли их специфичность (рис. 1).

 

Рис. 1. Сопоставление филогенетической дендрограммы и специфических SNP.

Fig. 1. Comparison of the phylogenetic dendrogram and the specific SNPs.

 

Нами было сгруппировано 7242 SNP в 485 типов, из них 6 типов позволяли выделить субкластеры A.Br.CEA, A.Br.STI, A.Br.Tsiankovskii, B.Br.Europe, B.Br.Sibеria, B.Br.Asia, B.Br.018. Из каждого типа отобрано по одному маркерному SNP (табл. 1). К локусам, содержащим маркерные SNP, разработаны праймеры (табл. 2). Snp.cea.3640599 был описан в исследовании с лабораторной методикой определения Melt-MAMA [14].

 

Таблица 1. Маркерные SNP, позволяющие дифференцировать субкластеры В. аnrthracis

Table 1. Marker SNPs enabling identification of В. аnrthracis subclusters

Субкластер Subcluster	Тип SNP Type of SNP	Позиции SNP в геноме референс-штамма Ames Ancestor и замена SNP positions in the genome of Ames Ancestor reference strains and substitution
A.Br.CEA	snp.cea	3640599(C→T); 4129922
A.Br.STI	snp.sti	3477612(T→C); 5018646; 5182989
A.Br.Tsiankovskii	snp.tsian	1512630;1570595; 1669436; 3462463(A→G); 3535633
B.Br.Siberia	snp.sib	852412; 1154559(G→A); 1718548; 3478630
B.Br.Europe B.Br.Siberia	snp.eursib	401345; 845118; 924463;1091101;1275037; 1340610(C→A); 1370064;1707494; 1845295; 1995289; 2203604; 2869433; 3370298; 3434429; 3445848; 3676855; 3744240; 3779450; 3996031; 4010553; 4087470;4099116; 4289474; 4301537; 4374768; 4425661; 4516984; 4741119; 4814382; 5002952; 5195702
B.Br.Europe B.Br.Siberia B.Br.Asia	snp.012	5161369(C→A)

Примечание. Выделены маркерные SNP, подчёркнута маркерная аллель.

Note. Marker SNPs are shown in bold, marker alleles are underlined.

 

Таблица 2. Праймеры к SNP-локусам В. аnrthracis

Table 2. Primers for В. аnrthracis SNP loci

SNP-локус | SNP locus	Прямой праймер | Forward primer	Обратный праймер | Reverse primer
snp.cea.3640599	ACACCTAAACCTTCTTTTAATACATCT	ATTGACCCAACAGCTACGAA
snp.sti.3477612	GCAAATGGCTCTATTTCTGATT	ACAAACGAAAAGATTATCCAAAGTA
snp.tsian.3462463	ACACCACAAATATCACAAAACCT	TCTCTGATACTTCTAATCTGTTCGT
snp.012.5161369	TTTATTAGCAGGAGAACGTAGAAT	AATGCAACGAATGTAATGAAACAT
snp.eursib.1340610	CAAGGCATGAACAAGGAGCTA	AACCCCTGGATTGCCAGTAA
snp.sib.1154559	AGGCTTAGCAAAAGGTCCGA	GCTTTCCGTTTTCTTCACGG

 

Молекулярное субтипирование B. anthracis с использованием HRM-ПЦР

На втором этапе исследования разрабатывался HRM-ПЦР-метод. Оптимизирован протокол проведения HRM-ПЦР, включающий режим термоциклирования и параметры реакции.

Для тестирования разработанного метода были использованы штаммы из различных специфических субкластеров и канонических линий (табл. 3, 4). Принадлежность к определённым каноническим и неканоническим генетическим линиям определялась по результатам ранее проведённого канонического типирования или полногеномного секвенирования. Отметим, что специфическая группа штаммов линии A.Br.Aust94 включала штаммы с уже известным генотипом A.Br.CEA по результатам секвенирования: 312/163, 73/42, 819/5, и неизвестным генотипом: 377/3, 456/13, 1180, 1190, 1283, 52/33, 462/471, 817/685. Штаммы специфической группы были выделены в процессе вспышек на территории Кавказа (Кабардино-Балкарская Республика, Республика Дагестан, Ставропольский край, Республика Ингушетия, Чеченская Республика, Азербайджан, Грузия).

 

Таблица 3. Результаты тестирования штаммов В. аnrthracis (локусы — snp.cea, snp.sti, snp.tsian) методом HRM-ПЦР

Table 3. Results of testing of B. anthracis strains (loci — snp.cea, snp.str, snp.tsian) by HRM PCR

Группа A.Br.CEA | A.Br.CEA group			Группа A.Br.STI и A.Br.Tsiankovskii | A.Br.STI and A.Br.Tsiankovskii group
№ штамма No. strain	линии lineages	snp.cea, toC	№ штамма No. strain	линии lineages	snp.sti, toC	snp.tsian, toC
I-45	A.Br.001/002	71,57	I-45	A.Br.001/002	69,91	70,90
1	A.Br.005/006	71,57	1	A.Br.005/006	69,91	70,99
81/1	A.Br.008/009	71,53	I-357	A.Br.Ames	70,00	70,99
I-19	A.Br.008/009	71,62	388/1	A.Br.Vollum	69,90	71,00
I-357	A.Br.Ames	71,48	140P	B.Br.001/002	69,90	70,90
388/1	A.Br.Vollum	71,48	I-29	B.Br.001/002	69,80	70,90
140P	B.Br.001/002	71,57	1368/1	B.Br.001/002	69,81	70,99
I-29	B.Br.001/002	71,53	312/163	A.Br.Aust94	69,80	70,80
1368/1	B.Br.001/002	71,47	81/1	A.Br.STI	69,90	71,60
312/163	A.Br.CEA	70,93	1CO	A.Br.STI	69,70	71,70
819/5	A.Br.CEA	71,03	363/17	A.Br.STI	69,80	71,60
73/42	A.Br.CEA	71,08	506/55	A.Br.STI	69,80	71,59
377/3	A.Br.CEA	70,97	I-9	A.Br.STI	70,09	71,71
456/13	A.Br.CEA	71,03	228/269	A.Br.STI	69,91	71,79
1180	A.Br.CEA	70,97	618/755	A.Br.Tsian.	70,51	70,89
1190	A.Br.CEA	71,13	1058/654	A.Br.Tsian.	70,59	70,90
1283	A.Br.CEA	71,07	I-19	A.Br.Tsian.	70,41	70,99
52/33	A.Br.CEA	71,07	I-275	A.Br.Tsian.	70,41	70,90
462/471	A.Br.CEA	71,17	I-323	A.Br.Tsian.	70,59	71,00
817/685	A.Br.CEA	71,17	1374/873	A.Br.Tsian.	70,51	70,99

Примечание. Выделены температуры пиков плавления, демонстрирующие специфические реакции при тестировании штаммов разных линий В. аnrthracis.

Note. The melting peak temperatures are indicated in bold, demonstrating specific reactions when testing strains of different B. anthracis lineages.

 

Таблица 4. Результаты HRM-ПЦР-тестирования штаммов для локусов snp.sib, snp.eursib, snp.012

Table 4. Results of HRM PCR testing of strains for loci snp.sib, snp.eursib, snp.012 loci

Группы тестирования B.Br.Sibеria, B.Br.Eursib и B.Br.012 | B.Br.Sib, B.Br.Eursib, and B.Br.012 testing group
№ штамма | No. strain	линии | lineages	snp.sib, t oC	snp.eursib, t oC	snp.012, t oC
I-45	A.Br.001/002	74,61	79,09	70,80
81/1	A.Br.008/009	74,41	79,20	70,90
312/163	A.Br.Aust94	74,51	79,21	71,09
140P	B.Br.Europe	74,60	78,41	70,00
12/16	B.Br.Europe	74,60	78,41	69,70
850/46	B.Br.Europe	74,60	78,41	69,69
I-373	B.Br.Europe	NA	78,51	69,81
1342/12	B.Br.Siberia	73,81	78,50	69,80
I-29	B.Br.Siberia	73,80	78,59	69,99
1368/1	B.Br.Asia	74,60	79,21	69,70
I-362	B.Br.Asia	74,71	79,30	69,71
1284	B.Br.018	74,71	79,30	71,00

Примечание. NA — штамм не тестировался. Жирным шрифтом указаны температуры пиков плавления, демонстрирующие специфические реакции при тестировании штаммов разных линий В. anrthracis.

Note. NA — strain not tested. The melting peak temperatures are indicated in bold, demonstrating specific reactions when testing strains of different B. anthracis lineages.

 

Для типирования штаммов B. anthracis предлагается схема, в которой на первом этапе проводится типирование основных канонических линий, а на втором — дополнительное типирование. В частности, если определяется каноническая линия A.Br.008/009, то необходимо провести дополнительное типирование SNP snp.sti и snp.tsian, при выявлении A.Br.Aust94 — snp.cea, а при идентификации B.Br.001/002 — snp.sib, snp.eursib, snp.012.

Нужно отметить, что при типировании группы B.Br.001/002 используется комбинация SNP: snp.sib, характерный для кластера B.Br.Siberia, snp.eursib — для кластеров B.Br.Siberia и B.Br.Europa, snp.012 — для кластеров B.Br.Siberia, B.Br.Europe и B.Br.Asia. При типировании комбинации 3 SNP удается выделить 4 группы (B.Br.Europe, B.Br.Siberia, B.Br.Asia, B.Br.018) из линии B.Br.001/002 с характерным набором нуклеотидов (табл. 5), что позволяет уменьшить количество ПЦР-реакций и более точно определять специфические группы.

 

Таблица 5. Набор нуклеотидов SNP для специфических субкластеров В. аnrthracis

Table 5. Set of SNP nucleotides specific for different В. anrthracis subclusters

Субкластер Subcluster	Аллели маркерных SNP | Alleles of marker SNPs
	snp.cea	snp.sti	snp.tsian	snp.sib	snp.eursib	snp.012
A.Br.CEA	T	T	A	G	C	C
A.Br.STI	C	C	A	G	C	C
A.Br.Tsiankovskii	C	T	G	G	C	C
B.Br.Siberia	C	T	A	A	A	A
B.Br.Europe	C	T	A	G	A	A
B.Br.Asia	C	T	A	G	C	A
B.Br.018	C	T	A	G	C	C

Примечание. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделен специфический нуклеотид.

Note. A specific nucleotide is highlighted in bold with an underscore.

 

В результате проведения тестирования были получены кривые плавления, произведён анализ кривых плавления и получены пики плавления.

Для snp.cea температура пика плавления ДНК штаммов специфической группы составила 71,06 ± 0,08^oC, а для неспецифической — 71,54 ± 0,05^oC. Температуры специфических групп для snp.sti и snp.tsian были равны 70,43 ± 0,07 и 71,63 ± 0,09^oC, а неспецифических — 69,81 ± 0,08 и 70,88 ± 0,07^oC соответственно (табл. 3, 6, рис. 2). Локусы snp.012, snp.eursib, snp.sib демонстрировали температуру плавления для специфических аллелей, равную 69,80 ± 0,13, 78,47 ± 0,07 и 73,81 ± 0,01^oC соответственно; для неспецифических — 70,95 ± 0,12, 79,21 ± 0,08 и 74,59 ± 0,09^oC соответственно (табл. 5, 6, рис. 3).

 

Рис. 2. Пики и кривые плавление штаммов A.Br.CEA, A.Br.STI и A.Br.Tsiankovskii для соответствующих локусов snp.cea, snp.sti, snp.tsian.

 

Рис. 3. Пики и кривые плавления при анализе штаммов кластеров B.Br.Siberia, B.Br.Europe и B.Br.Siberia, B.Br.012 по соответствующим локусам snp.sib, snp.eursib и snp.012.

 

Таблица 6. Пики плавления SNP-локусов

Table 6. Melting peaks for SNP loci

Локус Locus	Нуклеотид Nucleotide	Пики температур плавления, оC Melting temperature peaks, оC	Разница пиков температур плавления, оC Difference of melting temperature peaks, оC
snp.cea	T	71,06 ± 0,08	0,48
	C	71,54 ± 0,05
snp.sti	C	70,43 ± 0,07	0,63
	T	69,81 ± 0,08
snp.tsian	G	71,63 ± 0,09	0,76
	A	70,88 ± 0,07
snp.sib	A	73,81 ± 0,01	0,79
	G	74,59 ± 0,09
snp.eursib	A	78,47 ± 0,07	0,74
	C	79,21 ± 0,08
snp.012	A	69,80 ± 0,13	1,15
	C	70,95 ± 0,12

Примечание. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделен специфический нуклеотид.

Note. A specific nucleotide is highlighted in bold with an underscore.

 

Определённые генотипы методом HRM-ПЦР в 100% случаев совпадали с генотипами, определёнными в результате полногеномного секвенирования.

Следует отметить, что абсолютные значения кривых и пиков плавления зависят от используемого набора и параметров реакции, но разница в температурах остаётся относительно постоянной.

Ранее нами было показано, что к субкластеру A.Br.CEA canSNP-группы A.Br.Aust94 принадлежат штаммы B. anthracis, выделенные на территории Южного Кавказа и Турции, а также один штамм 73/42, выделенный на Северном Кавказе в Чечено-Ингушской АССР, что дало основание назвать этот субкластер A.Br.CEA (Caucasus-East Anatolia). Тогда же нами было выдвинуто предположение, что многие штаммы из коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института Роспотребнадзора, выделенные на Кавказе, могут относиться к этому субкластеру [24]. В результате типирования разработанным методом установлено, что все штаммы из группы A.Br.Aust94 принадлежали к субкластеру A.Br.CEA, что подтверждает распространение A.Br.CEA по территории Северного и Южного Кавказа.

Таким образом, выбраны маркерные SNP для определения генетических субкластеров A.Br.CEA, A.Br.STI, A.Br.Tsiankovskii, B.Br.Europe, B.Br.Sibеria, B.Br.Asia, B.Br.018 и разработан новый лабораторный метод молекулярного субтипирования B. anthracis с использованием HRM-ПЦР. Использование этого метода молекулярного субтипирования в алгоритме мониторинга возбудителя сибирской язвы позволяет определить принадлежность изолятов B. anthracis к одному из наиболее распространённых и эпидемиологически значимых субкластеров до получения результатов полногеномного секвенирования и филогенетического анализа.

 

¹ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

About the authors

Grigorii A. Pechkovskii

Stavropol Plague Control Research Institute

Author for correspondence.
Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7033-9972
ResearcherId: Q-7273-2016

junior researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Evgeny I. Eremenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8163-1300

D. Sci. (Med.), Professor, principal researcher, Аnthrax laboratory

Россия, Stavropol

Alla G. Ryazanova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5196-784X

Cand. Sci. (Med.), Head, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Sergey V. Pisarenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Laboratory of biochemistry

Россия, Stavropol

Nikolay A. Shapakov

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9152-4026

junior researcher

Россия, Stavropol

Lyudmila Yu. Aksenova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7744-3112

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Olga V. Semenova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0274-898X

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Lyudmila D. Timchenko

North-Caucasus Federal University

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2011-880X

Professor, principal researcher, Interdepartmental scientific and educational laboratory of experimental immunomorphology, immunopathology and immunobiotechnology

Россия, Stavropol

Alexandr N. Kulichenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: grigorii.pechkovskii@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949

D.Sci (Med.), Professor, academician of RAS, director

Россия, Stavropol

References

Supplementary files