Improvement of the technique of SNP-typing of Vibrio cholerae strains on the basis of the analysis of the primary data of whole genome sequencing

Full Text

Введение

Методы генотипирования на основе анализа распределения единичных нуклеотидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) возбудителей опасных инфекционных болезней, в том числе холеры, широко используются в научных исследованиях и эпидемиологическом анализе, поскольку позволяют оценить филогенетические связи между разными штаммами, установить их возможное происхождение, а также источники и пути распространения инфекции. Исследователи используют различные наборы SNP-маркеров, что может приводить к расхождению результатов даже при изучении одного набора штаммов. Например, ранее анализ данных полногеномного секвенирования (whole genome sequencing, WGS) позволил выявить, что клинические штаммы Vibrio cholerae O1, выделенные в 2010 г. в Москве (завоз из Индии), относятся к штаммам «гаитянской группы» [1], однако при анализе с использованием другого набора SNP они попали в группу «непальских штаммов», дистанцированную от вызвавших вспышку на острове Гаити [2].

В ряде случаев набор SNP-маркеров строится непосредственно для анализируемого набора штаммов. Например, именно такой алгоритм используется в программе kSNP 3.0 [3], что было использовано для генотипирования штаммов V. cholerae, выделенных в Демократической Республике Конго [4].

Это подчеркивает актуальность работ по совершенствованию и стандартизации подходов к анализу полногеномных сиквенсов [5] и, соответственно, отбору SNP-маркеров, используемых для генотипирования.

Как правило, результаты WGS представлены «ридами» — последовательностями ДНК размером 100–300 п.о., которые многократно дублируются. В дальнейшем с помощью специализированных программ проводится их сборка в контиги, размеры которых могут достигать сотен тысяч нуклеотидов. При этом существенно сокращается общий объем: так, если набор ридов составляет около 600–900 Мб, то суммарный объем контигов, как правило, не превышает 7 Мб. Это приводит к тому, что большинство исследователей предпочитают работать именно с контигами, а не с ридами.

Однако такой подход имеет существенный недостаток, заключающийся в обработке ошибок. Важно отметить, что если в ридах присутствуют замены нуклеотидов, то программа-сборщик в качестве «правильного» выбирает самый часто встречающийся вариант, вне зависимости от того, встречается он в 99% или в 50% случаев. Таким образом, при работе с контигами может теряться весьма важная информация о достоверности выявляемых SNP.

В связи с этим цель работы состояла в разработке метода оценки качества SNP, используемых для SNP-типирования, на основе анализа их распределения в первичных данных WGS (ридах).

Материалы и методы

В работе использованы данные WGS 56 штаммов разных серогрупп, полученные на платформе «MiSeq Illumina» в лаборатории диагностики особо опасных инфекций ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт», и геномы, включенные в локальную базу геномов, секвенирование которых проведено другими группами исследователей (табл. 1).

 

Таблица 1. Геномы штаммов, использованные в работе

Table 1. Genomes of the strains used in the study

Штамм Strain	Место выделения Place of isolation		Год выделения Year of isolation
	V cholerae 01 CTX*VPI-I*
16228	Республика Дагестан, Россия Republic of Dagestan, Russia		1994
17290	Республика Дагестан, Россия Republic of Dagestan, Russia		1994
17296	Республика Дагестан, Россия Republic of Dagestan, Russia		1994
1786	Гаити Haiti		2010
18329	Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2001
18369	Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2007
301	Таганрог, Россия Taganrog, Russia		2001
31*	Мариуполь, Украина Mariupol, Ukraine		2011
3265_80*	Москва. Россия Moscow, Russia		2014
3569-08*	США USA		2008
39*	Мариуполь. Украина Mariupol. Ukraine		2011
43*	Мариуполь. Украина Mariupol, Ukraine		1994
56*	Мариуполь, Украина Mariupol, Ukraine		1994
81-S*	Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2014
81с	Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2014
CIRS101*	Бангладеш Bangladesh		2002
Е506*	США USA		1974
НС-23А1*	Гаити Hait		2010
МАК676*	Индонезия Indonesia		1937
MJ-1236*	Бангладеш Bangladesh		1994
MS6*	Тайланд Thailand		2008
Р13762	Ташкент, Узбекистан Tashkent, Uzbekistan		1988
RND6878*	Москва, Россия Moscow. Russia		2012
VC51*	Индия India V. cholerae 0139 CTX*VPI-I*		1992
4260В*	Бангладеш Bangladesh		1993
Е306*	Китай China		2013
MO10*	Бангладеш Bangladesh		1992
VC4370*	Малайзия Malaysia		2008
Штамм Strain		Место выделения Place of isolation		Год выделения Year of isolation
		V. cholerae 01 CTX-VPI-I*
18785		Республика Саха. Россия Republic of Sakha. Russia		2003
2687*		Республика Калмыкия. Россия Republic of Kalmykia. Russia		2015
94		Ростов-на-Дону, Россия Rostow-on-Don. Russia		2018
М1501*		Республика Калмыкия. Россия Republic of Kalmykia. Russia		2011
M1518*		Республика Калмыкия. Россия Republic of Kalmykia, Russia		2012
M1524*		Республика Калмыкия, Россия Republic of Kalmykia, Russia		2013
MAK97*		Индонезия Indonesia		1937
Р-18778*		Ростов-на-Дону, Россия Rostow-on-Don, Russia		2005
P18899-D*		Тверь, Россия Tver, Russia		2006
RND18899*		Тверь, Россия Tver, Russia V. cholerae 01 CTX-VPI-I-		2006
18984		Краснодарский край, Россия Krasnodar Kray, Russia		2007
19178		Иркутская область, Россия Irkutsk region, Russia		2015
19308		Астраханская область, Россия Astrakhan region, Russia		2012
20000		Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2016
433*		Сочи, Россия Sochi, Russia		2015
434		Сочи, Россия Sochi, Russia		2015
CP1037(10)*		Мексика Mexico		2003
Env-390*		Гаити Haiti		2012
M1522*		Республика Калмыкия, Россия Republic of Kalmykia, Russia V. cholerae 01 preCTX*		2014
pre_13767		Узбекистан Uzbekistan		1998
pre_15500		Крым, Украина Crimea, Ukraine		1991
pre_18963		Ростов-на-Дону, Россия Rostov-on-Don, Russia		2007
pre_9961		Москва, Россия Moscow, Russia V. cholerae nonO1/nonО139		1977
16002		Узбекистан Uzbekistan		1971
CP1117*		США USA		2010
V51*		США USA		1987
V52*		Судан Sudan		1968
nag16150		Узбекистан Uzbekistan		1987

Примечание. *Геномы получены из базы данных NCBI. Note. *Genomes obtained from the NCBI database.

 

Программное обеспечение разрабатывали на языке программирования Java. Кластерный анализ и построение дендрограммы проводили с использованием обеспечения по методу UPGMA. Для построения дендрограммы использовали программу MEGA 5 [6].

Результаты и обсуждение

Для анализа был использован набор SNP-маркеров, выявленный ранее при анализе данных WGS штаммов V. cholerae [7]. Для этого нами было разработано программное обеспечение, позволяющее оценивать встречаемость каждого SNP непосредственно в наборе ридов. Для каждого изучаемого SNP была посчитана встречаемость в наборе данных первичного секвенирования (ридах) каждого нуклеотида. Примеры результатов анализа нескольких SNP-маркеров представлены в табл. 2, из которой можно видеть, что SNP в позиции 316 в гене VC0275 штамма V. cholerae 81 представлена именно тимином (Т), который обнаружен в 79 ридах, в то время как наличие ридов с аденином (1 рид) и цитозином (2 рида) является ошибкой секвенирования. Аналогичные результаты получены и для генов VC0289, VC0321 и VC0345.

 

Таблица 2. Оценка встречаемости единичных нуклеотидных замен в наборе ридов штаммов V. cholerae 81 и V. cholerae НС-72 (фрагмент). Указано количество ридов, в которых встречается тот или иной нуклеотид

Table 2. Estimation of the occurrence of single nucleotide polymorphisms in the reed set of strains V. cholerae 81 and V. cholerae HC-72 (fragment). The number of rows in which a particular nucleotide occurs is indicated

N	Ген Gene	Позиция Position	V. cholerae 81				V. cholerae HC-72
			A	T	G	C	A	T	G	C
1	VC0275	316	1	79	0	2	0	126	0	0
2	VC0289	564	36	0	0	0	134	1	0	0
3	VC0321	334	0	0	0	207	0	0	0	443
4	VC0345	1047	0	0	1	116	0	0	0	176
5	VC0362	833	148	0	154	1	268	1	241	0
6	VC0362	944	0	133	1	133	0	226	0	206

 

В противовес этому для гена VC0362 почти половина ридов у штамма V. cholerae 81 в позиции 833 содержала аденин (148 ридов), а половина (154 рида) — гуанин. Такое распределение не позволяет рассматривать это как ошибку секвенирования, тем более что аналогичное распределение наблюдается у штамма V. cholerae HC-72, WGS которого проведено другой группой исследователей. Причиной такой «нестабильности» нуклеотидов может являться существование в геноме нескольких копий гена или сходных нуклеотидных мотивов в разных генах, содержащих замены, однако это требует дальнейшего изучения. Тем не менее, вне зависимости от причины, при сборке контигов выбор «итогового» нуклеотида может быть практически случайным и зависеть от незначительного преобладания ридов с тем или иным нуклеотидом. Ярким примером может служить вышеописанный SNP в гене VC0362: так, у штамма V cholerae 81 преобладают риды, содержащие в позиции 833 гуанин, а у V. cholerae HC-72 — аденин. Нам представляется нецелесообразным использовать при анализе подобные «нестабильные» SNP, в связи с чем описанный ранее перечень [7] был сокращен с 3683 до 3198 SNP путем удаления SNP, в которых наиболее часто встречаемый вариант обнаруживался менее чем в 70% случаев. Также очевидно, что выбор схемы SNP-типирования должен осуществляться, исходя из анализа первичных данных секвенирования (ридов), а не результата сборки (контигов).

Довольно информативным методом кластерного анализа является UPGMA — метод невзвешенных парных групп со средним арифметическим [8][9][10][11]. Сравнительный анализ показывает конкордантность результатов UPGMA и других методов анализа, в частности, методов минимального остовного дерева и максимальной бережливости [12][13].

На основе кластерного анализ по методу UPGMA с использованием предлагаемого набора SNP нами была построена дендрограмма, отражающая генетическую близость между геномами 56 штаммов V. cholerae различного происхождения (рисунок). Ранее мы предложили использовать в качестве контрольных образцов при проведении биоинформационного анализа штаммы, геномы которых были секвенированы различными группами авторов, либо штаммы, генетическая близость которых не вызывает сомнений. При этом критерием корректности проведения анализа является попадание «контрольных геномов» в один кластер [7]. В данной работе в качестве таких контролей мы использовали штамм V. cholerae О1 81, геном которого секвенирован дважды: на платформе MiSeq (ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт») и платформе IonTorrent (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Как видно из дендрограммы, оба контрольных штамма попадают в одну ветку, что свидетельствует о корректности проведения кластерного анализа. Аналогичное распределение получено и для двух других пар контрольных геномов: штамма V. cholerae О1 18899 и его изогенного варианта, лишенного гена холерного токсина, и двух относящихся к одному клональному комплексу штаммов V. cholerae О1 № 433 и № 434, выделенных из воды реки Агура в 2015 г. (секвенированных в РосНИПЧИ «Микроб» и ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» соответственно на разных платформах).

Использование нового набора SNP-маркеров позволило более достоверно установить родственные связи между токсигенными штаммами O1 (биовара El Tor) и О139 серогрупп, содержащих разные наборы маркеров эпидемического потенциала: аллели генов ctxB (ctxB3, ctxB1 или ctxB7), tcpA (eltor или CIRS), rtxA (rtxA1, rtxA4 или rtxA4а), структура острова пандемичности VSPII (интактный или содержащий протяженную делецию — VSPIIΔ). Все они сгруппировались в один большой кластер из двух основных ветвей. Наиболее опасные штаммы с генотипом ctxB7 tcp^ACIRS rtxA4a VSPIIΔ и близким ему ctxB1 tcpA^CIRS rtxA4 VSPIIΔ попали в одну ветвь с гаитянскими штаммами и штаммом CIRS101 из Бангладеш; отдельную группу в этой ветви образовали штаммы ctxB1 tcpA^eltor rtxA1 VSPII из Ростова-на-Дону, Казани и Дагестана. В то же время другие дагестанские штаммы с таким же генотипом оказались в составе другой ветви, куда отдельной группой вошли и 4 штамма серогруппы О139, что согласуется с более ранними данными на основе INDEL-типирования [1].

Особый интерес представляют нетоксигенные штаммы, лишенные генов ctxAB и не склонные к эпидемическому распространению. Вместе с тем
они могут вызывать спорадические случаи и локальные вспышки холероподобной диареи за счет экспрессии ряда детерминант факторов патогенности. Часть из них содержит остров патогенности VPI-I, в состав которого входит ген tcpA, а некоторые из последних — профаг preCTX, их вирулентность показана в опытах in vivo [14]. Их происхождение, пути эволюции, а также возможности приобретения генов холерного токсина изучены крайне недостаточно.

По результатам SNP-типирования с использованием другого набора маркеров сотрудниками РосНИПЧИ «Микроб» [15] показано, что штаммы с генотипом ctxAB^–tcpA⁺VSPI⁺VSPII⁺ близкородственны токсигенным штаммам. На этом основании авторами было предложено считать их потенциально эпидемически опасными, т.е. способными приобрести профаг CTX путем «традиционной» и TCP-зависимой трансдукции и восстановить эпидемический потенциал. В то же время штаммы с генотипом ctxAB^–tcpA⁺VSPI^–VSPII^– даже в случае приобретения ими CTX эпидемически опасными стать не могут, поскольку на дендрограмме они образовали отдельный удаленный от токсигенных штаммов кластер. Третий отдаленный от обоих указанных кластер был образован штаммами ctxAB^–tcpA^–VSPI^–VSPII^–. Эти данные позволили оценить сходство и различия между штаммами с разными наборами генетических детерминант и проследить пути их эволюции.

Вместе с тем в анализ была включена большая, но все же ограниченная выборка штаммов, и некоторые генотипы оказались за ее пределами. Мы включили в исследование ряд других нетоксигенных штаммов и установили, что они образуют большее число кластеров на дендрограмме и иногда группируются с токсигенными. Например, штаммы ctxAB^–tcpA⁺VSPI^–VSPII^–, выделенные из водоемов в Ростове-на-Дону и Калмыкии, попали в один кластер со штаммом ctxAB⁺tcpA⁺VSPI⁺VSPII^– V. cholerae O1 MS6 из Тайланда [16]. При этом один из штаммов, выделенных в Ростовской области, (18963) содержал preCTX. Два других штамма preCTX⁺ tcpA⁺VSPI^–VSPII^– сгруппировались со штаммами preCTX^–tcpA⁺VSPI^–VSPII^– — представителями клонального комплекса, вызвавшими вспышку заболеваний в Каменском районе Ростовской области в 2005 г. [17].

Еще более гетерогенной группой возбудителей являются штаммы V. cholerae nonО1/nonО139, в том числе имеющие гены холерного токсина. Например, именно такими штаммами была вызвана продолжительная вспышка в Узбекистане в 1987–1990 гг. [18]. Настоящее исследование показало, что узбекский штамм ctxAB+ tcpA⁺VSPI^–VSPII^– (16150) попадает в общий гетерогенный кластер, содержащий preCTX⁺ и ctxAB⁺ штаммы V. cholerae О1. Ряд других токсигенных штаммов V. cholerae nonO1/nonO139 (V51, CP1117, 16002) образовали отдаленный от него кластер и оказались ближе к нетоксигенным вариантам V. cholerae О1 серогруппы. Штамм V52 ctxAB⁺tcpA⁺VSPI^–VSPII  серогруппы О37 — один из возбудителей крупной эпидемической вспышки в Судане в 1968 г. — оказался близок атоксигенному штамму, выделенному на Гаити в 2012 г.

Очевидно, пути эволюции нетоксигенных штаммов крайне многообразны и требуют отдельного, более детального изучения, чему будет способствовать дальнейшее использование разработанного нами усовершенствованного метода SNP-типирования.

Заключение

В ходе выполнения настоящей работы разработан метод подбора перечня SNP для проведения филогенетического анализа на основе анализа первичных данных WGS (ридов). Составлен перечень из 3198 «стабильных SNP» для проведения филогенетического анализа. Предложена и апробирована методика использования «контрольных геномов» при проведении кластерного анализа данных WGS. Показана генетическая близость между нетоксигенными штаммами, содержащими ген tcpA (ctxAB^–tcpA⁺) и preCTX-штаммами V. cholerae.

About the authors

A. S. Vodopianov

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control

Author for correspondence.
Email: alexvod@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9056-3231

Alexey S. Vodop’yanov — PhD (Med.), senior researcher, Virology group

344019, Rostov-on-Don

Russian Federation

R. V. Pisanov

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7178-8021

Ruslan V. Pisanov — PhD (Biol.), Head, Department of epidemiology of especially targeted infections

344019, Rostov-on-Don

Russian Federation

S. O. Vodopianov

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-4336-0439

Sergey O. Vodop'yanov — D. Sci. (Med.), leading researcher, Head, Department of microbial chemistry

344019, Rostov-on-Don

Russian Federation

I. P. Oleynikov

Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2390-9773

Igor P. Oleynikov — researcher, Department of microbial chemistry

344019, Rostov-on-Don

Russian Federation

References

Supplementary files