Sensitivity of Bordetella pertussis biofilms to polyvalent pertussis serum Eugene M. Zaytsev

Cover Page


Cite item

Abstract

Aim. Study of the sensitivity of Bordetella pertussis biofilms to polyvalent pertussis serum.

Materials and methods. The intensity of biofilm formation by strains of B. pertussis in round-bottomed polystyrene 96-well plates in the presence of polyvalent pertussis serum was estimated by staining with 0.1% gentian-violet solution. The serum titer was estimated as a highest dilution, which suppressed the growth of biofilm cultures.

Results. Serum titers that completely suppressed the formation of biofilms by the studied strains ranged from  : 1,000 to 1 : 20,000. Vaccine strain No. 475a (serotype 1.2.3) was characterized by the highest sensitivity to serum, the titer of which was 1 : 20,000. Vaccine strain No. 305 (serotype 1.2.0) and strains isolated from whooping cough patients in the period from 2001 to 2010: No. 287 (serotype 1.0.3), No. 178 (serotype 1.2.0), No. 317 (serotype 1.2.3) were sensitive to serum in the titers 1 : 1,000-1 : 2,000. Vaccine strain No. 703 (serotype 1.0.3) was resistant to all serum dilutions studied. When sowing supernatants from wells with biofilms on a dense nutrient medium, the growth of colonies typical for B. pertussis was observed. Similar results were obtained when seeding the supernatants of the cultures from the wells with no biofilm.

Conclusion. These data indicate that B. pertussis strains are heterogeneous in sensitivity to pertussis serum. The growth of colonies typical for B. pertussis when culture supernatants are sown on a dense nutrient medium, in the absence of biofilms in the wells, indicates that the biofilm formation is suppressed by inhibiting the adhesion of microbial cells on the substrate, and not due to the bactericidal action of the serum.

Full Text

Введение

Коклюш остается актуальной проблемой здра­воохранения во всем мире, в том числе в странах с высоким уровнем вакцинации. Наблюдаются ак­тивизация эпидемического процесса коклюша во всех возрастных группах населения, скрытая цир­куляция Bordetella pertussis, рост заболеваемости и смертельных исходов [1][2]. Одной из вероятных причин продолжающегося эпидемического процес­са коклюшной инфекции могут быть биопленочные формы B. pertussis [3].

Большинство бактерий существуют в природе в виде биопленочных форм. Биопленки отличаются от планктонных (суспендированных) культур из­мененным спектром экспрессии генов и обладают повышенной устойчивостью к условиям внешней среды, антибиотикам, иммунным факторам [4][5]. В связи с этим проблема подавления формирования и роста биопленочных форм бактерий продолжает оставаться актуальной для здравоохранения.

Формирование биопленок рассматривается как один из способов преодоления воздействия иммун­ной системы. Важное значение имеет понимание того, как иммунный ответ влияет на рост биопленок и особенности проявления вирулентности возбуди­теля. Все основные звенья иммунитета (врожден­ный и адаптивный, клеточный и гуморальный) имеют эффекторные механизмы, направленные на элиминацию биопленок. Возможны различные ме­ханизмы иммунного подавления образования и де­струкции биопленок. Антитела к поверхностным адгезинам, фимбриям, участвующим в фиксации биопленок на субстрате, могут ингибировать обра­зование биопленок. Антитела в присутствии ком­племента могут стимулировать опсонинзависимую активацию фагоцитоза, приводящую к деструкции биопленок. Важное значение для создания высо­коэффективных антибиопленочных вакцин имеет выявление структур с антигенными свойствами, присутствующих в биопленках, но отсутствующих у планктонных форм. Перспективным является из­учение возможности использования антител для профилактики образования и деструкции биопле­нок [6][7][8].

Механизмы формирования биопленок разны­ми штаммами B. pertussis, их чувствительность к иммунным факторам пока изучены недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единтные пу­бликации [3].

Цель работы заключалась в изучении чувстви­тельности биопленок штаммов B. pertussis к поли­валентной коклюшной сыворотке (ПКС).

Материалы и методы

В опытах использовали «вакцинные» штаммы B. pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1950-1960-е гг., применяющиеся в России для из­готовления корпускулярных коклюшных вакцин: штамм № 475а (серовар 1.2.3), селекционирован­ный из штамма № 475, штамм № 305 (серовар 1.2.0), штамм № 703 (серовар 1.0.3), а также вы­деленные в России от больных коклюшем в 2001­2010 гг. штамм № 178 (серовар 1.2.0), штаммы № 287 (серовар 1.0.3) и № 317 (серовар 1.2.3). В опы­тах использовали ПКС для реакции агглютинации, полученную из сыворотки крови ослов или кроли­ков, гипериммунизированных инактивированными, а затем живыми коклюшными микробами (филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Титр ПКС в реакции агглютинации составлял 1 : 16 000, консервант — мертиолят 1 : 10 000. Контроль мор­фологических, серологических и культуральных свойств штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями [9].

В качестве инокулята для получения биопле­нок использовали ночные культуры штаммов, выра­щенные на плотной питательной среде («Бордетелагар», ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Суспензию бактерий культивировали в 96-луночных пластико­вых планшетах («Nunc») в жидкой синтетической питательной среде [10]. Культуры штаммов в жид­кой синтетической питательной среде в концентра­ции 5,0 МОЕ в объеме 0,1 мл вносили в лунки план­шетов. После этого в лунки добавляли по 0,1 мл ПКС в разведениях 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 20 000 и 1 : 40 000. Планшеты накрывали крышкой и ставили в термостат при 37°С в горизонтальном положении на ровную поверхность на 24 ч. После культивиро­вания бактерий из лунок планшета с разведениями ПКС 1 : 1000 и 1 : 40 000 осторожно отбирали среду с планктонными клетками в объеме 0,1 мл и высева­ли на кассеты с плотной питательной средой («Бордетелагар»), которые инкубировали в термостате при 37°С в течение 2 сут.

Интенсивность образования биопленок в план­шетах после окрашивания 0,1% раствором генциан-фиолетового оценивали по отношению оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя биопленки к негативному контролю (ОП питатель­ной среды = 0,045 ± 0,003) как плотные (ОП > 0,192), умеренные (0,096 ≤ ОП ≤ 0,192), слабые/отсутствие биопленок (ОП ≤ 0,096). Результаты оценивали по значениям титра ПКС, который определяли как наибольшее ее разведение, подавляющее рост био­пленочных культур. Для достоверности результатов использовали 4 лунки на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного об­разца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по критерию t Стьюдента [11].

Результаты

Результаты исследования чувствительности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. per­tussis к ПКС приведены в таблице. Для оценки вли­яния ПКС на рост биопленок определяли ее титр. Контрольные культуры исследованных штаммов, не содержавшие ПКС, различались по интенсив­ности образования биопленок. Штаммы № 475а и 703 формировали умеренные биопленки, а штаммы № 305, 317, 178 и 287 — плотные биопленки.

Вакцинный штамм № 475а отличался высокой чувствительностью к ПКС, титр которой составлял 1 : 20 000. Только в разведении сыворотки 1 : 40 000 микробные клетки этого штамма формировали умеренные биопленки. Титр ПКС с вакцинным штаммом № 305 составлял 1 : 1000. В присутствии остальных разведений ПКС формировались плот­ные биопленки. Вакцинный штамм № 703 прояв­лял устойчивость к действию ПКС и формировал умеренные биопленки при всех исследованных разведениях. Титр ПКС, полностью подавлявшей рост биопленок свежевыделенных штаммов № 317 и 178, составлял 1 : 1000 с ростом умеренных и плотных биопленок при больших разведениях сы­воротки. Титр ПКС со свежевыделенным штаммом № 287 составлял 1 : 2000 с ростом умеренных и плотных биопленок при разведении ПКС 1 : 20 000 и 1 : 40 000 соответственно. При посеве надосадочной жидкости биопленочных культур всех исследо­ванных штаммов в присутствии ПКС на плотную питательную среду отмечен сплошной рост типич­ных для B. pertussis колоний. Аналогичные резуль­таты получены при посеве надосадочной жидко­сти культур всех штаммов из лунок с отсутствием биопленок. На плотной питательной среде росли мелкие колонии размером 0,5-1,0 мм, выпуклые, круглые, сероватого цвета, блестящие. Проверка морфологических свойств колоний показала, что это неподвижные, грамотрицательные, овоидной формы мелкие палочки, в мазках располагавшиеся отдельно или парами.

 

Влияние ПКС на рост биопленок штаммов B. pertussis
Effect of polyvalent pertussis serum on the growth of biofilms of B. pertussis strains

 

Значения ОП и интенсивность роста биопленок штаммов B. pertussis Optical density values and growth rate of biofilms of B. pertussis strains

Разведение сыворотки Serum dilutions

вакцинные штаммы vaccine strains

свежевыделенные штаммы freshly isolated strains

 

475а (1.2.3)

305 (1.2.0)

703 (1.0.3)

317 (1.2.3)

178 (1.2.0)

287 (1.0.3)

1:1000

0,068 ± 0,008 Нет No

0,089 ± 0,013 Нет No

0,119 ± 0,025 Умеренная Medium

0,067 ± 0,003 Нет No

0,093 ± 0,020 Нет No

0,061 ± 0,011 Нет No

1 :2000

0,074 ± 0,004 Нет No

0,230 ± 0,009 Плотная Dense

0,101 ± 0,011 Умеренная Medium

0,104 ± 0,006 Умеренная Medium

0,107 ± 0,008 Умеренная Medium

0,077 ± 0,009 Нет No

1 : 20 000

0,096 ± 0,008 Нет No

0,196 ± 0,013 Плотная Dense

0,165 ± 0,049 Умеренная Medium

0,156 ± 0,008 Умеренная Medium

0,178 ± 0,013 Умеренная Medium

0,155 ± 0,009 Умеренная Medium

1 : 40 000

0,126 ± 0,008 Умеренная Medium

0,276 ± 0,019 Плотная Dense

0,188 ± 0,023 Умеренная Medium

0,204 ± 0,014 Плотная Dense

0,219 ± 0,007 Плотная Dense

0,227 ± 0,013 Плотная Dense

Контроль биопленки Control of biofilm

0,134 ± 0,011 Умеренная Medium

0,269 ± 0,002 Плотная Dense

0,192 ± 0,050 Умеренная Medium

0,218 ± 0,006 Плотная Dense

0,246 ± 0,019 Плотная Dense

0,201 ± 0,019 Плотная Dense

 

Обсуждение

Биопленки B. pertussis имеют важное значе­ние для поддержания эпидемического процесса коклюшной инфекции. В связи с этим актуальным является исследование механизмов формирования биопленок и поиск факторов, влияющих на этот процесс. Механизмы антибиопленочного иммуни­тета при коклюше практически не изучены и могут быть связаны с эффекторными механизмами кле­точного и гуморального иммунитета.

Результаты опытов выявили определенные раз­личия между биопленками исследованных штам­мов по чувствительности к ПКС. По отношению к 5 из 6 штаммов выявлена отчетливая зависимость ин­тенсивности роста биопленок от разведения ПКС. Титры ПКС, полностью подавлявшие формирова­ние биопленок исследованными штаммами, варьи­ровали от 1 : 1000 до 1 : 20 000. Наиболее высокой чувствительностью к ПКС отличался вакцинный штамм № 475а. Вакцинный штамм № 305 и свеже­выделенные штаммы были чувствительны к ПКС в титрах 1 : 1000-1 : 2000. Вакцинный штамм № 703 обладал устойчивостью ко всем исследованным разведениям ПКС. Полученные результаты указы­вают на гетерогенность исследованных нами вак­цинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis по чувствительности к ПКС.

Результаты высева супернатантов культур штаммов на плотную питательную среду позво­ляют сделать определенные выводы о механизме подавления биопленкообразования ПКС. Наличие роста типичных для B. pertussis колоний на плотной питательной среде при отсутствии роста биопленок в планшетах указывает на отсутствие бактерицид­ного действия ПКС и свидетельствует о подавлении биопленкообразования за счет ингибирования ад­гезии микробных клеток на субстрате. Использо­ванная нами ПКС является суммарной фракцией антител к антигенам коклюшного микроба, среди которых можно предположить наличие антител к другим структурным компонентам помимо агглю­тиногенов, в том числе факторам, принимающим участие в адгезии микробных клеток на субстра­те (пертактин, филаментозный гемагглютинин и др.). Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов о подавлении поликло­нальными антителами к филаментозному гемагглютинину образования биопленок штаммами B. pertussis [12]. Различия между интенсивностью образования биопленок могут быть обусловлены различным соотношением между уровнем экспрес­сии этих факторов и уровнем антител к ним в со­ставе ПКС.

Полученные нами результаты указываю на целесообразность дальнейшего изучения чувстви­тельности биопленок B. pertussis в отношении антител к адгезинам и другим вирулентным фак­торам коклюшного микроба. Изучение факторов гуморального противококлюшного иммунитета, подавляющих образование биопленок или разру­шающих зрелые биопленки, имеет важное научное и практическое значение. Выяснение механизмов антибиопленочного иммунитета будет способство­вать расширению наших представлений о патогене­зе коклюшной инфекции и причинах продолжаю­щейся циркуляции возбудителя коклюша в услови­ях широкого охвата населения прививками, а также открывает перспективы для обоснования терапев­тического воздействия на биопленки антителами к определенным структурным компонентам.

×

About the authors

Eugene M. Zaуtsev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: pertussis@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9074

Doct. Sci. (Med.), Head, Laboratory of immunomodulators.

105064, Moscow

Russian Federation

Marina V. Вritsina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: britsinamarina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3044-0790

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.

105064, Moscow

Russian Federation

Maria N. Ozeretskovskaya

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: manja33@yandex.ru

Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.

105064, Moscow

Russian Federation

Natalia U. Mertsalova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: n.mertzalova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9072-2538

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.

105064, Moscow

Russian Federation

Irina G. Bazhanova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: ibajanowa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1404-1498

Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.

105064, Moscow

Russian Federation

References

  1. Субботина К.А., Фельдблюм И.В., Кочергина Е.А., Лехтина Н.А. Эпидемиологическое обоснование к изменению стратегии и тактики специфической профилактики коклюша в современных условиях. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2019; 18(2): 27-33. https://doi.org/10.31631/20733046-2019-18-2-27-33
  2. Di Mattia G., Nicolai A., Frassanito A., Petrarca L., Nenna R., Midulla F. Pertussis: New preventive strategies for an old dis-ease. Paediatr. Respir. Rev. 2019; 29: 68-73. https://doi.org/10.1016/j.prrv.2018.03.011
  3. Cattelan N., Dubey P., Arnal L., Yantorno O.M., Deora R. Bordetella biofilms: a lifestyle leading to persistent infections. Pathog. Dis. 2016; 74(1): ftv108. https://doi.org/10.1093/femspd/ftv108
  4. Бехало В.А., Бондаренко В.М., Сысолятина Е.В., Нагурская Е.В. Иммунологические особенности бактериальных клеток медицинских биопленок. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; (4): 97-105.
  5. Del Pozo J.L. Biofilm-related disease. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2018; 16(1): 51-65. https://doi.org/10.1080/14787210.2018.1417036.
  6. Чеботарь И.В. Механизмы антибиопленочного иммунитета. Вестник Российской академии медицинских наук. 2012: 67(12): 22-9.
  7. Chung P.Y., Khanum R. Antimicrobial peptides as potential anti-biofilm agents against multidrug-resistant bacteria. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2017; 50(4): 405-10. https://doi.org/10.1016/jjmii.2016.12.005
  8. Pletzer D., Coleman S.R., Hancock R.E Antibiofilm peptides as a new weapon in antimicrobial warfare. Curr. Opin. Microbiol. 2016; 33: 35-40. https://doi.org/10.1016/j.mib.2016.05.016
  9. МУК 4.2.2317-08. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. М.; 2009.
  10. Зайцев Е.М., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мерцалова Н.У, Бажанова И.Г. Культивирование биопленок Bordetella pertussis на абиотическом субстрате. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; (1): 49-53. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-49-53.
  11. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград; 1962.
  12. Serra D.O., Conover M.S., Arnal L., Sloan G.P., Rodrigu¬ez M.E., Yantorno O.M., et al. FHA-mediated cell-substrate and cell-cell adhesions are critical for Bordetella pertussis biofilm formation on abiotic surfaces and in the mouse nose and the trachea. PLoS One. 2011; 6(12): e28811. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028811

Copyright (c) 2020 Zaуtsev E.M., Вritsina M.V., Ozeretskovskaya M.N., Mertsalova N.U., Bazhanova I.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies