Email this article Sensitivity of Bordetella pertussis biofilms to polyvalent pertussis serum Eugene M. Zaytsev
- Authors: Zaуtsev E.M.1, Вritsina M.V.1, Ozeretskovskaya M.N.1, Mertsalova N.U.1, Bazhanova I.G.1
-
Affiliations:
- Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
- Issue: Vol 97, No 5 (2020)
- Pages: 413-417
- Section: ORIGINAL RESEARCHES
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/893
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-5-3
- ID: 893
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. Study of the sensitivity of Bordetella pertussis biofilms to polyvalent pertussis serum.
Materials and methods. The intensity of biofilm formation by strains of B. pertussis in round-bottomed polystyrene 96-well plates in the presence of polyvalent pertussis serum was estimated by staining with 0.1% gentian-violet solution. The serum titer was estimated as a highest dilution, which suppressed the growth of biofilm cultures.
Results. Serum titers that completely suppressed the formation of biofilms by the studied strains ranged from : 1,000 to 1 : 20,000. Vaccine strain No. 475a (serotype 1.2.3) was characterized by the highest sensitivity to serum, the titer of which was 1 : 20,000. Vaccine strain No. 305 (serotype 1.2.0) and strains isolated from whooping cough patients in the period from 2001 to 2010: No. 287 (serotype 1.0.3), No. 178 (serotype 1.2.0), No. 317 (serotype 1.2.3) were sensitive to serum in the titers 1 : 1,000-1 : 2,000. Vaccine strain No. 703 (serotype 1.0.3) was resistant to all serum dilutions studied. When sowing supernatants from wells with biofilms on a dense nutrient medium, the growth of colonies typical for B. pertussis was observed. Similar results were obtained when seeding the supernatants of the cultures from the wells with no biofilm.
Conclusion. These data indicate that B. pertussis strains are heterogeneous in sensitivity to pertussis serum. The growth of colonies typical for B. pertussis when culture supernatants are sown on a dense nutrient medium, in the absence of biofilms in the wells, indicates that the biofilm formation is suppressed by inhibiting the adhesion of microbial cells on the substrate, and not due to the bactericidal action of the serum.
Full Text
Введение
Коклюш остается актуальной проблемой здравоохранения во всем мире, в том числе в странах с высоким уровнем вакцинации. Наблюдаются активизация эпидемического процесса коклюша во всех возрастных группах населения, скрытая циркуляция Bordetella pertussis, рост заболеваемости и смертельных исходов [1][2]. Одной из вероятных причин продолжающегося эпидемического процесса коклюшной инфекции могут быть биопленочные формы B. pertussis [3].
Большинство бактерий существуют в природе в виде биопленочных форм. Биопленки отличаются от планктонных (суспендированных) культур измененным спектром экспрессии генов и обладают повышенной устойчивостью к условиям внешней среды, антибиотикам, иммунным факторам [4][5]. В связи с этим проблема подавления формирования и роста биопленочных форм бактерий продолжает оставаться актуальной для здравоохранения.
Формирование биопленок рассматривается как один из способов преодоления воздействия иммунной системы. Важное значение имеет понимание того, как иммунный ответ влияет на рост биопленок и особенности проявления вирулентности возбудителя. Все основные звенья иммунитета (врожденный и адаптивный, клеточный и гуморальный) имеют эффекторные механизмы, направленные на элиминацию биопленок. Возможны различные механизмы иммунного подавления образования и деструкции биопленок. Антитела к поверхностным адгезинам, фимбриям, участвующим в фиксации биопленок на субстрате, могут ингибировать образование биопленок. Антитела в присутствии комплемента могут стимулировать опсонинзависимую активацию фагоцитоза, приводящую к деструкции биопленок. Важное значение для создания высокоэффективных антибиопленочных вакцин имеет выявление структур с антигенными свойствами, присутствующих в биопленках, но отсутствующих у планктонных форм. Перспективным является изучение возможности использования антител для профилактики образования и деструкции биопленок [6][7][8].
Механизмы формирования биопленок разными штаммами B. pertussis, их чувствительность к иммунным факторам пока изучены недостаточно, по данной проблеме имеются лишь единтные публикации [3].
Цель работы заключалась в изучении чувствительности биопленок штаммов B. pertussis к поливалентной коклюшной сыворотке (ПКС).
Материалы и методы
В опытах использовали «вакцинные» штаммы B. pertussis, выделенные от больных коклюшем в 1950-1960-е гг., применяющиеся в России для изготовления корпускулярных коклюшных вакцин: штамм № 475а (серовар 1.2.3), селекционированный из штамма № 475, штамм № 305 (серовар 1.2.0), штамм № 703 (серовар 1.0.3), а также выделенные в России от больных коклюшем в 20012010 гг. штамм № 178 (серовар 1.2.0), штаммы № 287 (серовар 1.0.3) и № 317 (серовар 1.2.3). В опытах использовали ПКС для реакции агглютинации, полученную из сыворотки крови ослов или кроликов, гипериммунизированных инактивированными, а затем живыми коклюшными микробами (филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Титр ПКС в реакции агглютинации составлял 1 : 16 000, консервант — мертиолят 1 : 10 000. Контроль морфологических, серологических и культуральных свойств штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями [9].
В качестве инокулята для получения биопленок использовали ночные культуры штаммов, выращенные на плотной питательной среде («Бордетелагар», ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Суспензию бактерий культивировали в 96-луночных пластиковых планшетах («Nunc») в жидкой синтетической питательной среде [10]. Культуры штаммов в жидкой синтетической питательной среде в концентрации 5,0 МОЕ в объеме 0,1 мл вносили в лунки планшетов. После этого в лунки добавляли по 0,1 мл ПКС в разведениях 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 20 000 и 1 : 40 000. Планшеты накрывали крышкой и ставили в термостат при 37°С в горизонтальном положении на ровную поверхность на 24 ч. После культивирования бактерий из лунок планшета с разведениями ПКС 1 : 1000 и 1 : 40 000 осторожно отбирали среду с планктонными клетками в объеме 0,1 мл и высевали на кассеты с плотной питательной средой («Бордетелагар»), которые инкубировали в термостате при 37°С в течение 2 сут.
Интенсивность образования биопленок в планшетах после окрашивания 0,1% раствором генциан-фиолетового оценивали по отношению оптической плотности (ОП) окрашенного растворителя биопленки к негативному контролю (ОП питательной среды = 0,045 ± 0,003) как плотные (ОП > 0,192), умеренные (0,096 ≤ ОП ≤ 0,192), слабые/отсутствие биопленок (ОП ≤ 0,096). Результаты оценивали по значениям титра ПКС, который определяли как наибольшее ее разведение, подавляющее рост биопленочных культур. Для достоверности результатов использовали 4 лунки на один опытный образец и рассчитывали среднюю величину ОП опытного образца и удвоенную ошибку. Сравнения проводили по критерию t Стьюдента [11].
Результаты
Результаты исследования чувствительности вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis к ПКС приведены в таблице. Для оценки влияния ПКС на рост биопленок определяли ее титр. Контрольные культуры исследованных штаммов, не содержавшие ПКС, различались по интенсивности образования биопленок. Штаммы № 475а и 703 формировали умеренные биопленки, а штаммы № 305, 317, 178 и 287 — плотные биопленки.
Вакцинный штамм № 475а отличался высокой чувствительностью к ПКС, титр которой составлял 1 : 20 000. Только в разведении сыворотки 1 : 40 000 микробные клетки этого штамма формировали умеренные биопленки. Титр ПКС с вакцинным штаммом № 305 составлял 1 : 1000. В присутствии остальных разведений ПКС формировались плотные биопленки. Вакцинный штамм № 703 проявлял устойчивость к действию ПКС и формировал умеренные биопленки при всех исследованных разведениях. Титр ПКС, полностью подавлявшей рост биопленок свежевыделенных штаммов № 317 и 178, составлял 1 : 1000 с ростом умеренных и плотных биопленок при больших разведениях сыворотки. Титр ПКС со свежевыделенным штаммом № 287 составлял 1 : 2000 с ростом умеренных и плотных биопленок при разведении ПКС 1 : 20 000 и 1 : 40 000 соответственно. При посеве надосадочной жидкости биопленочных культур всех исследованных штаммов в присутствии ПКС на плотную питательную среду отмечен сплошной рост типичных для B. pertussis колоний. Аналогичные результаты получены при посеве надосадочной жидкости культур всех штаммов из лунок с отсутствием биопленок. На плотной питательной среде росли мелкие колонии размером 0,5-1,0 мм, выпуклые, круглые, сероватого цвета, блестящие. Проверка морфологических свойств колоний показала, что это неподвижные, грамотрицательные, овоидной формы мелкие палочки, в мазках располагавшиеся отдельно или парами.
Влияние ПКС на рост биопленок штаммов B. pertussis
Effect of polyvalent pertussis serum on the growth of biofilms of B. pertussis strains
| Значения ОП и интенсивность роста биопленок штаммов B. pertussis Optical density values and growth rate of biofilms of B. pertussis strains | |||||
Разведение сыворотки Serum dilutions | вакцинные штаммы vaccine strains | свежевыделенные штаммы freshly isolated strains | ||||
| 475а (1.2.3) | 305 (1.2.0) | 703 (1.0.3) | 317 (1.2.3) | 178 (1.2.0) | 287 (1.0.3) |
1:1000 | 0,068 ± 0,008 Нет No | 0,089 ± 0,013 Нет No | 0,119 ± 0,025 Умеренная Medium | 0,067 ± 0,003 Нет No | 0,093 ± 0,020 Нет No | 0,061 ± 0,011 Нет No |
1 :2000 | 0,074 ± 0,004 Нет No | 0,230 ± 0,009 Плотная Dense | 0,101 ± 0,011 Умеренная Medium | 0,104 ± 0,006 Умеренная Medium | 0,107 ± 0,008 Умеренная Medium | 0,077 ± 0,009 Нет No |
1 : 20 000 | 0,096 ± 0,008 Нет No | 0,196 ± 0,013 Плотная Dense | 0,165 ± 0,049 Умеренная Medium | 0,156 ± 0,008 Умеренная Medium | 0,178 ± 0,013 Умеренная Medium | 0,155 ± 0,009 Умеренная Medium |
1 : 40 000 | 0,126 ± 0,008 Умеренная Medium | 0,276 ± 0,019 Плотная Dense | 0,188 ± 0,023 Умеренная Medium | 0,204 ± 0,014 Плотная Dense | 0,219 ± 0,007 Плотная Dense | 0,227 ± 0,013 Плотная Dense |
Контроль биопленки Control of biofilm | 0,134 ± 0,011 Умеренная Medium | 0,269 ± 0,002 Плотная Dense | 0,192 ± 0,050 Умеренная Medium | 0,218 ± 0,006 Плотная Dense | 0,246 ± 0,019 Плотная Dense | 0,201 ± 0,019 Плотная Dense |
Обсуждение
Биопленки B. pertussis имеют важное значение для поддержания эпидемического процесса коклюшной инфекции. В связи с этим актуальным является исследование механизмов формирования биопленок и поиск факторов, влияющих на этот процесс. Механизмы антибиопленочного иммунитета при коклюше практически не изучены и могут быть связаны с эффекторными механизмами клеточного и гуморального иммунитета.
Результаты опытов выявили определенные различия между биопленками исследованных штаммов по чувствительности к ПКС. По отношению к 5 из 6 штаммов выявлена отчетливая зависимость интенсивности роста биопленок от разведения ПКС. Титры ПКС, полностью подавлявшие формирование биопленок исследованными штаммами, варьировали от 1 : 1000 до 1 : 20 000. Наиболее высокой чувствительностью к ПКС отличался вакцинный штамм № 475а. Вакцинный штамм № 305 и свежевыделенные штаммы были чувствительны к ПКС в титрах 1 : 1000-1 : 2000. Вакцинный штамм № 703 обладал устойчивостью ко всем исследованным разведениям ПКС. Полученные результаты указывают на гетерогенность исследованных нами вакцинных и свежевыделенных штаммов B. pertussis по чувствительности к ПКС.
Результаты высева супернатантов культур штаммов на плотную питательную среду позволяют сделать определенные выводы о механизме подавления биопленкообразования ПКС. Наличие роста типичных для B. pertussis колоний на плотной питательной среде при отсутствии роста биопленок в планшетах указывает на отсутствие бактерицидного действия ПКС и свидетельствует о подавлении биопленкообразования за счет ингибирования адгезии микробных клеток на субстрате. Использованная нами ПКС является суммарной фракцией антител к антигенам коклюшного микроба, среди которых можно предположить наличие антител к другим структурным компонентам помимо агглютиногенов, в том числе факторам, принимающим участие в адгезии микробных клеток на субстрате (пертактин, филаментозный гемагглютинин и др.). Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов о подавлении поликлональными антителами к филаментозному гемагглютинину образования биопленок штаммами B. pertussis [12]. Различия между интенсивностью образования биопленок могут быть обусловлены различным соотношением между уровнем экспрессии этих факторов и уровнем антител к ним в составе ПКС.
Полученные нами результаты указываю на целесообразность дальнейшего изучения чувствительности биопленок B. pertussis в отношении антител к адгезинам и другим вирулентным факторам коклюшного микроба. Изучение факторов гуморального противококлюшного иммунитета, подавляющих образование биопленок или разрушающих зрелые биопленки, имеет важное научное и практическое значение. Выяснение механизмов антибиопленочного иммунитета будет способствовать расширению наших представлений о патогенезе коклюшной инфекции и причинах продолжающейся циркуляции возбудителя коклюша в условиях широкого охвата населения прививками, а также открывает перспективы для обоснования терапевтического воздействия на биопленки антителами к определенным структурным компонентам.
About the authors
Eugene M. Zaуtsev
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Author for correspondence.
Email: pertussis@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4813-9074
Doct. Sci. (Med.), Head, Laboratory of immunomodulators.
105064, Moscow
Russian FederationMarina V. Вritsina
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: britsinamarina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3044-0790
Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.
105064, Moscow
Russian FederationMaria N. Ozeretskovskaya
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: manja33@yandex.ru
Cand. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.
105064, Moscow
Russian FederationNatalia U. Mertsalova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: n.mertzalova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9072-2538
Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.
105064, Moscow
Russian FederationIrina G. Bazhanova
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
Email: ibajanowa@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1404-1498
Cand. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of immunomodulators.
105064, Moscow
Russian FederationReferences
- Субботина К.А., Фельдблюм И.В., Кочергина Е.А., Лехтина Н.А. Эпидемиологическое обоснование к изменению стратегии и тактики специфической профилактики коклюша в современных условиях. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2019; 18(2): 27-33. https://doi.org/10.31631/20733046-2019-18-2-27-33
- Di Mattia G., Nicolai A., Frassanito A., Petrarca L., Nenna R., Midulla F. Pertussis: New preventive strategies for an old dis-ease. Paediatr. Respir. Rev. 2019; 29: 68-73. https://doi.org/10.1016/j.prrv.2018.03.011
- Cattelan N., Dubey P., Arnal L., Yantorno O.M., Deora R. Bordetella biofilms: a lifestyle leading to persistent infections. Pathog. Dis. 2016; 74(1): ftv108. https://doi.org/10.1093/femspd/ftv108
- Бехало В.А., Бондаренко В.М., Сысолятина Е.В., Нагурская Е.В. Иммунологические особенности бактериальных клеток медицинских биопленок. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; (4): 97-105.
- Del Pozo J.L. Biofilm-related disease. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2018; 16(1): 51-65. https://doi.org/10.1080/14787210.2018.1417036.
- Чеботарь И.В. Механизмы антибиопленочного иммунитета. Вестник Российской академии медицинских наук. 2012: 67(12): 22-9.
- Chung P.Y., Khanum R. Antimicrobial peptides as potential anti-biofilm agents against multidrug-resistant bacteria. J. Microbiol. Immunol. Infect. 2017; 50(4): 405-10. https://doi.org/10.1016/jjmii.2016.12.005
- Pletzer D., Coleman S.R., Hancock R.E Antibiofilm peptides as a new weapon in antimicrobial warfare. Curr. Opin. Microbiol. 2016; 33: 35-40. https://doi.org/10.1016/j.mib.2016.05.016
- МУК 4.2.2317-08. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. М.; 2009.
- Зайцев Е.М., Брицина М.В., Озерецковская М.Н., Мерцалова Н.У, Бажанова И.Г. Культивирование биопленок Bordetella pertussis на абиотическом субстрате. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; (1): 49-53. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-49-53.
- Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград; 1962.
- Serra D.O., Conover M.S., Arnal L., Sloan G.P., Rodrigu¬ez M.E., Yantorno O.M., et al. FHA-mediated cell-substrate and cell-cell adhesions are critical for Bordetella pertussis biofilm formation on abiotic surfaces and in the mouse nose and the trachea. PLoS One. 2011; 6(12): e28811. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028811
Supplementary files
