Regulation of the microecological state of the lower parts of the female reproductive tract with vitamins

Full Text

Введение

Вагинальный биоценоз является эволюционно сложившейся симбиотической системой [1], основанной на взаимодействии двух основных компонентов: клеток макроорганизма и микро­флоры, и находится под постоянным воздействием различных регуляторных факторов. По-видимо­му, залогом целостности этого биоценоза являет­ся возможность согласованного ответа на один и тот же регуляторный фактор клеток и хозяина, и микросимбионтов. Примером служит реакция ва­гинального биоценоза на изменение уровня про- воспалительных цитокинов, высокие уровни ко­торых одновременно с запуском воспалительной реакции тормозят рост популяции лактобацилл, обеспечивая их выживаемость [2]. Половые сте­роидные гормоны также способны регулировать оба компонента вагинального биоценоза [3]. Под их влиянием изменяются функциональное состоя­ние клеток хозяина (иммунных и эпителиальных) и биологические свойства (рост и персистентные характеристики) микросимбионтов.

Витамины — важный регуляторный фактор роста, дифференцировки и функционирования клеток макроорганизма [4], вероятно, тоже долж­ны оказывать влияние на все компоненты ваги­нального биоценоза, тем более что существуют данные, полученные в условиях in vitro, о влиянии некоторых витаминов на рост микроорганизмов [5]. С другой стороны, особенностью вагиналь­ного биоценоза является преобладание в нем лак­тобацилл, продуцирующих пероксид водорода [1, 6], избыток которого угрожает как выживаемости самих лактобацилл, так и целостности клеток ма­кроорганизма. Это делает актуальным вопрос о влиянии на состояние вагинального биоценоза ви­таминов антиоксидантного комплекса, способных предотвращать повреждающее действие активных форм кислорода.

Цель данного исследования — изучение изме­нений микроэкологического состояния влагалища под влиянием препаратов аскорбиновой кислоты (АК), α-токоферола и ретинола ацетата (РА).

Для достижения этой цели мы изучили особен­ности микроэкологического состояния влагалища при дефиците этих витаминов и динамику состоя­ния микробиоценоза и мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта при интравагинальном возмещении дефицита этих витаминов.

Материалы и методы

Открытое нерандомизированное наблюда­тельное исследование было одобрено Экспертной комиссией ФГБОУ ВО «ОрГМУ» и выполнялось в соответствии со стандартами надлежащей клиниче­ской практики и принципами Хельсинкской декла­рации.

В исследовании участвовали 120 женщин фер­тильного возраста, из которых были сформирова­ны три группы с дефицитом витаминов А (n = 35), С (n = 35) и Е (n = 35) и контрольная группа с нор­мальным содержанием витаминов (n = 15). Концен­трации РА и α-токоферола определяли в сыворотке крови спектрофлюориметрически [7, 8] с исполь­зованием «Флюорат-02-АБЛФ», концентрацию АК определяли в моче методом титрования 2,6-дихлор- фенолиндофенолятом натрия [9].

Критериями невключения служили:

• наличие соматической патологии, в том чис­ле суб- или декомпенсированной;
• наличие инфекций, передаваемых половым путем;
• беременность и лактация;
• нарушение менструального цикла;
• приверженность к интравагинальным гигие­ническим практикам;
• курение;
• применение гормональных, противомикробных или витаминно-минеральных препара­тов в течение 6 мес, предшествующих вклю­чению в исследование.

Все пациентки исследуемых групп начиная с 7-8-го дня менструального цикла согласно вы­явленному дефициту витаминов в течение 7 дней 1 раз в сутки интравагинально получали препараты:

• «Вагинорм С» («Artisan Pharma») — ваги­нальные таблетки, содержащие аскорбино­вую кислоту 250 мг, по 1 таблетке;
• «Альфа-токоферол ацетат в масле 50%, капсулы по 100 мг» (ООО «Люми»), по 1 капсуле;
• «Ретинола ацетат в масле, капсулы 33000 МЕ» (ООО «Люми»), по 1 капсуле.

Пациентки контрольной группы препаратов витаминов не получали.

Клиническое, микроскопическое, бактериоло­гическое и иммуноферментное исследование про­водили до начала терапии, на 1-е и 8-е сутки после терапии.

Выраженность клинических проявлений оце­нивали при осмотре половых путей в зеркалах. Кислотность среды отделяемого влагалища изучали с помощью тест-полосок с ограниченным диапазо­ном значений рН.

Состояние микрофлоры влагалища оценива­ли с использованием микроскопических критериев Hay-Ison. Значение лейкоцитарно-эпителиального индекса определяли как соотношение числа лейко­цитов к числу клеток эпителия, учтенных в 10-15 полях зрения.

Общее количество условно-патогенных ми­кроорганизмов (УПМ) и лактобацилл определяли после высева вагинальной жидкости на среды СКС и MRS соответственно и культивирования (атмо­сфера с 5% содержанием СО₂, 37^оС, 48 ч). Таксоно­мическую принадлежность бактерий определяли на основе их морфологии, культуральных и биохимических характеристик [10].

Для получения вагинального лаважа омывали стенки влагалища 2 мл стерильного 0,15 М раство­ра NaCl. В лаважи добавляли фенилметилсульфонилфлюорид (конечная концентрация 5 мкМ/мл) для ингибирования протеаз, затем пробы центрифу­гировали (3000g, 15 мин), собирали надосадочную жидкость и хранили ее при -20°С не более 1 мес. Содержание лактоферрина и секреторного имму­ноглобулина А (sIgA), цитокинов IL1β, raIL1, INFγ и TGFβ1 определяли с помощью иммуноферментного анализа согласно инструкции производителя с использованием наборов ООО «Цитокин», «Cloud-Clone Corp.» и «BD Biosciences».

Данные исследования представлены в виде средних значений показателей и стандартных от­клонений. Достоверность различий в показателях между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, уровень значимости p принимали равным 0,05.

Результаты

Содержание витаминов А и Е в сыворотке крови у пациенток исследуемых групп характе­ризовалось более чем двукратным снижением их концентрации по сравнению с нормой и состави­ло соответственно для РА 0,1 ± 0,03 мг/мл (норма >0,3 мг/мл), α-токоферола—4,0 ± 1,15 мкг/мл (норма >7 мкг/мл). Экскреция АК с мочой у пациенток с дефицитом витамина С также была значительно снижена: 0,19 ± 0,03 мг/ч при норме >0,7 мг/ч.

Сниженное содержание в организме женщин витаминов А, Е и С сопровождалось высокой ча­стотой (71,4-80,0%) встречаемости дефицита ва­гинальных лактобацилл. Особенностью гипови­таминоза РА и АК являлась высокая частота бак­териального вагиноза — у каждой 5-й пациентки. Напротив, при дефиците α-токоферола случаев бактериального вагиноза не зафиксировано, зато в 25,7% случаев были выделены грибы рода Candida в обсемененности выше 3 Ig KOE/мл.

Выраженность дисбиотических изменений в вагинальном биотопе прямо зависела от тяжести гиповитаминоза. Например, у пациенток с выра­женным дефицитом витамина Е вагинальный дисбиоз был зафиксирован в 80% случаев, у лиц с уме­ренным гиповитаминозом — в 28,6%, тогда как в контрольной группе — только в 13,3%.

На следующем этапе нашего исследования мы оценивали особенности мукозального иммунитета влагалища у женщин, страдающих дефицитом ви­таминов. Учитывая, что видовой спектр микроорга­низмов может оказывать влияние на напряженность мукозального иммунитета [11], мы посчитали не­обходимым оценивать состояние параметров мукозального иммунитета раздельно в подгруппах с дисбиозом и нормоценозом.

Общей закономерностью изменения мукозаль­ного иммунитета для всех видов гиповитаминоза в подгруппах с нормоценозом являлись изменения провоспалительной направленности. Дефицит всех витаминов сопровождался уменьшением концен­трации raIL1 и соотношения raIL1/IL1β (табл. 1). в дополнение к этому дефицит АК сопровождается снижением уровня TGFβ1, т.е. увеличением коэф­фициента IL1β/TGFβ1, что в обоих случаях может свидетельствовать о сохранении провоспалитель- ного потенциала IL1p. Одновременно с этим отме­чено повышение уровня INFy, наблюдаемое при не­достатке жирорастворимых витаминов А и Е.

Закономерности изменения мукозального им­мунитета для всех видов гиповитаминоза в подгруп­пах с дисбиозом в большинстве случаев имели тот же характер, но были более выраженны (табл. 1).

 

Таким образом, мы выявили связь дефицита α-токоферола, РА и АК с нарушениями микроэкологического состояния вагинального биотопа. Для подтверждения этой связи нами был исследован эф­фект интравагинального применения витаминных препаратов, согласно выявленному дефициту, на состояние микробиоценоза и мукозального имму­нитета нижних отделов женского репродуктивного тракта. На момент завершения терапии (8-е сутки исследования) подтверждено нормализующее влия­ние всех исследуемых витаминов на состояние лак­тофлоры влагалища (рисунок).

 

 

Так, мы наблюдали достоверное увеличение количества лактобацилл в результате терапии α-токоферолом у 80% пациенток, РА — у 74,3% и АК — у 51,4%. Численность лактобацилл под влиянием α-токоферола возросла в 80 раз, РА — в 25 и АК — в 10.

На 8-е сутки после завершения терапии в груп­пах пациенток, получавших препараты витаминов А и Е, прирост численности лактобацилл продол­жался, тогда как в случае с АК мы наблюдали сни­жение численности лактобацилл (рисунок, а).

Таким образом, выраженность влияния интра- вагинального применения витаминных препаратов на лактофлору уменьшалась в ряду α-токоферол → РА → АК.

В отношении влияния витаминов на числен­ность УПМ единой тенденции не наблюдалось. Так, интравагинальное применение АК к моменту завер­шения терапии в 80% случаев уменьшало числен­ность УПМ в среднем в 31 раз, однако через 1 нед после завершения терапии численность УПМ вновь возрастала до исходного уровня (рисунок, б).

После применения витамина Е происходило менее выраженное снижение показателя микробной обсемененности УПМ, однако оно продолжалось и через неделю после завершения терапии.

Использование РА приводило к противополож­ному эффекту: численность УПМ по сравнению с исходной к концу терапии возрастала в 10 раз, через 1 нед после завершения терапии — в 25 раз (рису­нок, б).

На фоне увеличения численности УПМ при применении РА мы наблюдали возрастание в 3 раза лейкоцитарно-эпителиального индекса, тогда как на фоне применения АК и токоферола ацетата он значимо не менялся.

Интравагинальное применение витаминных препаратов оказывало разнонаправленное влияние на состояние мукозального иммунитета (табл. 2). Так, применение АК способствовало усилению изменений провоспалительной направленности (уменьшение отношения raIL1/IL1β, увеличение коэффициента IL1β/TGFβ1 и концентрации INFγ) на фоне снижения уровня лактоферрина и sIgA (табл. 2). Применение α-токоферола и РА, напротив, вызывало изменения параметров мукозального им­мунитета противовоспалительной направленности: увеличение отношения raIL1/IL1β и концентрации TGFβ1, уменьшение коэффициента IL1β/TGFβ1 и концентрации INFγ и IL1β (табл. 2). Несмотря на общие тенденции, применение α-токоферола по­зволило добиться значений показателей параметров мукозального иммунитета, значительно более близ­ких к показателям группы контроля, чем примене­ние РА (табл. 2).

 

Обсуждение

Несмотря на то что α-токоферол, РА и АК по физико-химическим характеристикам относятся к группе антиоксидантов [12] и при их дефиците наблюдаются схожие изменения, их влияние на ва­гинальный биоценоз имеет свои индивидуальные, зачастую разнонаправленные особенности. Так, наиболее выраженным эффектом в период приме­нения обладала АК: она стимулировала прирост численности лактобацилл, выраженно угнетала УПМ, но при этом вызывала изменения параме­тров мукозального иммунитета провоспалительной направленности. Стимуляция лактобацилл и угнетение УПМ АК связаны не только с эффектом снижения рН вагинального содержимого, который уже используется в клинической практике [13]. Ранее было показано, что АК способна усиливать продукцию пероксида водорода лактобациллами [14], что является дополнительным фактором уг­нетения УПМ. Одновременно с этим за счет своих антиоксидантных свойств АК способна защитить лактобациллы от увеличившегося количества про­дуцируемых ими активных форм кислорода. Не­продолжительность положительного эффекта АК в отношении микробиоценоза, по-видимому, связана с ее способностью усиливать провоспалительные компоненты мукозального иммунитета [15]. Высо­кий уровень провоспалительных цитокинов оказы­вает стимулирующее действие на рост УПМ и пода­вляющее — на вагинальные лактобациллы [2].

α-Токоферол оказывал менее выраженное, но зато более продолжительное влияние на вагиналь­ный биоценоз: умеренно стимулировал прирост численности лактобацилл и снижал численность УПМ, при этом вызывая изменения параметров му­козального иммунитета противовоспалительной на­правленности. Менее выраженное, чем у АК, влия­ние на микрофлору связано с отсутствием возмож­ности изменять рН и обусловлено, вероятно, только его антиоксидантной активностью. Длительный эффект α-токоферола, по-видимому, обусловлен его противовоспалительным эффектом. Такие условия способствуют увеличению численности лактоба­цилл и снижению — УПМ.

РА оказывал неоднозначное влияние на ваги­нальный биоценоз: в период применения стимули­ровал прирост численности и лактобацилл, и УПМ, при этом вызывая изменения параметров мукозаль­ного иммунитета противовоспалительной направ­ленности. Мы полагаем, что прирост численности лактобацилл и УПМ связан с прямым влиянием РА на созревание вагинального эпителия [16], что уве­личивало доступность питательных веществ для всех типов микросимбионтов. Наблюдаемое через 1 нед после терапии снижение численности УПМ связано, на наш взгляд, с антагонистической актив­ностью восстановившейся популяции лактобацилл.

Таким образом, полученные в этом исследо­вании данные о влиянии на микроэкологическое состояние влагалища АК, РА и α-токоферола позво­ляют рассматривать эти витамины в качестве регу­ляторных факторов как для клеток хозяина, так и для микросимбионтов.

Выводы

Выявлена связь дефицита α-токоферола, РА и АК с дефицитом лактофлоры, высокой частотой бактериального вагиноза и кандидоза, а также из­менениями параметров мукозального иммунитета провоспалительной направленности.

Применение препаратов витаминов А, Е и С интравагинально у женщин с их дефицитом оказы­вало нормализующее влияние на состояние лакто­флоры влагалища, выраженность которого умень­шалась в ряду α-токоферол → РА → АК.

Влияние на УПМ имело особенности: витамин А вызывал повышение, а витамины С и Е — сни­жение численности УПМ, при этом эффект вита­мина С был выраженным, но кратковременным, а витамина Е — менее выраженным, но длительным. Применение витаминов разнонаправленно влияло на состояние мукозального иммунитета: АК способствовала усилению изменений провоспалительной направленности, α-токоферол и РА — напро­тив, вызывали изменения противовоспалительной направленности.

About the authors

Olga A. Strokova

Orenburg State Medical University

Email: oastrokova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2088-1426
Assistant, Department of obstetrics and gynecology Russian Federation

Elena A. Kremleva

Orenburg State Medical University;
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Brahch of the Russian Academy of Sciences

Email: kremlena1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1916-784X

D. Sci. (Med.), leading researcher, Laboratory for the study of the mechanisms of formation microbiocenoses of humans

Prof., Department of obstetrics and gynecology

Russian Federation

Olga D. Konstantinova

Orenburg State Medical University

Email: const55@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0369-0281
D. Sci. (Med.), Prof., Head, Department of obstetrics and gynecology Russian Federation

Andrey V. Sgibnev

Orenburg State Medical University;
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Brahch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sgibnew72@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1866-1678

D. Sci. (Biol.), Assoc. Prof., Head, Laboratory for the study of the mechanisms of formation microbiocenoses of humans

Prof., Department of chemistry

Russian Federation

References

Supplementary files