Регуляция микроэкологического состояния нижних отделов женского репродуктивного тракта витаминами

Полный текст

Введение

Вагинальный биоценоз является эволюционно сложившейся симбиотической системой [1], основанной на взаимодействии двух основных компонентов: клеток макроорганизма и микро­флоры, и находится под постоянным воздействием различных регуляторных факторов. По-видимо­му, залогом целостности этого биоценоза являет­ся возможность согласованного ответа на один и тот же регуляторный фактор клеток и хозяина, и микросимбионтов. Примером служит реакция ва­гинального биоценоза на изменение уровня про- воспалительных цитокинов, высокие уровни ко­торых одновременно с запуском воспалительной реакции тормозят рост популяции лактобацилл, обеспечивая их выживаемость [2]. Половые сте­роидные гормоны также способны регулировать оба компонента вагинального биоценоза [3]. Под их влиянием изменяются функциональное состоя­ние клеток хозяина (иммунных и эпителиальных) и биологические свойства (рост и персистентные характеристики) микросимбионтов.

Витамины — важный регуляторный фактор роста, дифференцировки и функционирования клеток макроорганизма [4], вероятно, тоже долж­ны оказывать влияние на все компоненты ваги­нального биоценоза, тем более что существуют данные, полученные в условиях in vitro, о влиянии некоторых витаминов на рост микроорганизмов [5]. С другой стороны, особенностью вагиналь­ного биоценоза является преобладание в нем лак­тобацилл, продуцирующих пероксид водорода [1, 6], избыток которого угрожает как выживаемости самих лактобацилл, так и целостности клеток ма­кроорганизма. Это делает актуальным вопрос о влиянии на состояние вагинального биоценоза ви­таминов антиоксидантного комплекса, способных предотвращать повреждающее действие активных форм кислорода.

Цель данного исследования — изучение изме­нений микроэкологического состояния влагалища под влиянием препаратов аскорбиновой кислоты (АК), α-токоферола и ретинола ацетата (РА).

Для достижения этой цели мы изучили особен­ности микроэкологического состояния влагалища при дефиците этих витаминов и динамику состоя­ния микробиоценоза и мукозального иммунитета нижних отделов женского репродуктивного тракта при интравагинальном возмещении дефицита этих витаминов.

Материалы и методы

Открытое нерандомизированное наблюда­тельное исследование было одобрено Экспертной комиссией ФГБОУ ВО «ОрГМУ» и выполнялось в соответствии со стандартами надлежащей клиниче­ской практики и принципами Хельсинкской декла­рации.

В исследовании участвовали 120 женщин фер­тильного возраста, из которых были сформирова­ны три группы с дефицитом витаминов А (n = 35), С (n = 35) и Е (n = 35) и контрольная группа с нор­мальным содержанием витаминов (n = 15). Концен­трации РА и α-токоферола определяли в сыворотке крови спектрофлюориметрически [7, 8] с исполь­зованием «Флюорат-02-АБЛФ», концентрацию АК определяли в моче методом титрования 2,6-дихлор- фенолиндофенолятом натрия [9].

Критериями невключения служили:

• наличие соматической патологии, в том чис­ле суб- или декомпенсированной;
• наличие инфекций, передаваемых половым путем;
• беременность и лактация;
• нарушение менструального цикла;
• приверженность к интравагинальным гигие­ническим практикам;
• курение;
• применение гормональных, противомикробных или витаминно-минеральных препара­тов в течение 6 мес, предшествующих вклю­чению в исследование.

Все пациентки исследуемых групп начиная с 7-8-го дня менструального цикла согласно вы­явленному дефициту витаминов в течение 7 дней 1 раз в сутки интравагинально получали препараты:

• «Вагинорм С» («Artisan Pharma») — ваги­нальные таблетки, содержащие аскорбино­вую кислоту 250 мг, по 1 таблетке;
• «Альфа-токоферол ацетат в масле 50%, капсулы по 100 мг» (ООО «Люми»), по 1 капсуле;
• «Ретинола ацетат в масле, капсулы 33000 МЕ» (ООО «Люми»), по 1 капсуле.

Пациентки контрольной группы препаратов витаминов не получали.

Клиническое, микроскопическое, бактериоло­гическое и иммуноферментное исследование про­водили до начала терапии, на 1-е и 8-е сутки после терапии.

Выраженность клинических проявлений оце­нивали при осмотре половых путей в зеркалах. Кислотность среды отделяемого влагалища изучали с помощью тест-полосок с ограниченным диапазо­ном значений рН.

Состояние микрофлоры влагалища оценива­ли с использованием микроскопических критериев Hay-Ison. Значение лейкоцитарно-эпителиального индекса определяли как соотношение числа лейко­цитов к числу клеток эпителия, учтенных в 10-15 полях зрения.

Общее количество условно-патогенных ми­кроорганизмов (УПМ) и лактобацилл определяли после высева вагинальной жидкости на среды СКС и MRS соответственно и культивирования (атмо­сфера с 5% содержанием СО₂, 37^оС, 48 ч). Таксоно­мическую принадлежность бактерий определяли на основе их морфологии, культуральных и биохимических характеристик [10].

Для получения вагинального лаважа омывали стенки влагалища 2 мл стерильного 0,15 М раство­ра NaCl. В лаважи добавляли фенилметилсульфонилфлюорид (конечная концентрация 5 мкМ/мл) для ингибирования протеаз, затем пробы центрифу­гировали (3000g, 15 мин), собирали надосадочную жидкость и хранили ее при -20°С не более 1 мес. Содержание лактоферрина и секреторного имму­ноглобулина А (sIgA), цитокинов IL1β, raIL1, INFγ и TGFβ1 определяли с помощью иммуноферментного анализа согласно инструкции производителя с использованием наборов ООО «Цитокин», «Cloud-Clone Corp.» и «BD Biosciences».

Данные исследования представлены в виде средних значений показателей и стандартных от­клонений. Достоверность различий в показателях между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, уровень значимости p принимали равным 0,05.

Результаты

Содержание витаминов А и Е в сыворотке крови у пациенток исследуемых групп характе­ризовалось более чем двукратным снижением их концентрации по сравнению с нормой и состави­ло соответственно для РА 0,1 ± 0,03 мг/мл (норма >0,3 мг/мл), α-токоферола—4,0 ± 1,15 мкг/мл (норма >7 мкг/мл). Экскреция АК с мочой у пациенток с дефицитом витамина С также была значительно снижена: 0,19 ± 0,03 мг/ч при норме >0,7 мг/ч.

Сниженное содержание в организме женщин витаминов А, Е и С сопровождалось высокой ча­стотой (71,4-80,0%) встречаемости дефицита ва­гинальных лактобацилл. Особенностью гипови­таминоза РА и АК являлась высокая частота бак­териального вагиноза — у каждой 5-й пациентки. Напротив, при дефиците α-токоферола случаев бактериального вагиноза не зафиксировано, зато в 25,7% случаев были выделены грибы рода Candida в обсемененности выше 3 Ig KOE/мл.

Выраженность дисбиотических изменений в вагинальном биотопе прямо зависела от тяжести гиповитаминоза. Например, у пациенток с выра­женным дефицитом витамина Е вагинальный дисбиоз был зафиксирован в 80% случаев, у лиц с уме­ренным гиповитаминозом — в 28,6%, тогда как в контрольной группе — только в 13,3%.

На следующем этапе нашего исследования мы оценивали особенности мукозального иммунитета влагалища у женщин, страдающих дефицитом ви­таминов. Учитывая, что видовой спектр микроорга­низмов может оказывать влияние на напряженность мукозального иммунитета [11], мы посчитали не­обходимым оценивать состояние параметров мукозального иммунитета раздельно в подгруппах с дисбиозом и нормоценозом.

Общей закономерностью изменения мукозаль­ного иммунитета для всех видов гиповитаминоза в подгруппах с нормоценозом являлись изменения провоспалительной направленности. Дефицит всех витаминов сопровождался уменьшением концен­трации raIL1 и соотношения raIL1/IL1β (табл. 1). в дополнение к этому дефицит АК сопровождается снижением уровня TGFβ1, т.е. увеличением коэф­фициента IL1β/TGFβ1, что в обоих случаях может свидетельствовать о сохранении провоспалитель- ного потенциала IL1p. Одновременно с этим отме­чено повышение уровня INFy, наблюдаемое при не­достатке жирорастворимых витаминов А и Е.

Закономерности изменения мукозального им­мунитета для всех видов гиповитаминоза в подгруп­пах с дисбиозом в большинстве случаев имели тот же характер, но были более выраженны (табл. 1).

 

Таким образом, мы выявили связь дефицита α-токоферола, РА и АК с нарушениями микроэкологического состояния вагинального биотопа. Для подтверждения этой связи нами был исследован эф­фект интравагинального применения витаминных препаратов, согласно выявленному дефициту, на состояние микробиоценоза и мукозального имму­нитета нижних отделов женского репродуктивного тракта. На момент завершения терапии (8-е сутки исследования) подтверждено нормализующее влия­ние всех исследуемых витаминов на состояние лак­тофлоры влагалища (рисунок).

 

 

Так, мы наблюдали достоверное увеличение количества лактобацилл в результате терапии α-токоферолом у 80% пациенток, РА — у 74,3% и АК — у 51,4%. Численность лактобацилл под влиянием α-токоферола возросла в 80 раз, РА — в 25 и АК — в 10.

На 8-е сутки после завершения терапии в груп­пах пациенток, получавших препараты витаминов А и Е, прирост численности лактобацилл продол­жался, тогда как в случае с АК мы наблюдали сни­жение численности лактобацилл (рисунок, а).

Таким образом, выраженность влияния интра- вагинального применения витаминных препаратов на лактофлору уменьшалась в ряду α-токоферол → РА → АК.

В отношении влияния витаминов на числен­ность УПМ единой тенденции не наблюдалось. Так, интравагинальное применение АК к моменту завер­шения терапии в 80% случаев уменьшало числен­ность УПМ в среднем в 31 раз, однако через 1 нед после завершения терапии численность УПМ вновь возрастала до исходного уровня (рисунок, б).

После применения витамина Е происходило менее выраженное снижение показателя микробной обсемененности УПМ, однако оно продолжалось и через неделю после завершения терапии.

Использование РА приводило к противополож­ному эффекту: численность УПМ по сравнению с исходной к концу терапии возрастала в 10 раз, через 1 нед после завершения терапии — в 25 раз (рису­нок, б).

На фоне увеличения численности УПМ при применении РА мы наблюдали возрастание в 3 раза лейкоцитарно-эпителиального индекса, тогда как на фоне применения АК и токоферола ацетата он значимо не менялся.

Интравагинальное применение витаминных препаратов оказывало разнонаправленное влияние на состояние мукозального иммунитета (табл. 2). Так, применение АК способствовало усилению изменений провоспалительной направленности (уменьшение отношения raIL1/IL1β, увеличение коэффициента IL1β/TGFβ1 и концентрации INFγ) на фоне снижения уровня лактоферрина и sIgA (табл. 2). Применение α-токоферола и РА, напротив, вызывало изменения параметров мукозального им­мунитета противовоспалительной направленности: увеличение отношения raIL1/IL1β и концентрации TGFβ1, уменьшение коэффициента IL1β/TGFβ1 и концентрации INFγ и IL1β (табл. 2). Несмотря на общие тенденции, применение α-токоферола по­зволило добиться значений показателей параметров мукозального иммунитета, значительно более близ­ких к показателям группы контроля, чем примене­ние РА (табл. 2).

 

Обсуждение

Несмотря на то что α-токоферол, РА и АК по физико-химическим характеристикам относятся к группе антиоксидантов [12] и при их дефиците наблюдаются схожие изменения, их влияние на ва­гинальный биоценоз имеет свои индивидуальные, зачастую разнонаправленные особенности. Так, наиболее выраженным эффектом в период приме­нения обладала АК: она стимулировала прирост численности лактобацилл, выраженно угнетала УПМ, но при этом вызывала изменения параме­тров мукозального иммунитета провоспалительной направленности. Стимуляция лактобацилл и угнетение УПМ АК связаны не только с эффектом снижения рН вагинального содержимого, который уже используется в клинической практике [13]. Ранее было показано, что АК способна усиливать продукцию пероксида водорода лактобациллами [14], что является дополнительным фактором уг­нетения УПМ. Одновременно с этим за счет своих антиоксидантных свойств АК способна защитить лактобациллы от увеличившегося количества про­дуцируемых ими активных форм кислорода. Не­продолжительность положительного эффекта АК в отношении микробиоценоза, по-видимому, связана с ее способностью усиливать провоспалительные компоненты мукозального иммунитета [15]. Высо­кий уровень провоспалительных цитокинов оказы­вает стимулирующее действие на рост УПМ и пода­вляющее — на вагинальные лактобациллы [2].

α-Токоферол оказывал менее выраженное, но зато более продолжительное влияние на вагиналь­ный биоценоз: умеренно стимулировал прирост численности лактобацилл и снижал численность УПМ, при этом вызывая изменения параметров му­козального иммунитета противовоспалительной на­правленности. Менее выраженное, чем у АК, влия­ние на микрофлору связано с отсутствием возмож­ности изменять рН и обусловлено, вероятно, только его антиоксидантной активностью. Длительный эффект α-токоферола, по-видимому, обусловлен его противовоспалительным эффектом. Такие условия способствуют увеличению численности лактоба­цилл и снижению — УПМ.

РА оказывал неоднозначное влияние на ваги­нальный биоценоз: в период применения стимули­ровал прирост численности и лактобацилл, и УПМ, при этом вызывая изменения параметров мукозаль­ного иммунитета противовоспалительной направ­ленности. Мы полагаем, что прирост численности лактобацилл и УПМ связан с прямым влиянием РА на созревание вагинального эпителия [16], что уве­личивало доступность питательных веществ для всех типов микросимбионтов. Наблюдаемое через 1 нед после терапии снижение численности УПМ связано, на наш взгляд, с антагонистической актив­ностью восстановившейся популяции лактобацилл.

Таким образом, полученные в этом исследо­вании данные о влиянии на микроэкологическое состояние влагалища АК, РА и α-токоферола позво­ляют рассматривать эти витамины в качестве регу­ляторных факторов как для клеток хозяина, так и для микросимбионтов.

Выводы

Выявлена связь дефицита α-токоферола, РА и АК с дефицитом лактофлоры, высокой частотой бактериального вагиноза и кандидоза, а также из­менениями параметров мукозального иммунитета провоспалительной направленности.

Применение препаратов витаминов А, Е и С интравагинально у женщин с их дефицитом оказы­вало нормализующее влияние на состояние лакто­флоры влагалища, выраженность которого умень­шалась в ряду α-токоферол → РА → АК.

Влияние на УПМ имело особенности: витамин А вызывал повышение, а витамины С и Е — сни­жение численности УПМ, при этом эффект вита­мина С был выраженным, но кратковременным, а витамина Е — менее выраженным, но длительным. Применение витаминов разнонаправленно влияло на состояние мукозального иммунитета: АК способствовала усилению изменений провоспалительной направленности, α-токоферол и РА — напро­тив, вызывали изменения противовоспалительной направленности.

Об авторах

Ольга Александровна Строкова

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет»

Email: oastrokova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2088-1426
ассистент каф. акушерства и гинекологии Россия

Елена Александровна Кремлёва

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет»;
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Email: kremlena1@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1916-784X

д.м.н., в.н.с. лаб. по изучению механизмов формирования микробиоценозов человека 

проф. каф. акушерства и гинекологии 

Россия

Ольга Дмитриевна Константинова

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет»

Email: const55@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0369-0281
д.м.н., проф., зав. каф. акушерства и гинекологии Россия

Андрей Викторович Сгибнев

ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет»;
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: sgibnew72@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1866-1678

д.б.н., зав. лаб. по изучению механизмов формирования микробиоценозов человека 

проф. каф. химии 

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы