Email this article About the Results of Monitoring Researches of Ballast Waters and Data of Identification of the Vibrioes Strains Selected During the Ships Researches in Russian Seaports in 2018
- Authors: Vodyanitskаyа S.Y.1, Sergienko O.V.1, Ivanova N.G.1, Balachnova V.V.1, Arkhangelskаya I.V.1, Rengach M.V.1, Nepomnyashchaya N.B.1, Volovikova S.V.1
-
Affiliations:
- Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
- Issue: Vol 97, No 1 (2020)
- Pages: 55-61
- Section: ORIGINAL RESEARCHES
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/529
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-1-55-61
- ID: 529
Cite item
Full Text
Abstract
Relevance. In September, 2017 the International Convention on Control of Ships’ Ballast Waters and sediments, in which the Russian Federation takes part, came into effect.
Aim of article is to cover the results of implementation of the Convention in Russia, regarding selection and analysis of ballast waters tests for compliance with the international standard.
Material and methods. The materials for work were data on ship arrivals at the international seaports of the Russian Federation, provided by sanitary and quarantine departments of the Russian ports, and monitoring researches of ballast waters in seaports of some regions of the Russian Federation. Analytical, bacteriological, molecular methods were applied.
Results. The studies of ballast waters in the Leningrad and Kaliningrad regions have been conducted for the first time in 2018, and in the Rostov region the study lasts since 2010. The laboratory researches of ships’ ballast showed that E. coli, Enterococcus spp. were in norm, V. cholerae O1 and O139 in ballast were absent. 12 of 21 ballast water tests investigated by specialists of the Rostov region laboratories contained V. cholerae non-O1/non-O139, ballast was taken on the ships which arrived from Romania and Turkey.
Сonclusion. The results of the molecular and genetic researches suggest that there is a probability of V. сholeraе introduction brougth with ship ballast. Management decisions are demanded to ensure biological safety of shipping and to decrease intestinal infections incidence in residents of the seaside cities.
Full Text
Актуальность
В сентябре 2017 г. в Российской Федерации вступила в силу Международная конвенция о контроле судовых балластных вод и осадков и управлении ими от 2004 г. (далее — Конвенция). На сегодняшний день Конвенцию ратифицировало 81 государство с общей долей мирового тоннажа 80,76%, которые уже предъявляют требования к судам, заходящим в их порты, для предотвращения переноса опасных морских организмов и патогенов.
О значимости балластных вод (БВ) в интродукции возбудителя холеры на свободные территории и целесообразности их исследования на наличие V. cholerae свидетельствует выделение V cholerae 01 в 1991, 1992 гг. из проб, отобранных в трюмах судов, пришвартованных в портах Мексиканского залива в США [1]. В порту Кайо Аркас (Мексика) выявлена контаминация проб балласта судов не только холерными вибрионами, но и ассоциированными с болезнями кораллов Serratia marcescens и Sphingomonas spp. [2]. На территории Южной Америки, в том числе Бразилии, токсигенные холерные вибрионы изолированы в балластных водах судов и в местах их стоянки [3]. При микробиологическом исследовании балластных танков, проведенном F.C. Dobbs и соавт., установлено содержание в отобранных пробах V cholerae О1 и О139, в геноме которых присутствует ген одного из основных факторов патогенности — токсин корегулируемых пилей адгезии [4].
В Российской Федерации в настоящее время действующим нормативным документом является «Руководство по применению требований Международной конвенции о контроле судовых балластных вод и осадков и управлении ими 2004 года», разработанное Российским морским регистром судоходства 20.03.2017 г., НД № 2-030101-0301.
Для реализации положений Конвенции в российских портах должен быть организован отбор и анализ проб БВ, которые будут проводиться по решению портовых властей, без вынужденной задержки судов (ст. 9 Конвенции). В портах и на терминалах, где производятся очистка или ремонт балластных танков, будут предоставляться достаточные сооружения приема судовых балластных осадков (ст. 5 Конвенции). Суда должны выполнять требования Конвенции в части правил замены БВ, а после 2016 г. сбрасываемые БВ должны отвечать установленному стандарту качества (правило В-3 Конвенции), в который включены следующие индикаторные микробы, сброс которых не должен превышать установленных концентраций: токсигенный вибрион холеры (О1 и О139) с менее чем 1 колониеобразующей единицей (КОЕ) на 100 мл или менее 1 КОЕ на 1 г (сырого веса) образцов зоопланктона; кишечная палочка — менее 250 КОЕ на 100 мл, кишечные энтерококки — менее 100 КОЕ на 100 мл.
Для проверки балласта на соответствие данному стандарту необходимо проводить его отбор и исследование. На судах отбор проб БВ может проводиться следующими способами: отбор проб через специальные люки (лазы) или лючки балластных емкостей, отбор проб через смотровые крышки балластных емкостей, отбор проб через замерные отверстия балластных цистерн или воздушные трубы, отбор проб при сбрасывании БВ [5, 6]. Решение об использовании какого-либо способа отбора проб воды принимается в присутствии члена экипажа, ответственного за контроль БВ на судне, который указывает специалисту Роспотребнадзора место отбора в зависимости от конкретных условий и конструктивных особенностей судна.
Для выполнения правила В-3 Конвенции в 2018 г. проводились исследования балласта, взятого с судов, заходивших в порты трех субъектов Российской Федерации. Результаты этих исследований представлены в данной статье.
Цель работы — анализ результатов мониторинговых исследований БВ и данных идентификации штаммов вибрионов, выделенных в ходе исследований судов в российских морских портах в 2018 г., для последующего принятия управленческих решений по обеспечению биологической безопасности морских перевозок и снижению заболеваемости острыми кишечными инфекциями (ОКИ) жителей приморских городов.
Материал и методы
Материалами для работы служили отчетные данные санитарно-карантинных пунктов управлений Роспотребнадзора по Ленинградской, Калининградской, Астраханской, Архангельской, Мурманской областям, Республике Дагестан, Приморскому краю.
С целью выявления заходов судов в эндемичные по холере страны и подсчета возможного объема балласта, ввозимого и сбрасываемого в порты Российской Федерации, проводили анализ судозаходов для установления риска заноса холерных вибрионов в акватории российских морских международных портов (ММП) по следующим показателям: общее число судозаходов за 2015-2017 гг.. принадлежность судна к стране, порты захода судов, водоизмещение судна и др.
Материалами для бактериологического исследования на соответствие международному стандарту БВ (E. coli, Enterococcus spp., V cholerae Ol и O139) служили 68 проб БВ 31 судна, прибывшего из 14 стран различных регионов: Южной Америки (Уругвай), Европы (Великобритания, Германия, Греция, Италия, Латвия, Нидерланды, Польша, Румыния, Финляндия, Франция, Швеция, Эстония), Юго-Западной Азии (Турция). «Пилотными» территориями, имеющими ММП для внедрения положений Конвенции, служили Калининградская, Ленинградская и Ростовская области. Исследования выполняли специалисты аккредитованных испытательных лабораторных центров указанных «пилотных» территорий: в Ленинградской области (46 проб), Ростовской области (21 проба), Калининградской области (1 проба) в соответствии с нормативными документами, регламентирующими объем и методы лабораторных исследований и их оценку на наличие V cholerae O1 и O139 [7], E. coli, Enterococcus spp. [8].
Выделенные специалистами испытательных лабораторных центров «пилотных» территорий штаммы V. cholerae non-O1/non-O139 (n = 12) изучали в лаборатории микробиологии холеры Ростовского-на-Дону противочумного института бактериологическим, серологическим и молекулярно-генетическим методами.
Результаты
При анализе судозаходов в порты Ленинградской, Калининградской, Астраханской, Архангельской, Мурманской областей, Республики Дагестан, Приморского края установлено, что число заходящих иностранных судов преобладает над числом российских судов в 3 раза. Среди стран, с которыми осуществляются международные сообщения, выявлены «порты-доноры» холерных вибрионов, где в последнее время регистрировалась холера (Индия, Малайзия, Вьетнам). Суда водоизмещением до 10 тыс. т и 10-30 тыс. т заходят во все порты России. Суда водоизмещением свыше 30 тыс. т заходят только в порты Ленинградской области и Приморского края, грузооборот также высок именно в этих портах (практически в 10 раз выше, чем в других портах), что представляет определенные риски заноса и распространения возбудителей инфекций, передаваемых водным путем, в том числе холеры. Таким образом, «портами-реципиентами» в России являются порты Ленинградской области и Приморского края, но учитывая температурный фактор, влияющий на выживание холерных вибрионов, риск распространения холеры выше в южных и восточных регионах страны.
«Пилотными» территориями России, имеющими ММП для внедрения положений Конвенции, были выбраны Калининградская, Ленинградская и Ростовская области. Исследования в Приморском крае были проведены позже, в 2019 г.
Проведенные лабораторные исследования балласта судов, прибывших в ММП РФ, дали следующие результаты: пробы, исследованные специалистами лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ленинградской области» показали, что E. coli, Enterococcus spp. находятся в пределах нормы, V cholerae O1 и O139 в балласте отсутствовали. В пробах, исследованных специалистами лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калининградской области», E. coli, Enterococcus spp. находились в пределах нормы, V cholerae O1 и O139 не обнаружены. Из 21 пробы, исследованной специалистами лабораторий Ростовской области, в 12 пробах БВ находились V. cholerae non-O1/ non-O139, балласт был взят на судах, прибывших из Румынии и Турции (Карасу), E. coli и Enterococcus spp. находились в пределах нормы.
В лаборатории микробиологии холеры Ростовского-на-Дону противочумного института изучены биологические свойства 12 штаммов V. cholerae non-O1/non-O139. Установлено, что все культуры V. cholerae non-O1/non-O139 были типичны по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, обладали оксидазной активностью, ферментировали глюкозу в среде Хью-Лейфсона в аэробных и анаэробных условиях с образованием кислоты без газа, сахарозу, маннозу, маннит и не расщепляли арабинозу, инозит, декарбоксилировали лизин и орнитин, но не обладали дигидролазой аргинина, образовывали индол, не продуцировали сероводород. Все штаммы обладали гемолитической активностью и не содержали генов основных факторов патогенности (ctxA и tcpA)
В результате серологического типирования у 10 штаммов V. cholerae non-O1/non-O139 (83,3%) установлена принадлежность к 10 серогруппам, среди которых преобладали О13 (6 штаммов), О76, О2, О16, О60 (по 1 штамму) (табл. 1). Представители О2, О16 и О76 серогрупп ранее были изолированы из проб воды водоемов Ростовской области, вибрионы О13 и О60 серогрупп встречаются на данной территории впервые. Следует отметить, что из водяного балласта судов, прибывших в порты Ростовской области, выделяются нетоксигенные штаммы V. cholerae non-O1/ non-O139, различные по серологическим свойствам, что соответствует данным о циркуляции в водных объектах окружающей среды большого числа клонов холерных вибрионов различных серогрупп. Циркуляция представителей большого количества сменяющих друг друга серогрупп объясняется межпопуляционными взаимодействиями в рамках вида V. cholerae и изменчивостью в процессе длительной персистенции в объектах окружающей среды. Появление штаммов других серогрупп на определенной территории не исключает вероятность новых заносов холерных вибрионов, в том числе с судовым балластом. Это требует разработки управленческих решений по обеспечению биологической безопасности морских перевозок и снижению заболеваемости ОКИ жителей приморских городов.
Таблица 1. Результаты серотипирования штаммов V. cholerae non-O1/non-O139, выделенных из судового балласта
Table 1. Serotyping results of V. cholerae non-O1/non-O139 strains isolated from ship's ballast
№ No. | Название судна, объект Ship, object | Дата выделения Data | № штамма Strain number | Серогруппа Serogroup |
|---|---|---|---|---|
1 | Теплоход «Маэстро Ниязи», балластный танк № 1 Motor ship «Maestro Niyazi», ballast tank No. 1 | 27.07.2018 | 77 | О13 |
2 | Теплоход «Маэстро Ниязи», балластный танк № 2 Motor ship «Maestro Niyazi», ballast tank No. 2 | 27.07.2018 | 78 | О76 |
3 | Теплоход «Генерал Асланов», балластный танк № 1 Motor ship «General Aslanov», ballast tank No. 1 | 02.08.2018 | 85 | О13 |
4 | Теплоход «Генерал Асланов», балластный танк № 2 Motor ship «General Aslanov», ballast tank No. 2 | 02.08.2018 | 86 | О13 |
5 | Теплоход «Карелис-52», балластный танк № 1 Motor ship «Karelis-52», ballast tank No. 1 | 02.08.2018 | 87 | О2 |
6 | Теплоход «Карелис-52», балластный танк № 2 Motor ship «Karelis-52», ballast tank No. 2 | 02.08.2018 | 88 | О13 |
7 | Теплоход «Русич-10», балластный танк № 1 Motor ship «Rusich-10», ballast tank No. 1 | 09.08.2018 | 95 | О13 |
8 | Теплоход «Русич-10», балластный танк № 2 Motor ship «Rusich-10», ballast tank No. 2 | 09.08.2018 | 96 | О13 |
9 | Теплоход «Капитан Иван Викулов», балластный танк № 1 Motor ship «Captain Ivan Vikulov», ballast tank No. 1 | 16.08.2018 | 103 | О16 |
10 | Теплоход «Капитан Иван Викулов», балластный танк № 5 Motor ship «Captain Ivan Vikulov», ballast tank No. 5 | 16.08.2018 | 104 | О60 |
11 | Теплоход «Сормовский 119», балластный танк № 4 Motor ship «Sormovsky 119», ballast tank No. 4 | 06.09.2018 | 127 | Не типировался Not typed |
12 | Теплоход «Сормовский 119», балластный танк № 7 Motor ship «Sormovsky 119», ballast tank No. 7 | 06.09.2018 | 128 | Не типировался Not typed |
На следующем этапе было проведено генотипирование выделенных штаммов по 15 генам факторов патогенности/персистенции. Полученные данные приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты генотипирования нетоксигенных штаммов V cholerae non-O1/non-O139, выделенных из судового балласта
Table 2. Genotyping results of non-toxigenic V. cholerae non-O1/non-O139 strains isolated from marine ballast
Нетоксигенные штаммы V. cholerae non-O1/ non-O139, выделенные из судовых БВ, различались по наличию/отсутствию 2-6 генов. У них не выявлены гены VPI-I; третьей транспортной системы T3SS (vcsN2, vspD). Остальные гены были представлены в различных сочетаниях, у одного штамма выявлен ген структурной единицы маннозочувствительных пилей адгезии mshA. Обнаружение достаточно редко встречаемого в геноме холерных вибрионов гена термостабильного токсина stn у одного штамма может свидетельствовать о возможности его заносного происхождения. С одной стороны, полученные данные о генетической гетерогенности холерных вибрионов non-01/non-0139 серогрупп соответствуют данным как зарубежных, так и отечественных исследователей [9-12]. С другой стороны, наличие большого количества штаммов с разным генотипом свидетельствует о поддержании в целом в водной популяции определенного набора генов факторов патогенности/персистенции. Результаты генотипирования не коррелировали с серогрупповой принадлежностью, штаммы одной серогруппы различались по генотипу. Несмотря на то что водные штаммы содержали минимальный набор генов факторов патогенности/персистенции, проявление патогенных свойств может быть реализовано за счет наличия протеаз (HA/P, коллагеназы) или цитотонического фактора Cef, гены которых присутствовали у всех изученных штаммов.
Заключение
Таким образом, впервые на территории двух субъектов Российской Федерации (Ленинградской и Калининградской области) проведены исследования БВ, в Ростовской области исследования продолжаются с 2010 г. Проведенные лабораторные исследования БВ судов показали, что E. coli, Enterococcus spp. находятся в пределах нормы, V. сЫкте Ol и O139 в БВ отсутствовали.
Из 21 пробы, исследованной специалистами лабораторий Ростовской области, в 12 пробах БВ находились V. cholerae non-O1/non-O139, балласт был взят на судах, прибывших из Румынии и Турции. Результаты микробиологических исследований судовых БВ показали, что холерные вибрионы могут иметь заносную природу, а балластные танки являются искусственным резервуаром патогенных для человека вибрионов, способствующим их распространению из «региона-донора» в «регион-реципиент», что свидетельствует в пользу появления нового объекта при осуществлении эпидемиологического надзора в Российской Федерации — судовых БВ — и требует разработки профилактических (противоэпидемических) мероприятий, направленных на разрыв эффективной передачи патогенного агента водным путем в случае обнаружения V. cholerae O1 и O139, в том числе способов деконтаминации судового балласта.
Современные молекулярно-биологические методы могут применяться для сертификации качества БВ без задержки судна в порту, что предписано положениями Конвенции, и рассматриваться в качестве инструмента доказательной эпидемиологии в установлении источников происхождения и подтверждении факта трансграничного заноса на территорию Российской Федерации патогенных для человека вибрионов в отличие от штаммов вибрионов, выделенных в акваториях российских портов.
About the authors
S. Yu. Vodyanitskаyа
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Author for correspondence.
Email: s_vodyanitskaya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2175-4261
Svetlana Yu. Vodyanitskaya — Cand. Sci. (Med.), Head, Laboratory of sanitary protection of the territory
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationO. V. Sergienko
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: olieshkievich1988@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3883-4652
Olesya V. Sergienko — junior researcher, Laboratory of sanitary protection of the territory
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationN. G. Ivanova
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: natalya.ivanova.49@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-5172-3055
Natalya G. Ivanova — researcher, Laboratory of sanitary protection of the territory
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationV. V. Balachnova
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: balachnovavv@gmail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8832-7419
Veronika V. Balachnova — Cand. Sci. (Med.), senior researcher
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationI. V. Arkhangelskаya
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: irina070769@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2947-4491
Irina V. Arkhangelskaya — researcher, laboratory of microbiology of cholera
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationM. V. Rengach
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: mary.rengatch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4676-0377
Marina V. Rengach — junior researcher, laboratory of microbiology of cholera
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationN. B. Nepomnyashchaya
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: nepomnyshaya_nb@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0003-0868-6791
Natalia B. Nepomnyashсhaya — researcher, laboratory of microbiology of cholera
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationS. V. Volovikova
Rostov-on-Don Anti-Plague Institute
Email: sofya.korotkowa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3064-8177
Sofya V. Volovikova — junior researcher, Laboratory of sanitary protection of the territory
Rostov-on-Don 344002
Russian FederationReferences
- McCarthy S.A., Khambaty F.M. International dissemination of epidemic Vibrio cholerae by cargo ship ballast and other nonpotable waters. Appl. Environ. Microbiol. 1994; 60(7): 2597-601.
- Aguirre-Macedo M.L., Vidal-Martinez V.M., Herrera-Silveira J.A., Valdés-Lozano D.S., Herrera-Rodríguez M., OlveraNovoa M.A. Ballast water as a vector of coral pathogens in the Gulf of Mexico: the case of the Cayo Arcas coral reef. Mar. Pollut. Bull. 2008; 56(9): 1570-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2008.05.022
- Rivera I.N., Souza K.M., Souza C.P., Lopes R.M. Free-living and plankton-associated vibrios: assessment in ballast water, harbor areas, and coastal ecosystems in Brazil. Front. Microbiol. 2013; 3: 443. DOI: http://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00443
- Dobbs F.C., Goodrich A.L., Thomson F.K., Hynes W. Pandemic serotypes of Vibrio cholerae isolated from ships’ ballast tanks and coastal waters: assessment of antibiotic resistance and virulence genes (tcpA and ctxA). Microb. Ecol. 2013; 65(4): 969-74. DOI: http://doi.org/10.1007/s00248-013-0182-7
- Водяницкая С.Ю., Лях О.В. Разработка способов отбора балластной воды на судах смешанного «река-море» плавания для исследования на холеру. Здоровье населения и среда обитания. 2014; (1): 37-40.
- Палилов М.Б., Лях О.В., Водяницкая С.Ю., Баташев В.В., Черный М.А., Решетников В.И. О новых способах отбора проб балластной воды на судах. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: Сборник статей проблемной комиссии (48.04) Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. Выпуск № 31. Саратов: Амирит; 2018: 43-5.
- МУК 4.2.2218-07. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания. М.; 2007.
- МУК 4.2.2959-11. Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения: Методические указания. М.; 2011.
- Hasan N.A., Ceccarelli D., Grim C.J., Taviani E., Choi J., Sadique A., et al. Distribution of virulence genes in clinical and environmental Vibrio cholerae strains in Bangladesh. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(18): 5782-5. DOI: http://doi.org/10.1128/AEM.01113-13
- Octavia S., Salim A., Kurniawan J., Lam C., Leung Q., Ahsan S., et al. Population Structure and evolution of non-О1/ non-O139 Vibrio cholerae by multilocus sequence typing. PLoS One. 2013; 8(6): e65342. DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0065342
- Theophilo G.N., Rodriges D.P., Leal N.C., Hofer E. Distribution of virulence markers in clinical and environmental Vibrio cholerae non-O1/non-O139 strains isolated in Brazil from 1991 to 2000. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2006; 48(2): 65-70. DOI: http://doi.org/10.1590/s0036-46652006000200002
- Архангельская И.В., Непомнящая Н.Б., Монахова Е.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Кругликов В.Д. Генетическая неоднородность популяции Vibrio cholerae non-O1/non-O139, выделенных в Ростовской области. Здоровье на¬селения и среда обитания. 2015; (3): 25-7.
Supplementary files
