The Microbiota Continuum along the Reproductive Tract in Women with Infertility

Full Text

Женский репродуктивный тракт представляет собой уникальную экосистему [1]. Предполагается, что компоненты микробиоты влагалища могут присутствовать в эндометриальной ткани, вызывая стимуляцию локальных иммунных факторов, в том числе при участии лактобактерий вагинального биотопа. Есть наблюдения, констатирующие возникновение инфекционно-воспалительных заболеваний в репродуктивных органах, обусловленных влагалищной микрофлорой [2]. В ходе недавних исследований, основанных на секвенировании генов 16S рРНК, установлены 5 типов вагинальной микробиоты, в 3-4 из которых лактобактерии составляют более 90% микробного сообщества [3]. Считается, что в случае их доминирования, обеспечивающего в первую очередь низкий уровень рН, а также достаточно высокое содержание метаболитов с антибактериальной активностью (бактериоцины, пероксид и др.), ингибируется рост потенциально опасных микроорганизмов [4-6]. С другой стороны, немало фактов указывает на то, что нарушение состава микробиоты нижних отделов генитального тракта, проявляющееся прежде всего клиникой бактериального вагиноза (БВ), предрасполагает к развитию инфекций мочевыделительной системы, заболеваний, передающихся половым путем, и преждевременным родам [2].

Вопрос об участии микроорганизмов, особенно комменсальных и мутуалистических, в развитии бесплодия к настоящему времени не решен. Если участие таких возбудителей инфекций, передающихся половым путем, как Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae, в патогенезе этого недуга достаточно подробно описано [7], то многие другие микроорганизмы остаются пока в области научных интересов. В недавних исследованиях показана связь условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) из нижних отделов генитального тракта женщин с неблагоприятными исходами беременности после как естественного, так и искусственного оплодотворения [8]. Более того, отмечается, что УПМ при колонизации генитального тракта, как правило, не вызывают типичных симптомов воспалительного процесса, особенно при локализации в его верхних отделах [9]. Отсутствует и однозначное отношение к БВ как причинному фактору бесплодия [10]. БВ относится к синдромам с полимикробной этиологией, когда создается локальное провоспалительное микроокружение со снижением численности протективных лактобактерий и избыточным ростом анаэробных УПМ [11, 12]. Подобные нарушения в вагинальном биотопе обеспечивают условия, облегчающие восходящую диссеминацию микроорганизмов, что в конечном итоге может привести к трубному бесплодию [13]. Более того, развитие беременности на фоне БВ сопровождается клиническими нарушениями, вплоть до ее прерывания [14].

Цель исследования — оценить таксономическое разнообразие микроорганизмов в вагинальном биотопе при бесплодии.

Материал и методы

Для исследования использовали образцы вагинального содержимого, полученного из заднего свода с помощью мерной ложки Фолькмана от 15 женщин, состоящих в бесплодном браке. Метагеномное исследование 16S рибосомной РНК образцов осуществлено на платформе Illumina MiSeq с использованием набора MiSeq Reagent Kits v3 (600-Cycle Kit) согласно рекомендациям производителя. Библиотеки для секвенирования участков V3-V4 гена 16S рибосомной РНК были приготовлены согласно 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina. При биоинформационной оценке применяли программное обеспечение для метагеномного анализа — Kraken Metagenomics version 2.0.0 (классификатор ридов — коротких нуклеотидных последовательностей), используя стандартную базу данных [15].

Для анализа полученных данных использовали описательную статистику и программу Statistica 7.0. Данные представлены в виде M ± δ.

Результаты исследования

В вагинальном биотопе женщин с бесплодием регистрировали преимущественно бактериальные таксоны, доля которых в общей массе составляла 4999% (83,9 ± 16,02). Генетические маркеры бактерий семейства Lactobacillaceae обнаруживали в 12-84% (41,9 ± 17,99) образцов, причем в половине случаев их содержание не превышало 30% общей бактериальной массы. Ведущее положение среди представителей семейства занимал род Lactobacillus с доминированием L. jensenii, L. delbrueckii и L. amylolyticus. В единичных случаях количество микроорганизмов родов Lactobacillus и Enterococcus было сопоставимым. L. crispatus и L. gasseri обнаруживались в ряде проб, но их доля в генетическом материале была минимальной. Против ожидания, L. iners не обнаружены ни у одной пациентки.

Ведущих участников в этиологии БВ — Gardnerella vaginalis — регистрировали практически во всех пробах, но их доля, как правило, не превышала 1%. Другой возбудитель БВ — Atopobium vagirne — не обнаружен ни в одной пробе, однако в 12 из них присутствовал A. parvulum, также в незначительных количествах.

Примечательно, что в микробиоте влагалища инфертильных женщин удельное содержание анаэробных бактерий — типичных ассоциантов БВ: Actinomyces spp., Peptoniphilus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp. и Mobiluncus curtisii — оказалось минимальным.

Неожиданной находкой для вагинального биотопа стало обнаружение в большом количестве генетического материала Moraxella spp. Во всех пробах M. osloensis занимала лидирующие позиции среди представителей всего сообщества. Так, в половине случаев выявлено совместное присутствие M. osloensis и G. vaginalis, при этом первый симбионт преобладал, а численность гарднерелл составляла порядка 10% бактериальной массы. В трети таких случаев присутствовал Enterococcus faecalis (8-15%). Кроме этого,M. osloensis чаще обнаруживали в пробах, когда среди лактобактерий лидировали представители L. jensenii. В 1 случае 20% генетического материала представлял геном Bifidobacterium longum в сочетании с M. osloensis (19%).

Доля микроорганизмов семейства Staphylococcaceae в микробиоте влагалища только в 1 случае составила 0,5%, в остальных обнаруживали следовые количества, при этом преобладали геномоварианты из рода Staphylococcus. Во всех пробах обнаружены генетические маркеры S. aureus, однако в 3 случаях их количество занимало 2-ю рейтинговую позицию, уступив 1-е место S. haemolyticus. Практически всегда эти бактерии обнаруживали в ассоциации друг с другом. Аналогично скудное представительство характерно для семейства Enterobacteriaceae. Только в 2 случаях их доля в общей микробной массе достигала 0,8%. Во всех пробах обнаружены геномы Escherichia coli, Klebsiella spp. и комплекса Enterobacter cloacae. В 9 случаях лидировали E. coli, в 3 — Klebsiella spp., и еще в 3 случаях данные геномы выявлены в сопоставимых количествах. В 12 пробах обнаружены геномы микроорганизмов рода Citrobacter, но их количество было ничтожно мало.

Обсуждение

Одной из причин снижения фертильности признаются перенесенные специфические урогенитальные инфекции. Как показали результаты нашего исследования, при бесплодии в вагинальном биотопе прослеживаются и заметные изменения в составе нормофлоры: снижается численность лактобактерий, практически элиминируются наиболее полезные, с выраженной антагонистической активностью виды — L. crispatus и L. gasseri, а также расширяется спектр других микроорганизмов, преимущественно УПМ. Зачастую такие события протекают незаметно для пациента. Ранее показано, что предрасположенность к специфическим инфекционно-воспалительным процессам в генитальном тракте связана с избыточным ростом бактерий, прежде всего ассоциированных с БВ, из родов Gardnerella, Atopobium, Prevotella, Bacteroides, Peptostreptococcus, Mobiluncus, Sneathia, Leptotrichia, Mycoplasma и порядка Clostridiales [16]. Однако в настоящем исследовании большинство из них если и были обнаружены, то в минимальных количествах.

Известно, что род Atopobium представлен 4 видами, один из которых тесно связан с развитием БВ [17]. A. parvulum — вид, который обнаруживают преимущественно в ротовой полости [18], однако. по нашим наблюдениям, его генетический материал выделен из влагалища, что косвенно может указывать на широкое распространение нетрадиционных сексуальных практик, что, например, согласуется с данными FM. Lewis и соавт. [19].

С заметным постоянством детектировали фрагменты генома коккобацилл M. osloensis, что оказалось достаточно неожиданным, поскольку эти бактерии являются частью респираторной микрофлоры и относятся к оппортунистическим микроорганизмам, хотя есть сведения об их обнаружении при различных воспалительных процессах, в том числе при вагините [20]. В большинстве случаев упоминается, что пациенты, инфицированные M. osloensis, были иммунокомпрометированными. Описано, что основной метаболит этих бактерий — 4-метил-3-гексеновая кислота — участвует в формировании стойкого неприятного запаха [21]. Среди факторов патогенности M. osloensis описаны продукция экзотоксина, для накопления которого требуется длительная персистенция микроорганизма, а также липополисахарид, фимбрии, предполагается участие капсулы и некоторых адгезинов [22].

При описании лактобактерий как основных участников микробиоты влагалища основное внимание уделяется L. crispatus, которые в настоящем исследовании обнаружены лишь в трети проб и в небольшом количестве. Ведущая позиция принадлежала L. jensenii, которые способны продуцировать биосурфактант с антимикробной активностью в отношении E. coli и Candida albicans и антиадгезивным действием на E. coli, S. saprophyticus и Enterobacter aerogenes [23]. В отношении моракселл таких данных нет. Показано, что L. jensenii являются активным продуцентом перекиси водорода [24], однако есть сведения, что антимикробная активность лактобацилл в большей степени определяется молочной кислотой и бактериоцинами [25]. Более того, тот же вид продуцирует и пероксидазу, которая нивелирует действие перекиси [24]. Кроме этого, L. jensenii отличаются большей активностью D-лактатдегидрогеназы, участвующей в продукции D-оптического изомера молочной кислоты [26], для которого антимикробная активность менее характерна, чем для L-изомера. Несмотря на вполне убедительные иммуномодулирующие эффекты L. jensenii [27], описано участие этого вида в развитии ряда воспалительных заболеваний [28].

В целом, можно предположить, что при развитии бесплодия происходят снижение количества лактобактерий и смена их лидирующего вида. В случае замещения на L. jensenii можно ожидать проявление антагонистических свойств в отношении ряда УПМ, в том числе основных возбудителей БВ, однако в силу малой численности, изменения функциональной активности эффективность воздействия лактофлоры снижается и такие микроорганизмы, как M. osloensis, могут успешно персистировать в вагинальном биотопе. При этом возможна постепенная колонизация и верхних отделов генитального тракта, что влечет за собой репродуктивные проблемы.

Заключение

У включенных в исследование женщин с бесплодием наблюдались бессимптомно протекающие дисбиотические процессы, характеризующиеся рядом особенностей. В вагинальной микробиоте существенно снижается количество представителей рода Lactobacillus. Среди последних доминируют L. jensenii, функциональная активность которых не обеспечивает в полной мере колонизационную резистентность вагинального биотопа, допуская избыточное размножение УПМ, в частности M. osloensis. Прослеженные стойкие нарушения в составе микробиоты влагалища в совокупности с изменениями локальной иммунной реактивности могут становиться причиной снижения фертильности, а в запущенных ситуациях — и утраты репродуктивной функции.

About the authors

A. P. Godovalov

E.A. Vagner Perm State Medical University

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Anatoly P. Godovalov — Cand. Sci. (Med.), Assoc. Prof., Department of microbiology with a course of virology

Perm 614990

Russian Federation

T. I. Karpunina

E.A. Vagner Perm State Medical University

Email: fake@neicon.ru

Tamara I. Karpunina — Doct. Sci. (Biol.), Prof., Department of microbiology with a course of virology

Perm 614990

Russian Federation

References

Supplementary files