Enterobacteria in the intestinal microbiocenosis of hivinfected children

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
В последние годы все больше внимания уделяется кишечной микрофлоре
ВИЧ-инфицированных пациентов. Связано это с тем, что ВИЧ-ассоциированные
изменения кишечного микробиоценоза оказывают влияние на характер течения
инфекции и прогрессирование заболевания [1, 2, 3]. Установлено, что E.coli индуцирует увеличение репликации ВИЧ [7], также у энтеробактерий повышается
активность генов, ответственных за синтез липополисахарида (ЛПС) клеточной
стенки [4]. Данный полимер, вследствие повышенной проницаемости кишечной
стенки, попадает в кровоток и обусловливает хроническую иммунную активацию,
что коррелирует со снижением уровня T-лимфоцитов, развитием гипертонии [4, 8],
ростом смертности пациентов [5, 6, 10]. В связи с этим, у пациентов с ВИЧ-статусом уровень ЛПС в кровотоке используется как показатель системной микробной
транслокации. Увеличение соотношения представителей типа Proteobacteria к представителям рода Bacteroides используют как маркер прогрессирования ВИЧ-инфекции [5]. Данные о роли кишечных микросимбионтов в прогрессировании процесса,
полученные на когортах взрослых пациентов, не дают представления о биологических свойствах кишечных микроорганизмов и их взаимодействии друг с другом.
Это не позволяет оценить механизмы развития микроэкологических нарушений и
транслокации бактерий в кровеносное русло у ВИЧ-инфицированных пациентов с
позиций ассоциативного бактериального симбиоза. Вовлечение в эпидемический
процесс ВИЧ-инфекции детей, необходимость увеличения качества и продолжительности жизни предопределяет необходимость оценки у них состояния кишечного микробиоценоза, прежде всего состава и частоты колонизации представителями
семейства Enterobacteriaceae. Актуальность исследования обусловлена также тем, что
практически отсутствуют данные о вирулентных свойствах энтеробактерий, что затрудняет процесс коррекции микроэкологических нарушений кишечника у данной
категории пациентов [9]. Цель исследования — оценка видового состава, факторов
вирулентности и характера взаимодействия энтеробактерий с кишечными микросимбионтами у детей с ВИЧ-инфекцией.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследован качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза 89 ВИЧ-инфицированных детей (основная группа) и 74 детей без ВИЧ-статуса
(группа сравнения). Средний возраст детей основной группы составил 24 ± 2 месяца, из них 49 (55%) лиц мужского и 40 (45%) лиц женского пола. Средний возраст
детей группы сравнения был 26 ± 4 месяца, из них лиц мужского пола — 39 (53%),
женского — 35 (47%) человек. Сравниваемые группы имели сходный социальный
статус и пищевой характер. Исследование вели в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения
медицинских исследований с участием человека в качестве субъекта исследования»
(1975 г. с поправками от 2013 г). Оценку состояния кишечного микробиоценоза
проводили согласно ОСТ «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника»
(2003 г).
Выделены и идентифицированы до вида 273 штамма энтеробактерий, из них
150 — индигенных представителей кишечного микробиоценоза и 123 условно
патогенных. Выделение энтеробактерий проводили с помощью количественного бактериологического метода на среде Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск).
Идентификацию осуществляли на основании комплекса фенотипических свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических. Способность
утилизировать различные субстраты изучали с использованием коммерческих тест-систем ENTEROtest 24 (Lachema diagnostica s.r.o, Чехия), ПБДЭ (НПО
«Диагностические системы», Россия) и СИБ для энтеробактерий набор № 2 (НПО
«Микроген», Россия). У энтеробактерий изучены следующие факторы вирулентности: факторы адгезии (специфические и гидрофобность), колонизации, продукция
ДНКазы, липазы, цитотоксина (гемолизина).
Изучение показателей специфической адгезии проводили по В.И. Брилису
(1986). Исследование способности энтеробактерий продуцировать липазу и ДНКазу
определяли на Tributhyrin Agar Base (HIMEDIA, Индия) и DNA Base Agar (HIMEDIA,
Индия) соответственно. Определение гемолитической активности микроорганизмов проводили на МПА с добавлением 5% взвеси эритроцитов человека.
Для статистического анализа использован программно-методический комплекс
анализа данных IBM SPSS Statistics / PS IMAGO. Описательная статистика представлена относительными данными, выраженными в % и средними значениями
признаков, выраженными в виде медианы с 25 и 75 процентилями Me (LQ; UQ).
Статистическая обработка информации строилась с учетом характера распределения данных, которое определяли с помощью построения гистограмм. Так как закон
распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, достоверность различий в парных независимых совокупностях определяли с помощью
непараметрических критериев оценки достоверности (критерия U — Манна-Уитни,
критерия χ2
). Для анализа связей между количественным уровнем энтеробактерий
и степенью микроэкологических нарушений кишечника применяли коэффициент
корреляции Спирмена. Различия считали значимыми при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Частота обнаружения типичной кишечной палочки в кишечном микробиоценозе у детей сравниваемых групп не отличалась и составила 81% у ВИЧ-позитивных
пациентов и 97,3% у ВИЧ-негативных детей (χ2
=0,2, df=1, p=0,65). Хотя у детей с
ВИЧ-статусом регистрировали более высокий количественный уровень E.coli lac+,
чем у здоровых детей — 8 (6; 8) lg КОЕ/г против 7 (6; 8) lg КОЕ/г, тем не менее полученная разница была статистически не значима (U=1,22; p=0,22). Однако, у ВИЧинфицированных детей регистрировали высокую частоту колонизации слизистой
кишечника другими представителями семейства Enterobacteriaceae. В 20,2% случаев
в кишечном микросимбиоценозе ВИЧ-позитивных детей обнаруживали кишечные
палочки со слабыми ферментативными свойствами, в 30,3% случаев гемолизинпродуцирующие эшерихии. У ВИЧ-негативных детей E.coli lac- колонизировали
слизистую в 4,1% случаев (χ2
=148, df=1, p=0,001), E.coli hly+ в 22,9% (χ2
=0,7, df=1,
p=0,8). Количественные уровни кишечных палочек с измененными свойствами в
основной группе составили 8 (6; 8) lg КОЕ/г и 7 (6; 8) lg КОЕ/г соответственно, а у
ВИЧ-негативных детей количественные уровни были на один lg ниже и составили
7 (6; 7) lg КОЕ/г и 6 (5; 7) lg КОЕ/г соответственно (U=2,21; p=0,03). У 33,7% детей с ВИЧ-инфекцией в кишечнике вегетировали микроорганизмы рода Klebsiella
со средней геометрической концентрацией 8 (7; 9) lg КОЕ/г. Однако, практически
такие же показатели регистрировали и в группе сравнения. Частота колонизации
клебсиеллами слизистой у них составила 37,8%, а средняя геометрическая концентрация — 8 (7; 8) lg КОЕ/г (U=0,16; p=0,88). В 90% случаев клебсиеллы у ВИЧ-инфицированных были представлены K. pneumoniae подвид pneumoniae, в 6,7% случаев
K. oxytoca и в 3,3% случаев — K. pneumoniae подвид ozaenae. У детей группы сравнения преобладающим видом также была K. pneumoniae подвид pneumoniae (71,4%), но
доля K. ozaenae достигала 25%. В сравниваемых группах отмечали различия в плотности колонизации кишечника K. pneumoniae подвид pneumoniae. Количественный
уровень K. pneumoniae подвид pneumoniae у детей с ВИЧ-статусом был в 10 раз выше,
чем у ВИЧ-негативных детей — 9 (8; 10) lgКОЕ/г, против 8 (7; 8) lg КОЕ/г. Таким образом, полученные данные выявили отсутствие статистических различий по количественному содержанию типичных кишечных палочек в кишечнике детей с ВИЧинфекцией, но отмечается рост частоты и уровней колонизации слизистой условно
патогенными энтеробактериями.
Кишечный микробиоценоз представляет собой систему, которая способна к саморегуляции путем изменения количественного содержания и активности индигенных бактерий, а также снижения уровня условно патогенных микросимбионтов. Для
оценки способности микроэкологической системы кишечника при ВИЧ-инфекции
к саморегуляции исследовали изменения титров энтеробактерий, в зависимости от
степени микроэкологических нарушений. С увеличением глубины дисбактериоза в
сравниваемых группах происходит разнонаправленное изменение содержания данных кишечных микросимбионтов. У ВИЧ-инфицированных детей средняя геометрическая концентрация типичных эшерихий падает с 8 (7; 9) lg КОЕ/г при I степени до 6 (4; 8) lg КОЕ/г при III степени микроэкологических нарушений (r = -0,21;
p=0,04). У ВИЧ-негативных детей имеется тенденция к сохранению количественных уровней кишечных палочек, так как титры при I и III степени микроэкологических нарушений были сходными и составили 7 (6; 8) lg КОЕ/г (r = 0,33; p = 0,06).
Установлено, что с увеличением степени микроэкологических нарушений независимо от ВИЧ-статуса имеется однонаправленная тенденция в отношении клебсиелл —
их количественный уровень растет. При ВИЧ-инфекции содержание клебсиелл в
кишечном содержимом при I степени дисбактериоза составило 6 (6; 7) lg КОЕ/г, при
III увеличилось до 8 (7; 8) lg КОЕ/г (r = 0,25, p=0,01). У детей группы сравнения —
4 (4; 5) lg и 8 (8; 9) lg КОЕ/г соответственно, корреляционная связь между уровнем
клебсиелл и степенью микроэкологических нарушений была статистически значима (r = 0,45, p=0,0001).
В кишечном микробиоценозе ВИЧ-инфицированных в 98,1% случае энтеробактерии формировали ассоциации с другими кишечными микросимбионтами. Ассоциации условно патогенных микросимбионтов у детей сравниваемых
групп регистрировали при II и III степенях микроэкологических нарушений.
Распространенность ассоциативных сожительств бактерий в группе детей с ВИЧстатусом составила 91,6 на 100 ВИЧ-инфицированных детей [95% ДИ 86,5-92,2], в
группе сравнения показатель был ниже — 82,4 на 100 здоровых детей [95% ДИ 80,2-
84,4] (χ2 =0,81, df=1, p=0,77).
У ВИЧ-инфицированных детей регистрировали высокую распространенность
трехкомпонентных микробных ассоциаций — 44,6 на 100 ВИЧ-инфицированных
детей [95 % ДИ 43,2-45,3]. Обращает на себя внимание, что у детей с ВИЧ-статусом регистрировали десять разновидностей трехкомпонентных микробных ассоциаций, причем в шесть из них входят представители семейства Enterobacteriaceae.
Доминирующей была ассоциация Enterobacteriaceae+Candida spp.+Staphylococcus
spp. (27%). Ассоциация Staphylococcus spp.+Enterobacteriaceae+Enterobacteriaceae
занимала третье место в структуре трехкомпонентных сожительств микроорганизмов (10,8%) при ВИЧ-инфекции. У детей с ВИЧ-инфекцией также довольно часто микробные консорциумы включали четыре (22,9 на 100 ВИЧ-инфицированных детей [95% ДИ 19,2-23,1]) и пять (9,6 на 100 ВИЧ-инфицированных [95% ДИ 8,8-10,1]) условно патогенных микросимбионтов. В состав шести из 7 разновидностей четырехкомпонентных микробных ассоциаций входили представители
семейства Enterobacteriaceae. Чаще всего в 21% случаев у ВИЧ-инфицированных детей выделяли Candida spp.+Staphylococcus spp.+Enterobacteriaceae+Enterobacteriaceae.
Только в группе ВИЧ-инфицированных детей в составе кишечного микробиоценоза
были обнаружены пятикомпонентные ассоциации УПМ трех разновидностей. По
37,5% приходилось на ассоциацию Candida+Enterobacteriaceae+Staphylococcus spp.+S.
aureus+Enterococcus Hly+ и на Enterobacteriaceae+ Enterobacteriaceae+Staphylococcus
spp.+S.aureus+Enterococcus Hly+. Третья разновидность пятикомпонентной ассоциации у ВИЧ-инфицированных детей включала Candida+Enterobacteriaceae+Staphylococcus spp.+S.aureus+Actinomyces spp.
В группе ВИЧ-негативных чаще обнаруживали двухкомпонентные микробные
сожительства — 20,2 на 100 здоровых детей [95% ДИ 17,5-22,2]. Доминировала
ассоциация Candida+Staphylococcus (40%). Распространенность трехкомпонентных ассоциативных сожительств составила 18,8 на 100 детей [95% ДИ 16,7-25,1].
Трехкомпонентные ассоциации, как и у ВИЧ-позитивных детей, были представлены 10 разновидностями микробных сожительств. Доминирующей была ассоциация
Candida spp.+Staphylococcus spp.+Enterobacteriaceae (24,1%). Распространенность четырехкомпонентных микробных ассоциаций у детей группы сравнения практически не отличалась от ВИЧ-инфицированных и составила 18,9 на 100 здоровых детей
[95% ДИ 17,4-19,1] (p=0,83), тогда как пятикомпонентные сожительства УПМ регистрировали только у 2,7 из 100 здоровых детей [95% ДИ 1,1-2,9] (p=0,03). Среди
четырехкомпонентных ассоциаций доминировала Candida spp.+Staphylococcusspp.+S.
aureus+Enterobacteriaceae (42,9%). Таким образом, у ВИЧ-инфицированных детей
отмечается высокая распространенность многокомпонентных микробных ассоциаций (трехкомпонентных и пятикомпонентных). В 68% случаев в состав ассоциаций
входят условно патогенные представители семейства Enterobacteriaceae.
Установлено, что в 86,8% случаев условно патогенные представители энтеробактерий проявляли нейтрализм к микробам из ассоциаций. Распространенность
антагонизма энтеробактерий в группе ВИЧ-инфицированных находилась на уровне 13,2 на 100 культур [95% ДИ 11,4-14,2]. В группе детей без ВИЧ-статуса данный
показатель был схожим и составил 14,6 на 100 культур [95% ДИ 13,5-15,4] (χ2 =0,78,
df=1, p=0,82). Чаще всего энтеробактерии-оппортунисты вступали в антагонистические отношения с кокковой флорой, таковых от ВИЧ-инфицированных детей
было 11,3% штаммов, в группе сравнения 12,5%. Сами энтеробактерии испытывали
антагонизм со стороны доминирующей бифидофлоры. Распространенность антагонизма бифидобактерий по отношению к E.coli lac+ в сравниваемых группах была
сходной: 60,3 на 100 культур бифидобактерий в группе ВИЧ-инфицированных [95%
ДИ 54,5-70,8] и 68,1 на 100 культур в группе ВИЧ-отрицательных детей [95% ДИ
62,4-75,5] (χ2 =1,6, df=1, p=0,7). Однако у ВИЧ-позитиных детей бифидобактерии
с условно патогенными энтеробактериями формировали антагонистические взаимоотношения реже. В группе с ВИЧ-статусом распространенность антагонизма бифидофлоры к энтеробактериям составила 55,2 на 100 культур [95% ДИ 45,6-56,7],
у детей группы сравнения 82,9 на 100 культур [95% ДИ 78,3-85,6] (χ2 =15,2, df=1,
p=0,01). Частота антагонизма бифидобактерии к представителям рода Klebsiella от
ВИЧ-позитивных детей была в 3 раза ниже, чем у детей группы сравнения (5% против 18,4%). Это согласуется с приведенными данными о высокой частоте и уровне
колонизации данными микросимбионтами кишечника у ВИЧ-инфицированных
детей. Установлено отсутствие статистически значимых отличий по адгезивной активности энтеробактерий (U=0,68, p=0,49). Чаще всего энтеробактерии от ВИЧ-инфицированных детей проявляли среднюю (41,5%) или низкую (35,8%) способность к
адгезии, высокоадгезивных штаммов от ВИЧ-позитивных детей было только 22,6%.
Индексы адгезии микроорганизмов (ИАМ) составили 3,2 (3,0; 3,81), 2,1 (1,8; 2,5),
5,4 (5,1; 5,7) соответственно. Энтеробактерии от ВИЧ-негативных детей в 52,1%
случаев были отнесены к среднеадгезивным культурам. Как и в группе ВИЧ-инфицированных, у здоровых детей низкой способностью к адгезии обладали 35,4% культур энтеробактерий. Высокоадгезивными были только 12,5% штаммов. Показатели
индексов адгезии микроорганизме составили 3,5 (3,2; 3,6), 2,1 (2,0; 2,4), 5,1 (4,9; 7,6)
соответственно.
Кроме адгезинов, факторы вирулентности энтеробактерий были представлены
гемолизинами и липазой. В группе ВИЧ-позитивных детей липазной активностью
обладали 13,2% штаммов, тогда как среди штаммов, изолированных от ВИЧ-негативных детей, таковых было 14,6% (χ2 =0,76, df=1, p=0,67). Уровень экспрессии
липазы сравнивали по величине зоны гидролиза трибутирата, образующейся вокруг
колоний. В среднем данный показатель у штаммов от ВИЧ-инфицированных детей составил 7,7 (6,8; 8,1) мм, от детей группы сравнения 4,1 (3,6; 4,5) мм (U=0,26;
p=0,79). Гемолитической активностью обладали 49,1% штаммов энтеробактерий от
ВИЧ-позитивных детей и 35,4% от детей группы сравнения. При этом количество
выделенного гемолизина в сравниваемых группах не различалось, так как величины
зон гемолиза вокруг колоний составили 3,6 (2,8; 4,3) мм и 4,1 (3,5; 4,6) мм соответственно (U=0,31, p=0,63). Таким образом, частота и уровень экспрессии ферментов
инвазии и гемолизина у энтеробактерий, изолированных от детей с ВИЧ-инфекцией, не отличается от группы сравнения.
Энтеробактерии по значимости для ВИЧ-инфицированных больных занимают
особое место. Ряд исследований свидетельствует, что в кишечном микробиоценозе
при ВИЧ-инфекции повышается удельный вес как индигенных энтеробактерий,
так и условно патогенных [7]. Наши исследования показали, что частота и уровень
колонизации слизистой типичными кишечными палочками у ВИЧ-инфицированных детей не отличались от аналогичных показателей у детей без ВИЧ-статуса. При
усугублении степени микроэкологических нарушений количественное содержание
лактозопозитивных эшерихий у ВИЧ-позитивных детей снижается, тогда как у
здоровых детей не изменяется. Полученные данные отражают разную адаптивную
способность кишечного микробиоценоза в сравниваемых группах детей. E.coli lac+
является облигатным обитателем кишечного микробиоценоза, поэтому у здоровых
детей сохранение их количества направлено на поддержание общего содержания
доминантной микрофлоры и предупреждение колонизации слизистой факультативными бактериями. У ВИЧ-инфицированных детей механизмы стабилизации
кишечного микроэкологического равновесия нарушены, поэтому наблюдается снижение титров E.coli lac+.
При ВИЧ-инфекции отмечается высокое содержание в кишечном микробиоценозе условно патогенных энтеробактерий — E.coli lac- и E.coli hly+, при этом частота
колонизации эшерихиями со слабыми ферментативными свойствами была в 5 раз
выше, чем у ВИЧ-негативных детей (p=0,001). При увеличении глубины микроэкологических нарушений, независимо от ВИЧ-статуса, количественный уровень условно патогенных энтеробактерий нарастает, особенно титры клебсиелл. Это отражает
общие закономерности развития дисбиотических нарушений, которые характеризуются снижением количественного содержания индигенных и ростом числа условно патогенных микроорганизмов, но микроэкологические сдвиги у детей с ВИЧ-статусом они более выражены. Условно патогенные энтеробактерии у них формируют
многокомпонентные ассоциации. Установлено, что у ВИЧ-инфицированных детей
отмечается высокая распространенность трех и пятикомпонентных микробных ассоциаций, в состав которых входят условно патогенные энтеробактерии. В ассоциациях энтеробактерии в большинстве случаев проявляют нейтрализм и только 11%
вступают в антагонизм по отношению к кокковой флоре. Аналогичные показатели
были зарегистрированы в отношении энтеробактерий у детей без ВИЧ-статуса. Рост
в кишечнике числа условно патогенных энтеробактерий при ВИЧ-инфекции, вероятно, обусловлен снижением частоты антагонизма доминантной бифидофлоры, так
как распространенность данного признака у бифидобактерий ВИЧ-инфицированных детей была в 1,5 раза ниже, чем в группе сравнения.
Несмотря на высокую распространенность вторичных инфекций у ВИЧ-позитиных пациентов, вызванных условно патогенными энтеробактериями, различий в частоте и уровнях продукции факторов адгезии, инвазии и токсинообразования выявлено
не было. Вероятнее всего, в основе транслокации микроорганизмов через слизистую
лежат иные механизмы, нежели продукция факторов патогенности бактериями, например, иммунологические события, связанные со снижением уровня мукозальных
Th 17, или дефекты слизистой вследствие репродукции вируса, тогда как факторы инвазии представителей семейства Enterobacteriaceae играют второстепенную роль.

About the authors

Yu. V. Zakharova

Kemerovo State Medical University

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

к.м.н.,

650056, Кемерово, ул. Ворошилова, 22

Россия

L. A. Levanova

Kemerovo State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

V. I. Ivanov

Kemerovo State University

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

A. C. Bykov

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

S. S. Afanasiev

Gabrichevsky Moscow State Institute for Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

M. S. Afanasiev

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

A. V. Karaulov

Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Кемерово Россия

References

Supplementary files