Increasing the immunogenic and protective activity of the vaccine strain Yersinia pestis EV line NIIEG using synthetic immunomodulators

Full Text

Введение

Реализация современной парадигмы вакцинопрофилактики, обеспечиваемой разработкой дифференцированных подходов к вакцинации с целью создания эффективного иммунитета у каждого прививаемого человека, подразумевает возможность персонифицированного использования разных доз и схем вакцинации, а также расширение арсенала адъювантов, иммуномодуляторов, цитокинов и дополнительных средств стимуляции иммунного ответа. В России для специфической профилактики чумы применяется вакцина чумная живая (ВЧЖ) производства Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и 48 Центрального научно-исследовательского института Министерства обороны РФ. Также лицензирован препарат — вакцина чумная молекулярная микроинкапсулированная (ВЧММ) для применения личному составу войск Министерства обороны РФ и МЧС, действующих в чрезвычайных ситуациях [1].

ВЧЖ представляет собой лиофилизированную живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ. После вакцинации у большинства привитых формируется напряжённый иммунитет продолжительностью 6–12 мес, качество и длительность которого зависят от возраста, количества предыдущих вакцинаций против этой инфекции и индивидуальных особенностей генетического полиморфизма генов HLA [2]. Многолетний опыт применения ВЧЖ свидетельствует о необходимости совершенствования подходов к специфической профилактике чумы для создания эффективного иммунитета у каждого прививаемого человека.

Если при разработке субъединичных вакцин применение иммуномодуляторов и адъювантов решает задачу оптимального представления антигенов иммунной системе, способствуя формированию выраженного иммунного ответа с активацией как гуморальных, так и клеточных реакций [3], то в исследованиях по сочетанному введению вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ c азоксимером бромида (полиоксидоний) [4], синтетическим аналогом лей-энкефалина (даларгин) и синтетическим аналогом двуспиральной РНК (лиганда TLR3) — (Poly(I:C)) [5], рекомбинантным человеческим интерфероном-γ (ИФН-γ) (ингарон) [6], рекомбинантным интерлейкином-1Р (беталейкин) [7] не только получен стимулирующий эффект вакцинации, но и определены точки возможного воздействия на иммунную систему в различные периоды иммуногенеза.

Однако выбор иммуномодулятора не должен быть эмпирическим. В выборе препарата для потенциирования действия вакцины важно учитывать механизм и направленность действия иммуномодулятора на те или иные звенья иммунной системы [8]. В зависимости от происхождения иммуномодуляторы делят на микробные, растительные, человеческие (эндогенные), аналоги природных соединений, полученные путём химического синтеза или с помощью рекомбинантных технологий, и синтетические иммуномодуляторы [9]. Прогресс в области лекарственных средств тимического происхождения шёл по линии создания препаратов II и III поколений — синтетических аналогов природных гормонов тимуса или фрагментов этих гормонов, обладающих биоактивностью. На основе одного из фрагментов, включающего аминокислотные остатки активного центра тимопоэтина, был создан синтетический гексапептид аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин (иммунофан), обладающий выраженными иммуностимулирующими свойствами [9, 10]. К классу тиопоэтинов из группы химически чистых синтетических низкомолекулярных иммуномодуляторов относится синтетический олигопептид глутаксим — глутамил-цистеинил-глицин динатрия, усиливающий костномозговое кроветворение, активирующий фагоцитоз, восстанавливающий функциональную активность макрофагов, инициирующий систему цитокинов, эритропоэтина [11, 12]. Другой низкомолекулярный олигопептид — гепон состоит из 14 аминокислот (Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu) и вызывает продукцию α- и β-ИФН; мобилизует и активирует макрофаги, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет [9, 13]. И хотя все эти препараты характеризует сходный механизм воздействия на иммунную систему макроорганизма, требует уточнения направленность иммуномодулирующего влияния данных синтетических олигопептидов в условиях сочетанного применения с вакцинным штаммом Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Цель исследования — сравнительная оценка действия лекарственных препаратов из группы синтетических иммуномодуляторов на иммуногенные и протективные свойства вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ в модельных опытах на животных.

Материалы и методы

Штаммы

В работе использовали вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ и вирулентный штамм Y. pestis 231(708) основного подвида, полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора.

Иммуномодулирующие препараты

Олигопептид 1 — О1 (треонил-глутамил-лизил-лизил-аргинил-аргинил-глутамил-треонил-валил-глутамил-аргинил-глутамил-лизил-глутамат; глутоксим), олигопептид 2 — О2 (глутамил-цистеинил-глицин динатрия; гепон) и олигопептид 3 — О3 (аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин; имунофан), все препараты российского производства. Дозы препаратов (табл. 1) были выбраны с учётом данных литературы и на основании предварительных результатов собственных исследований.

 

Таблица 1. Препараты, использованные для иммунизации биопробных животных

Table 1. Preparations used for immunization of biomodel animals

Препарат, использованный для иммунизации The preparation used for immunization	Иммунизация беспородных белых мышей Immunization of outbred white mice		Иммунизация беспородных морских свинок Immunization of outbred guinea pigs
	доза, мкг | dose, µg	n	доза, мкг | dose, µg	n
О1	10	40* + 80** + 40***	100	12* + 15**
О2	30	40* + 80** + 40***	300	14* + 15**
О3	1	40* + 80** + 40***	10	12* + 15**
Примечание. * — животные, иммунизированные однократно; ** — животные, иммунизированные трёхкратно; *** — животные, использованные для определения значения ЛД50. Note. * — animals immunized once; ** — animals immunized three times; *** — animals used to determine the LD50.

 

Лабораторные животные

Эксперименты проводили на беспородных белых мышах массой 17,5 ± 2,5 г и на морских свинках массой 275 ± 25 г, полученных из питомника РосНИПЧИ «Микроб». Манипуляции с животными, а также выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с законодательством Российской Федерации [14] и Директивой № 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 «О защите животных, использующихся для научных целей» [15]. Протокол исследований одобрен Комиссией по биоэтике при РосНИПЧИ «Микроб» (протоколы № 6 от 14.04.2021, № 11 от 07.12.2021, № 2 от 17.02.2022).

Питательные среды

Культуры штаммов выращивали на агаре Хоттингера рН 7,2 ± 0,1 (производство РосНИПЧИ «Микроб»).

Оценка иммуногенности и протективности

Оценку влияния иммуномодулирующих препаратов на показатели иммуногенности и протективности вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ проводили в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» [16]. Рассчитывали иммунизирующую дозу (ImD₅₀), защищающую 50% вакцинированных животных от летального заражения вирулентным штаммом Y. рestis 231(708) на 21-е сутки после вакцинации.

Для этого беспородных белых мышей (по 10 особей на каждую иммунизирующую дозу) иммунизировали 2-суточной агаровой культурой вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ подкожно в дозах 2 × 10², 10³, 5 × 10³ и 2,5 × 10⁴ КОЕ в объёме 0,2 мл. Животным опытных групп за 1 ч до вакцинации (1-я схема) и трёхкратно до заражения (2-я схема) подкожно вводили олигопептиды 1, 2 и 3 в дозах 10, 30 и 1 мкг соответственно. Морских свинок иммунизировали подкожно в область верхней трети правого бедра 2-суточной агаровой культурой Y. pestis EV линии НИИЭГ в дозах 4 × 10¹, 2 × 10², 10³, 5 × 10³ КОЕ в объёме 0,5 мл. Животным опытных групп за 1 ч до вакцинации (1 схема) и трехкратно до заражения (2 схема) подкожно вводили олигопептиды 1, 2 и 3. На 21-е сутки после иммунизации всех животных заражали культурой вирулентного штамма основного подвида Y. рestis 231(708) в дозе 400 ЛД₅₀ подкожно в область верхней трети левого бедра.

Для определения значения ЛД₅₀ заражающего штамма Y. pestis 231(708) интактных беспородных белых мышей подкожно заражали тест-штаммом Y. pestis 231(708) в пятикратно возрастающей концентрации от 1 до 125 КОЕ. Наблюдение за животными осуществляли в течение 20 сут. Гибель от чумы подтверждали наличием характерных для чумной инфекции патолого-анатомических изменений, чумного микроба в окрашенных по Граму мазках — отпечатках органов павших животных, положительного результата высевов из органов и крови на пластинки агара Хоттингера рН 7,2 ± 0,1, содержащие стимулятор роста сульфит натрия (0,024 ± 0,001%) и генцианвиолет (0,0045 ± 0,0005%).

Цитокиновый профиль

Определение уровня продукции цитокинов проводили на 3, 14 и 21-е сутки иммуногенеза с помощью твёрдофазного иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем («BioScience») на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Lazurit» («Dynex Technologies») при длине волны 450 нм. Для оценки продукции цитокинов ИФН-γ и интерлейкина-10 (ИЛ-10) венозную кровь с антикоагулянтом (гепарин, ОАО «Синтез») разводили в соотношении 1 : 4 средой RPMI-1640 («PanEco»), содержащей 100 мкг/мл гентамицина («Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Се- машко»), затем делили на 2 равные части. В одну часть вносили 100 мкл Т-клеточного митогена конканавалина А («Sigma») в конечной концентрации 15 мкг/мл (индуцированная продукция), в другую — 100 мкл физиологического раствора (спонтанная продукция). Образцы инкубировали в течение 24 ч при 37ºС [17]. После инкубации клетки осаждали центрифугированием в стандартных условиях и отбирали супернатанты.

Выявление специфических антител

Специфические антитела к капсульному антигену чумного микроба (F1) определяли в сыворотке крови экспериментальных животных на 21-е сутки иммуногенеза методом твёрдофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы «ИФА-АТ-Ф1 Yersinia pestis» (РосНИПЧИ «Микроб»). Активность антител в сыворотке определяли в 3 повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его средней квадратической ошибки.

Морфологические исследования

Макроскопические изменения у умерщвлённых хлороформом животных описывали по стандартной схеме, учитывая характер и объём повреждения во внутренних органах. Для гистологического исследования в 10% водный нейтральный раствор формалина забирали кусочки внутренних органов (печень, почки, селезёнка, тимус, лимфатические узлы, надпочечники, сердце, лёгкие). Из фиксированного материала, применяя стандартную схему проводки гистологического материала, готовили парафиновые блоки. Готовые полутонкие срезы органов, окрашенные гематоксилином и эозином, просматривали в световом микроскопе «Olympus CX41» («Olympus»), фиксируя результат с помощью цифровой камеры «VZ-C31S» («VideoZavr») в программе «VideoZavr v. 1.5».

Статистические методы

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием стандартного пакета программ «Microsoft Office Excel 2010» и «Statistica 10.0» («StatSoft Inc.»). Взаимосвязь между переменными определяли с помощью рангового корреляционного анализа по Спирмену. Данные представляли в виде М ± m, где М — среднее значение, m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Корреляцию считали достоверной при р ≤ 0,05. Величины ImD₅₀ и ЛД₅₀ рассчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [18].

Результаты

На первом этапе проводили расчёт ЛД₅₀ заражающего вирулентного штамма основного подвида Y. pestis 231(708) и оценку влияния иммуномодуляторов О1, О2 и О3 на изменение показателя ЛД₅₀ заражающего вирулентного штамма основного подвида Y. pestis 231(708). Невакцинированным животным перед заражением трёхкратно подкожно вводили иммуномодуляторы. Если для интактных белых мышей ЛД₅₀ штамма Y. pestis 231(708) составила 5 (4–6) КОЕ, то в группе животных, которым перед заражением трёхкратно подкожно был введён иммуномодулятор О1, — 16 (13–18) КОЕ, т.е. был в 3 раза выше, чем у неиммунизированных животных (рис. 1, а), и коррелировал с увеличением средней продолжительности жизни у павших животных этой группы в среднем на 36 ч (рис. 1, б). Применение иммуномодуляторов О2 и О3 в аналогичной схеме существенно не влияло на развитие чумной инфекции у биомодели и не изменяло значение ЛД₅₀ заражающего штамма.

 

Рис. 1. Влияние олигопептидов О1, О2, О3 на значение ЛД50 (а) и продолжительность жизни белых мышей (б) в условиях подкожного заражения вирулентным штаммом Y. pestis 231(708). *р < 0,05 по сравнению с неиммунизированными животными.

Fig. 1. Influence of oligopeptides O1, O2, O3 on the LD50 (а) and on the survival of white mice (b) under conditions
of subcutaneous infection with the virulent strain Y. pestis 231(708). *p < 0.05 when compared with intact animals.

 

Действие олигопептидных иммуномодуляторов в условиях моделирования бубонной формы чумы

Далее была осуществлена оценка эффективности применения лекарственных средств, относящихся к группе низкомолекулярных олигопептидов, при экспериментальной чуме у разных видов лабораторных животных (беспородные белые мыши, морские свинки), ранее иммунизированных вакцинным штаммом EV, по интегральному показателю ImD₅₀ и выживаемости. Нами установлено, что иммунизация экспериментальных животных вакцинным штаммом чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ на фоне введения исследуемых препаратов приводит к повышению напряжённости адаптивного противочумного иммунитета. Существенные отличия в полученных данных обусловлены разницей во времени и кратности введения иммуномодуляторов (табл. 2). Однократное введение выбранных олигопептидов совместно с вакцинным штаммом оказывало минимальное влияние на эффективность защиты животных от чумы. Трёхкратное введение препаратов перед заражением приводило к снижению показателей ImD₅₀ Y. pestis EV линии НИИЭГ на фоне применения О1 и О2 в 1,2 раза, О3 — в 2,2 раза по сравнению с животными, иммунизированными только вакцинным штаммом. Средняя продолжительность жизни павших биопробных животных увеличилась в среднем на 1 сут.

 

Таблица 2. Влияние олигопептидных препаратов О1, О2, О3 при однократном и трёхкратном введении на защитное действие вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ при заражении белых мышей 400 ЛД₅₀ Y. pestis 231 (M ± m)

Table 2. Influence of oligopeptide preparations O1, O2, O3 with single and triple administration on the protective efficacy of vaccine strain Y. pestis EV line NIIEG at lethal challenge white mice with 400 LD₅₀ Y. pestis strain 231(M ± m)

Доза иммунизирующего препарата Y. pestis EV линии НИИЭГ, КОЕ Immunization strain Y. pestis EV line NIIEG dose, CFU	Число выживших животных/общее количество Number of animals (survived/inoculated)		Средняя продолжительность жизни, сут Mean time-to-death, days		ImD50, КОЕ ImD50, CFU
	схема 1 scheme 1	схема 2 scheme 2	схема 1 scheme 1	схема 2 scheme 2	схема 1 scheme 1	схема 2 scheme 2
5,0 × 103	4/10	4/10	4,3 ± 0,1	4,4 ± 0,2	6876	1824
2,5 × 104	5/10	6/10	5,8 ± 0,6*	5,4 ± 0,1*
5,0 × 103 + О1	4/10	8/10	4,4 ± 0,8	5,5 ± 0,4*	5860	1492
2,5 × 104 + О1	6/10	8/10	4,9 ± 0,6*	6,4 ± 0,8*
5,0 × 103 + О2	5/10	8/10	4,8 ± 0,1*	6,9 ± 0,4*	5860	1492
2,5 × 104 + О2	5/10	7/10	5,8 ± 0,3*	7,5 ± 0,3#
5,0 × 103 + О3	5/10	6/8	4,8 ± 0,3	6,8 ± 0,4*	6454	816
2,5 × 104 + О3	4/9	7/10	5,6 ± 0,2*	7,1 ± 0,4#
Физиологический раствор PBS	0/10		3,5 ± 0,5		–

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с неиммунизированными животными; ^#р < 0,05 по сравнению с животными, иммунизированными только Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Note. *p < 0.05 when compared with intact animals; ^#p < 0.05 when compared with animals immunized with only Y. pestis line EV NIIEG.

 

Изучение действия олигопептидных иммуномодуляторов на протективные свойства вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ повторили на морских свинках как на более адекватной модели чумной инфекции [19]. У иммунизированных иммуномодуляторами по тем же схемам морским свинках регистрировали снижение ImD₅₀ по сравнению с морскими свинками, иммунизированными только вакцинным штаммом EV. Однако изменение протективности в ответ на применение иммуномодуляторов у этой биомодели было менее выраженным, чем у белых мышей (рис. 2). Максимальное снижение показателя отмечали на сочетанное применение О1 по схеме 2 — в 1,8 раза.

 

Рис. 2. Значение ImD50 для штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ на фоне введения олигопептидов О1, О2, О3 по схеме 1 (а) и схеме 2 (б) перед заражением морских свинок 400 ЛД50 Y. pestis 231. *р < 0,05 при сравнении с вакцинированными только Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Fig. 2. The mean ImD50 values of Y. pestis strain EV line NIIEG in treatment groups with oligopeptides O1, O2, O3 according to scheme 1 (2a) and scheme 2 (2b) before lethal challenge of guinea pigs with 400 LD50 Y. pestis strain 231. *p < 0.05 in comparison with vaccinated mice only Y. pestis EV line NIIEG.

 

Кроме того было зафиксировано достоверное (р < 0,05) увеличение инкубационного периода и средней продолжительности жизни животных. Наиболее выраженные изменения продолжительности жизни павших морских свинок по сравнению с контрольной группой животных отмечались при применении О2 — в 1,7 раза (до 8 сут) и О1 — в 2,3 раза (до 11 сут).

Влияние олигопептидных иммуномодуляторов на иммуногенные свойства Y. pestis линии EV НИИЭГ

У всех иммунизированных белых мышей выявляли антитела к F1 чумного микроба (табл. 3). Сочетанная вакцинация Y. pestis EV линии НИИЭГ с О1 приводила к наиболее значимому повышению тиров антител к капсульному антигену чумного микроба по сравнению с группами биопробных животных, иммунизированных только вакцинным штаммом Y. pestis EV линии НИИЭГ. Напротив, О3 при совместном введении с вакцинным штаммом EV вызывал снижение титров детектируемых антител. Включение О2 в схему иммунизации мышей вакцинным штаммом Y. pestis EV линии НИИЭГ существенно не влияло на выработку антител к F1 чумного микроба. Исследование уровня специфических антител у морских свинок показало, что введение иммуномодулирующих препаратов не давало достоверно значимого изменения уровня антител. Обратные значения среднегеометрического титра у иммунизированных О1 и О2 животных составляли 1500 ± 406, а на введение О3 даже зарегистрировано некоторое снижение титров антител к F1 чумного микроба — 1 на 1213,3 ± 60,3 (р < 0,1).

 

Таблица 3. Динамика продукции цитокинов и антител к F1 Y. pestis при введении иммуномодулирующих препаратов у иммунизированных белых мышей Ме (Q₁–Q₃)

Table 3. Dynamics of cytokine production and antibodies to F1 Y. pestis following the administration of immunomodulatory preparations in immunized white mice Me (Q₁–Q₃)

Группа Group (n = 30)	Срок, сут Duration of the study, day	ИФН-γ, пг/мл, Me (Q1–Q3) INF-γ, pg/ml, Me (Q1–Q3)		ИЛ-10, пг/мл, Me (Q1–Q3) IL-10, pg/ml, Me (Q1–Q3)		Обратные значения среднегеометрического титра (M ± m) Geometric mean reciprocal titers to F1 Y. pestis protein (M ± m)
		Sp	Ind	Sp	Ind
Y. pestis EV линии НИИЭГ (2,5 × 104 КОЕ) Y. pestis EV line NIIEG (2,5 × 104 CFU)	3	28,2 (21,3–35,2)	57,1 (53,3–63,6)	11,2 (8,8–11,5)	15,4 (11,8–16,2)	–
	14	22,2 (15,7–29,9)	40,6 (37,6–60,6)	12,2 (7,2–15,5)	16,9 (9,9–20,7)	–
	21	20,3 (13,7–27,9)	42,6 (23,5–54,7)	14,2 (9,8–17,2)	17,9 (11,1–22,3)	512 ± 35,43
Y. pestis EV линии НИИЭГ (2,5 × 104 КОЕ + О1) Y. pestis EV line NIIEG (2,5 × 104 CFU + O1)	3	39,1 (31,6–54,7)	67,9 (39,3–77,4)	29,5* (20,8–40,4)	38,2* (23,9–52,4)	–
	14	38,2 (26,2–50,6)	62,1 (42,1–83,9)	20,33 (14,4–26,7)	25,5* (14,0–54,7)	–
	21	20,2 (12,2–38,7)	66,7 (40,5–87,0)	11,1 (4,4–23,1)	25,6* (18,9–44,0)	873 ± 84,4*
Y. pestis EV линии НИИЭГ (2,5 × 104 КОЕ + О2) Y. pestis EV line NIIEG (2,5 × 104 CFU+ O2)	3	37,9 (26,4–49,6)	68,2 (65,3–69,8)	19,2 (18,9–22,8)	24,3 (11,5–30,4)	–
	14	34,1 (28,5–50,5)	67,7 (55,6–73,9)	19,1 (11,7–25,3)	24,2 (19,7–34,2)	–
	21	28,1 (22,8–31,6)	51,7 (46,7–66,8)	14,5 (8,6–23,3)	19,4 (8,6–36,8)	512 ± 40,4
Y. pestis EV линии НИИЭГ (2,5 × 104 КОЕ + О3) Y. pestis EV line NIIEG (2,5 × 104 CFU+ O3)	3	42,6* (23,5–54,7)	102,1* (82,1–113,9)	30,33* (24,4–36,7)	45,5* (34,0–64,7)	–
	14	30,2 (29,4–31,7)	75,5* (69,2–79,3)	20,1 (14,9–23,1)	34,3* (29,1–40,7)	–
	21	27,1 (20,2–34,1)	62,5 (59,5–71,0)	17,7 (14,0–19,8)	22,9 (19,6–24,7)	324 ± 25,9
Примечание. Sp — спонтанная продукция; Ind — индуцированная продукция; *р < 0,05 по сравнению с группой, иммунизированной только Y. pestis EV линии НИИЭГ (2,5 × 104 КОЕ). Note. Sp — spontaneous production; Ind — induced production; *p < 0.05 compared to to group immunized only by Y. pestis EV line NIIEG (2.5 × 104 CFU).

 

Уровни цитокинов в сыворотке крови мышей определяли в опытах in vivo через 3, 14 и 21 сут после трёхкратной иммунизации препаратами олигопептидов. Из анализа представленных в табл. 3 данных видно, что иммунизация мышей препаратом О1 приводила к незначительному повышению как спонтанной, так и индуцированной продукции ИФН-γ по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных только Y. pestis EV линии НИИЭГ. Через 3 сут после иммунизации данным иммуномодулятором наблюдали повышенный синтез противовоспалительного цитокина ИЛ-10, что коррелировало с повышением титра противочумных антител к F1 чумного микроба и может свидетельствовать об активации как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Иммунизация препаратом О3 на 3-и сутки вызывала однократную выработку высоких концентраций провоспалительного цитокина ИФН-γ, индуцирующего клеточный иммунный ответ. Далее на 14-е сутки концентрация ИФН-γ падала, и через 21 сут различий в продукции цитокинов с контрольной группой не выявляли. Введение О2 приводило к незначительному (р < 0,5) повышению продукции ИФН-γ и ИЛ-10 в начальные сроки после иммунизации. Затем уровень продукции цитокинов — как спонтанной, так и индуцированной — снижался до уровней контрольной группы.

При морфологическом исследовании органов морских свинок, иммунизированных Y. pestis EV линии НИИЭГ в дозе 5 × 10³ совместно с олигопептидами О1, О2 и О3, не выявлено грубых изменений со стороны внутренних органов. При гистологическом исследовании на фоне отсутствия признаков повреждения тканей регистрировали умеренные гиперпластические процессы в лимфоидных органах. Значимых морфологических отличий, связанных с введением исследуемых олигопептидов, у животных не наблюдали.

Обсуждение

Применяемая для специфической профилактики чумы ВЧЖ, лицензированная в России, снижает заболеваемость и обеспечивает более лёгкое течение болезни, но недостаточно эффективна в отношении лёгочной чумы и вызывает непродолжительный напряжённый иммунитет. Многолетнее комплексное иммунологическое исследование вакцинированных ВЧЖ лиц декретируемых контингентов показало индивидуальную иммунологическую эффективность вакцины, зависящую от многих факторов [2, 20]. Применение иммуномодуляторов на фоне прививки ВЧЖ — одно из реальных и перспективных направлений повышения эффективности противочумного иммунитета. Учитывая, в первую очередь, механизм действия, а также положительные результаты, полученные при использовании иммуномодулирующих препаратов в схемах лечения и профилактики как вирусных, так и бактериальных инфекций, были отобраны иммуномодуляторы, использование которых может быть эффективным для совершенствования специфической профилактики чумы.

Препарат О1, регулирующий окислительно- восстановительные процессы, обладающий иммуностимулирующим, гепатопротективным, гемопоэтическим потенциалом, в наших исследованиях повышал выживаемость животных, возможно, активируя тканевые макрофаги и способствуя поглощению и гибели микроорганизмов. В данной серии экспериментов пептид показал наилучшие результаты: у интактных белых мышей при трёхкратном введении О1 регистрировали повышение показателя ЛД₅₀ штамма Y. pestis 231(708) в 3 раза по сравнению с контрольной группой, что коррелировало с увеличением средней продолжительности жизни павших животных опытной группы. Также при трёхкратном введении препарата О1 отмечали снижение интегрального показателя ImD₅₀ у белых мышей — в 1,2 раза, у морских свинок — в 1,8 раза по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных только Y. pestis EV линии НИИЭГ, что указывает на активацию протективных свойств вакцины. Повышение выживаемости животных после заражения сопровождалось ростом средней продолжительности жизни павших биомоделей (в 1,2–2,3 раза). Пептид О1 стимулировал увеличение антителопродукции, что коррелировало с ростом противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Аналогичные результаты, сопровождающиеся повышением защитного эффекта вакцинации, получены при введении с живой бруцеллезной вакциной иммуномодуляторов ликопида и тимогена [21], а также при изучении влияния азоксимера бромида на иммуногенные и протективные свойства вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ при экспериментальной чуме [3, 4].

Синтетический пептид О2 мобилизует и активирует клетки моноцитарно-макрофагального ряда, индукцию синтеза ИФН-α и -β, стимулирует синтез антител к различным антигенам инфекционной природы, а также влияет на содержание CD4 T- и NK-клеток в периферической крови [9, 13]. У животных, иммунизированных вакцинным штаммом чумы, трёхкратное введение О2 непосредственно перед заражением Y. pestis 231(708) в 1,4–2,1 раза увеличивало среднюю продолжительность жизни биомодели и пролонгировало период до манифестации заболевания, что позволяет рассматривать этот препарат особенно перспективным для экстренной профилактики чумы. Известно, что в случае чумы дополнительные 24 ч на принятие решения о назначении этиотропной терапии пациенту позволяют минимум на 50% повысить шансы на выздоровление [22].

Синтетический иммуномодулятор тимического происхождения О3 активирует поглощение лейкоцитами бактерий и их переваривание, стимулируя образование всех видов иммуноглобулинов, усиливая продукцию ИЛ-2 лимфоцитами [9, 10]. В нашем исследовании установлено потенциирующее влияние О3 на иммуногенную и протективную активность вакцинного штамма чумного микроба при моделировании бубонной формы чумы на двух видах экспериментальных животных. Так, трёхкратное введение иммуномодулятора О3 перед заражением вызывало значимое снижение интегрального показателя ImD₅₀ у белых мышей и морских свинок. Интересен установленный факт увеличения продукции цитокинов у иммунизированных по данной схеме животных, что сопровождалось повышением напряжённости противочумного иммунитета, происходящим даже на фоне снижения титров детектируемых антител к капсульному антигену F1 чумного микроба у белых мышей и морских свинок. Возможно, что активированные введением О3 цитокины участвуют в механизме ингибирования высвобождения В-клетками синтезируемых иммуноглобулинов и в перестройке иммунной системы биомоделей на клеточный тип иммунного ответа.

Отдельно необходимо отметить отсутствие при совместном введении со штаммом Y. pestis EV линии НИИЭГ негативного влияния олигопептидных препаратов на ткани и органы вакцинированных биомоделей, установленное с помощью морфогистологического исследования.

Заключение

Результаты комплексной оценки возможности повышения иммуногенности и протективности вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ за счёт использования различных схем применения синтетических олигопептидных иммуномодуляторов показали, что оптимальным препаратом, обеспечивающим стимуляцию клеточного звена иммунитета, повышающим иммуногенность и протективный эффект живой чумной вакцины, является глутоксим (О1). Несмотря на то что гепон (О2) положительно влиял на показатели клеточного иммунитета при сочетанном введении с Y. pestis EV линии НИИЭГ, ожидаемого повышения защитного эффекта в опытах на белых мышах и морских свинках обнаружено не было. Применение иммунофана (О3) совместно с вакцинным штаммом в сравнении с другими анализируемыми препаратами показало преимущественное избирательное влияние на Т-клеточное звено иммунитета, что и следовало с большей вероятностью ожидать от синтетического аналога тимопоэтина. Не стоит забывать при работе с иммуномодуляторами, что повышение защитного эффекта иммунизации на фоне применения олигопептидов чётко зависело от выбранного типа биомодели: для белых мышей снижение ImD₅₀ было более значимым, чем для морских свинок.

Таким образом, исследования по отбору и оценке эффективности иммуномодулирующих препаратов для включения в схему вакцинации против чумы открывают новые возможности формирования основы для совершенствования специфической профилактики этой инфекции в условиях многолетнего обострения эпизоотической активности на территориях природных очагов инфекции или при угрозе возникновения эпидемических осложнений.

About the authors

Anastasiya Yu. Goncharova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Author for correspondence.
Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-9994-7936

Cand. Sci. (Med.), researcher, Department of immunology

Россия, Saratov

Svetlana A. Bugorkova

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0001-7548-4845

D. Sci. (Med.), Head, Department of immunology

Россия, Saratov

Tatyana N. Shchukovskaya

Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"

Email: rusrapi@microbe.ru

D. Sci. (Med.), Professor, chief researcher, Department of immunology

Россия, Saratov

References

Supplementary files