Varicella Zoster virus infection: immunity, diagnosis and modelling in vivo

Full Text

Исследования показали, что возбудитель ветряной оспы (ВО) и опоясывающего
герпеса (ОГ), или вирус герпеса человека 3 типа эволюционировал вместе с приматами и вышел из Африканского континента вместе с ранними гоминидами около 7 млн
лет назад [7]. ВО многие годы считалась незначительной медицинской проблемой,
легким детским заболеванием [3]. Однако после успешного внедрения С. Фарбером
химиотерапевтического метода лечения злокачественных новообразований, Т. Веллер
сообщил о двух случаях смерти детей, победивших рак с помощью химиотерапии,
но вскоре умерших от ятрогенной ВО [26]. Болезнь протекала в тяжелой форме,
сопровождаясь обширной геморрагической везикулярной сыпью. Выяснилось, что
для таких детей ВО смертельно опасна, вследствие возникающего на фоне химиотерапии иммунодефицита [12]. Вскоре химиотерапия стала распространенным и эффективным методом борьбы со злокачественными новообразованиями, а успешное
культивирование вируса в лаборатории Т. Веллера стало тем необходимым условием,
которое привело к созданию японским ученым проф. Такахаши вакцины против ВО
[26]. Таким образом, реальный контроль за распространением VZV-инфекции стал
возможен благодаря накопленным знаниям о жизненном цикле вируса, его биологии и патогенезе вызываемых им осложнений. Результаты клинических наблюдений
указывают на то, что ВО и ОГ — это самостоятельные заболевания, этиологическим
агентом которых является VZV. Также показано, что одним из условий развития ОГ
является длительная бессимптомная персистенция VZV в организме переболевшего ВО человека [8]. VZV относится к роду Varicellavirus семейству Herpesviridae подсемейству α-herpesvirinae. В обычных условиях вирус паразитирует только в организме человека. Его геном состоит из линейной двухцепочечной ДНК (124884 н.п.),
кодирующей последовательности 72 генов. Икосаэдрический нуклеокапсид вируса
(162 капсомера) окружен липидной оболочкой, вирионы плейоморфны, их диаметр
достигает 150-200 нм [5]. Через 72 ч после заражения культуры клеток наблюдается
выраженное цитопатическое действие вируса с характерным формированием многоядерных синцитиев без продукции стабильных вирионов. В процессе репликации
продуцируются 12 вирусных белков, в том числе, гликопротеины B, I и H, с преобладанием gE, к которому формируется основной пул вируснейтрализующих антител.
Показано, что главной функцией антител к VZV является нейтрализация вируса, а
их продукция возникает в результате VZV-инфекции или вакцинации. Установлено,
что gE связан с вирулентностью вируса в патогенезе неврологических поражений
[21]. Антитела к gВ также обладают вируснейтрализующими свойствами, однако не
всегда обнаруживаются в крови [22]. В инициации клеточного иммунного ответа
участвуют вирусные белки — продукты трансляции с ОRF4 и ОRF63 [24]. Обычно,
при латенции вируса в нейронах, удается выявить транскрипты ОRF4, 21, 29, 62,
63 и 66 [9]. Исследование с помощью ПЦР-РВ латентно инфицированных ганглиев
тройничного нерва показало наличие в них транскриптов вирусных генов, транслируемых с ОRF11, 41, 43, 57 и 68 [14]. Ранее считалось, что существует лишь один
серотип VZV [19], однако в 1998 году обнаружен мутантный штамм (VZV-MSP), в gE
которого отсутствовал В-клеточный эпитоп, необходимый для реализации процессов комплемент-зависимой нейтрализации и антитело-зависимой цитотоксичности. В 1999 году в Канаде у 75-летнего мужчины с клиникой ОГ был выделен штамм вируса (VZV-BС) со схожей мутацией в гене gE [14]. В 2006 году опубликованы данные о штаммах VZV, относящихся к категории «ускользающих» мутантов, которые
не взаимодействуют с вируснейтрализующими моноклональными антителами, что
существенно затрудняет серологическую диагностику инфекции [18]. Выяснилось,
что мутантные штаммы фенотипически отличаются от обычных вирусов и лучше
размножаются in vitro и in vivo [15]. Предполагается, что эти штаммы могут вызывать у человека более тяжелые формы VZV-инфекции, чем обычные дикие вирусы,
что, в частности, подтверждается сообщением об иммунокомпетентном больном с
тяжелой, завершившейся летально, диссеминированной формой гепатита, вызванной мутантным по gE VZV [7]. VZV относится к высоко контагиозным вирусам, вызывающим ВО, преимущественно у детей, и ОГ у взрослых, чаще пожилых людей. В
естественных условиях VZV может вызывать заболевание только у человека.
ИММУНИТЕТ. В результате проникновения в организм вирус инфицирует слизистую оболочку дыхательных путей, проникает в эпителиальные клетки миндалин,
где начинает реплицироваться. Нейтрализация вируса в этот период возможна путем пассивной иммунизации [23]. В инкубационном периоде VZV начинает инфицировать CD4+ и CD8+ T-клетки [23]. При возникновении вирусемии, которая
обычно длится несколько суток, зараженные Т-лимфоциты мигрируют по направлению к кожным покровам, попутно инфицируя кератиноциты и другие клетки и
ткани. Система врожденного иммунитета, за счет продукции α-ИФН и других факторов сдерживает репликацию вируса в коже, однако «первая линия обороны» все
же прорывается, что сопровождается появлением на коже характерных высыпаний
[26]. Врожденный иммунитет замедляет процесс репликации вируса, обеспечивая
тем самым формирование адаптивного иммунитета, который в дальнейшем контролирует репликациюVZV [23]. Известный механизм распространения VZV из «клетки
в клетку» свидетельствует о более важной роли CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в защите хозяина, чем специфических антител. У пациентов с дефицитом врожденных
[7] и (или) адаптивных клеточно-опосредованных реакций [22] часто возникают тяжелые формы инфекции, которые иногда может вызывать даже вакцинный штамм
вируса (vOka). Исследования активности клеточного иммунитета у взрослых пациентов продемонстрировали, что тяжесть заболевания у них прямо пропорциональна
вирусной нагрузке и обратно пропорциональна активности вирусспецифических
цитотоксических Т-лимфоцитов. После выздоровления у большинства реконвалесцентов формируется пожизненный адаптивный иммунитет, гуморальное звено
которого обеспечивает защиту от рецидива ВО. Установлена прямая коррелятивная
связь между концентрацией VZV IgG в крови больных и отсутствием клинически
выраженной инфекции [17]. У пожилых людей с высокими титрами VZV IgG в крови
риск развития ВО, как правило, минимизирован. Показано, что заболевание можно
предотвратить путем введения контактному лицу иммуноглобулиновых препаратов
[15]. Однако описан случай повторной инфекции у 32-летней женщины, перенесшей в 5-летнем возрасте ВО, в крови которой за два года до повторного заболевания
определяли высокие титры VZV IgG. Источником инфекции в этом случае являлся
больной ОГ [22]. Полагают, что повторное заражение VZV может быть обусловлено
низкими концентрациями в крови вирусспецифических высокоаффинных IgG и
(или) нарушением процесса «созревания» их аффинности [10]. При этом, необходимо отметить, что далеко не все переболевшие ВО с преобладанием в крови низкоаффинных VZV IgG заболевали ВО повторно. Наличие у человека высоких титров VZV
IgG, несомненно, позитивный фактор, способствующий выздоровлению, однако
абсолютным условием выздоровления является все же формирование полноценного адаптивного (клеточного) иммунитета. Наиболее тяжелые случаи ВО, часто с летальным исходом, наблюдали у лиц с отсутствующим или существенно сниженным
уровнем клеточных реакций [11]. Назначение при этом иммуноглобулиновых пре-паратов малоэффективно ввиду вероятности межклеточного (без выхода в кровяное
русло) распространения вируса [11].
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. Клинические признаки ВО и ОГ обычно характерны и очевидны, поэтому диагноз «VZV-инфекция» чаще всего ставится на
основании клинических симптомов болезни. Лабораторное тестирование необходимо в сомнительных случаях, например, у лиц с нарушением иммунитета или
при подозрении на VZV-инфекцию, устойчивую к лекарственным препаратам [23].
Долгое время «золотым стандартом» лабораторной диагностики было выделение
вируса из культуры клеток, что требовало использования свежей везикулярной жидкости, которую наслаивали на субстрат, чаще эмбриональные фибробласты легкого
человека. Клетки инкубировали при 37°С в течение 3-7 суток и под микроскопом
учитывали цитопатогенный эффект вируса. К недостаткам метода можно отнести
его длительность и относительно высокую стоимость [6]. Медленный рост VZV в
культуре не обеспечивал своевременного лечения. В связи с этим, культуральный
метод используется редко, хотя, по-прежнему, применяется при определении чувствительности вируса к новым препаратам, а также в научных целях. Сейчас диагностической процедурой выбора является ПЦР, которая отличается быстротой
постановки, высокой чувствительностью и специфичностью. Эту реакцию можно
использовать для обнаружения вирусной ДНК в везикулярной жидкости, соскобах
кожи, мазках со слизистой, в ликворе и тканях, а также в крови и слюне пациентов
[18]. Определение ДНК в слюне особенно перспективно, ввиду неинвазивности метода сбора материала. [23]. Появление вирусной ДНК в слюне больных ОГ, рассматривается как диагностически значимый признак [23]. Этот тест особенно важен при
диагностике инфекции у пациентов с отсутствием кожных высыпаний, например,
zoster sine herpete или enteric zoster [21]. Кратковременное присутствие в слюне вирусной ДНК как явления было впервые установлено у 1/3 космонавтов после полета в космос, при этом каких-либо симптомов заболевания у них не наблюдалось
[18]. Этот феномен, вероятно, мог возникнуть вследствие эндогенной реактивации
VZV в экстремальных условиях полета, на фоне снижения активности клеточного
иммунитета. В крови космонавтов, под влиянием стресса, уровень вирусной ДНК
колебался от 0 до 6х103
копий/мл, у 30% из них вирусную ДНК определяли в слюне
[13]. В слюне 17% детей-пациентов отделений интенсивной терапии также отмечалось присутствие вирусной ДНК [16]. Различия в количестве ДНК у больных ОГ
колебались в интервале от 10 до 1х106
копий ДНК в 1 мл слюны [21]. Помимо применения ПЦР в диагностике заболеваний, эта реакция может быть использована для
выявления различий между WTVZV и vOka, что принципиально важно при оценке
безопасности вакцин против ВО и ОГ. Для определения различий в молекуле ДНК,
кодирующей белки vOka и продукты генов VZV дикого типа (WTVZV), необходима
обработка продуктов ПЦР рестрикционными ферментами [17]. Для идентификации
вируса может быть использован рестрикционный эндонуклеазный анализ продуктов
ПЦР в нуклеотидных последовательностях дикого и вакцинного штаммов вируса.
Например, ORF38 WTVZV обладает сайтом рестрикции PstI, который отсутствует в
ORF38 vOka. Поэтому простой скрининговый тест позволяет судить о наличии или
отсутствии этого сайта в анализируемых образцах вирусной ДНК [1]. Подавляющее
большинство генов ORF38 WTVZV содержит сайт PstI, и, таким образом, эти гены можно отнести к «PstI-позитивным». Однако в некоторых ORF38 дикого вируса этот сайт рестрикции отсутствует, ввиду чего «PstI-негативные» штаммы VZV
не всегда являются вакцинными. Для полной уверенности в том, что исследуемый
штамм является вакцинным, проводится дополнительное тестирование. В частности, рекомендуется анализ четырех локусов вирусной ORF62 (105705, 106262, 107252
и 108111), что используется для окончательной идентификации вируса [17]. Еще
одним диагностическим тестом VZV-инфекции является метод непрямой иммуно-флюоресценции, с помощью которого возможна идентификация вируса из кожных
везикул. Этот метод является более чувствительным, чем культуральный, однако уступает ПЦР, вследствие чего он менее эффективен при выявлении различий
между вакцинным и диким штаммами VZV [14]. Диагноз «VZV-инфекция» может
быть также подтвержден по 4- и более кратному нарастанию титра VZV IgG в крови
больных. Однако для данного теста характерна длительность постановки (от 10 до
14 дней) и невысокая специфичность. В крови некоторых пациентов с ВПГ-инфекцией также выявляются VZV IgG, в основном, за счет перекрестных реакций между
VZV и ВПГ [6]. Серологические методы могут быть также использованы в качестве
индикаторных тестов, позволяющих выявлять наличие протективного иммунитета к ВО, однако большинство из них не обладает достаточной чувствительностью,
позволяющей определенно ответить на этот вопрос. Наличие антител к VZV может
быть выявлено в сыворотке крови с помощью твердофазного ИФА. Многие коммерческие ИФТС различаются по степени своей чувствительности и специфичности. Наиболее распространенным их недостатком является низкая чувствительность,
поэтому у некоторых реципиентов антитела к VZV могут не выявляться [6]. С целью
повышения чувствительности метода была разработана тест-система, с помощью
которой можно определять антитела к gЕ VZV, однако ее практическое применение
ввиду слишком высокой чувствительности имеет ограничения, так как она может
выявлять антитела в очень низких, недостаточных для защиты титрах. При этом могут возникать ошибки, связанные с мнением, что тестируемое лицо защищено от
заражения [2]. Более надежным, чем ИФА, является метод определения флуоресцирующих антител к мембранному вирусному антигену (ФАМА-тест). Использование
данного теста показало, что он является весьма эффективным суррогатным методом
определения уровня иммунной защиты от ВО [6]. Установлено, что после заражения
VZV, согласно результатам ФАМА-теста, у менее чем 2% лиц с титром антител ≥1:4
(n=131) наблюдалась «мягкая» форма ВО. При этом заболеваемость ветрянкой лиц
с титром антител <1:4 составляла 59% (n=68). ФAMA-тест часто использовали как
метод, с помощью которого осуществлялась корреляция иммунитета при проверке эффективности вакцины против ВО [25]. Однако метод оказался не достаточно
надежным при определении уровня иммунной защиты у лиц с ослабленным иммунитетом, некоторые из них после заражения заболевали «мягкой» формой ВО даже
если ФАМА-тест указывал на наличие у них гуморальной защиты [25]. Выяснилось,
что ИФТС, выявляющие у пациентов VZV IgM, недостаточно надежны, ввиду получения частых ложноположительных результатов, например, при наличии в крови
пациентов С-реактивного белка [7].
В отличие от ВО вируснейтрализующие антитела не защищают от заболевания
ОГ. Гуморальный иммунитет не препятствует эндогенной реактивации вируса; в
крови таких больных часто выявляются высокие титры анти-VZV. Таким образом,
определение концентрации антител к VZV в сыворотке крови не является необходимым условием при выяснении вопроса, существует ли опасность развития ОГ
[10]. Показано, что для предотвращения заболевания вследствие реактивации VZV
важным является функциональная активность эффекторов клеточного иммунитета
[22]. Замечено, что нейроны, инфицированные ВПГ, окружены CD8+Т-клетками,
а вокруг нейронов, зараженных VZV, скопление Т-лимфоцитов отсутствует [10].
Механизм, посредством которого клеточный иммунитет управляет процессом реактивации VZV, требует дальнейшего изучения. Лица, у которых развивается ОГ,
обычно демонстрируют низкие показатели клеточного иммунитета [22]. Можно
предположить, что активность иммунокомпетентных клеток снижается из-за физиологически обусловленных причин, в частности, старения организма. Заболевание
чаще всего наблюдается в 50 — 60-летнем возрасте [5]. У пациентов с клеточным
иммунодефицитом риск развития ОГ значительно повышается [14]. Дети и подрост-ки, у которых диагностируют ОГ, отличаются транзиторным снижением активности
клеточных реакций, возможно, из-за предшествующих эпизодов бессимптомной
вирусной инфекции или стресса [18]. Эндогенная реактивация VZV не всегда сопровождается сыпью, при ее отсутствии, например, у пациентов с zoster sine herpete
или enteric zoster выявление вирусной ДНК в слюне или спинномозговой жидкости
приобретает особо важное диагностическое значение.
МОДЕЛИРОВАНИЕ IN VIVO. Известно, что естественным резервуаром VZV в
природе является только человек, что создает определенные сложности для детального изучения патогенетических механизмов VZV-инфекции. В связи с этим, необходимо было создать модель заболевания на животных, которая включала бы все
стадии инфекции, в том числе, стадию эндогенной реактивации вируса, что долго не
удавалось, и, таким образом, изучение механизмов иммунного ответа у лиц с первичной VZV-инфекцией или у реципиентов живой вакцины было ограничено [25].
Были попытки создания модели латентной VZV-инфекции на хлопковых крысах или
крысах линии Вистар, однако воспроизвести стадию эндогенной реактивации вируса у этих животных не удавалось [18]. Впервые латентную инфекцию воспроизвели
на морских свинках в лаборатории Гершона [14]. Было показано, что в составе энтеральной нервной системы (ЭНС) этих животных находятся внутренние первичные
афферентные нейроны (intrinsic primary afferent neurons). Латенция вируса происходит в первичных афферентных нейронах дорзальных заднекорешковых ганглиев
(primary afferent neurons of dorsal root ganglia, DRG) и нейронах краниальных нервных
ганглиев (cranial nerve ganglia, CNG). С учетом того, что пермиссивной системой
для VZV являются клетки человека, моделирование VZV-инфекции на животных —
довольно сложная задача [23]. Однако, благодаря инновационным подходам эта задача была решена путем пересадки инфицированных VZV эмбриональных клеток
человека иммунодефицитным мышам линии SCID, что позволило детально изучить
реакции врожденного иммунного ответа независимо от адаптивных иммунных реакций [4]. Мышам SCID под кожу пересаживают зараженные вирусом эмбриональные
клетки кожи, а под почечную капсулу — эмбриональные T-лимфоциты и клетки
спинномозговых ганглиев человека. Ксеногенный кожный трансплантат приживается обычно через 3-4 недели, а T-лимфоциты и клетки нервных ганглиев — через 8-
12 недель [10]. Клетки кожи дифференцируются и образуют типичные слои дермальных и эпидермальных клеток. В результате в тимусе мышей появляются незрелые и
зрелые формы CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов [26]. Нейроны в ксенотрансплантатах
спинномозговых ганглиев обычно окружены клетками-саттелитами, на поверхности которых наблюдается экспрессия специфических белков, в том числе, тропомиозин-рецепторной киназы A (TRKA), молекул адгезии нервных клеток (NCAM), медиатора проникновения вируса герпеса (HVEM) и некоторых другие молекул. Через
12 недель после пересадки в тимусе появляется ряд белков, участвующих в блокаде
апоптоза и реакциях врожденного иммунитета, включая преобразователь сигнала и активатор транскрипции (STAT), лейкемический белок (PML —promyelocytic
leukaemia protein) [5]. С целью изучения влияния вирусных и клеточных белков на
процесс репродукции вируса используют модели с ингибиторами малых интерферирующих РНК (siRNA). В инфицированных ксенотрансплантатах определяют титры
VZV и копии вирусного генома [21]. Иммуногистохимическими методами в биоптатах тканей определяют экспрессию вирусных и клеточных белков, а также ультраструктурные изменения в клетках. Для мониторинга инфекции в естественных условиях используется рекомбинантный VZV, экспрессирующий молекулы люциферазы
[6]. Опыты с использованием Т-клеточных ксенотрансплантатов у мышей SCID в
естественных условиях и T-клеток миндалин in vitro показали, что VZV обладает
тропизмом к CD4+ и CD8+ T-лимфоцитам, а также к двойным CD4CD8-позитивным T-клеткам, не препятствующим процессу репликации вируса и формированию инфекционных вирионов [10]. VZV инфицирует Т-лимфоциты и дендритные клетки, что обеспечивает его присутствие в лимфатических узлах и распространение по
всему организму. Зараженные VZV CD4+ T-клетки экспрессируют такие маркеры
активации, как CLA (cutaneus leukocyte antigen) и CCR4 (CC-хемокиновый рецептор 4). У мышей — реципиентов ксенотрансплантатов кожи, зараженные Т-клетки
мигрируют по направлению к поверхности кожи, циркулируют в крови, концентрируются вокруг волосяных фолликулов, окруженных скоплением капиляров [10], что
указывает на способность Т-лимфоцитов проникать сквозь эндотелий мелких сосудов. Известно, что в естественных условиях зараженные Т-клетки переносят вирус
ксенотрансплантатам DRG, что способствует развитию латенции вируса. Известно,
что VZV вызывает образование симпластов, состоящих из эпителиальных клеток,
при этом слияния Т-лимфоцитов не происходит [20]. Гликопротеины оболочки VZV
гомологичны с гликопротеинами других α-герпесвирусов. Показано, что в процессе
заражения Т-клеток участвует вирусный белок (gI). Экспериментально установлено,
что блокирование промотора гена gI приводит к ослаблению связи с ним клеточных
транскрипционных факторов и препятствует транскрипции и репликации вируса
в Т-клетках ксенотрансплантанта [23]. Получены данные об участии в заражении
Т-клеток пяти белков тегумента, в том числе, ORF10, IE63, ORF65 и вирусной киназы — ORF47 и ORF66. Белок ORF10 увеличивает экспрессию IE62, IE63, регулирует экспрессию IE62 и трансактивирует клеточный фактор элонгации 1a (EF-1a).
Киназа ORF47, участвующая в транскрипции IE62, GE и ORF47, необходима для
сборки вирионов. Блокирование экспрессии ORF47 нарушает репликацию VZV
в Т-клетках ксенотрансплантата, что указывает на их важность в моделировании
VZV-инфекции in vivo [10]. Белок ORF66 крайне необходим для сборки вирионов
в Т-клетках. Кроме того, киназа ORF66 блокирует апоптоз и ослабляет экспрессию
ИФН. ORF66 также способствует снижению уровня экспрессии антигенов ГКГ I по
типу отрицательной обратной связи. Исследование мутантов VZV, в которых были
заблокированы участки связывания клеточных транскрипционных факторов, указывает на важность синергидного регулирования вирусных генов IE62 и клеточных
кофакторов, например, специфического белка фактора транскрипции 1 (Sp1) увеличивающего сродство IE62 к вирусному промотору. Мутация двух Sp1-мотивов в
промоторе gE предотвращает репликацию VZV [7].
В заключение следует отметить, что инфицированность населения нашей планеты VZV остается высокой. Во многих регионах мира, несмотря на профилактические мероприятия, заболеваемость первичной VZV-инфекцией и опоясывающим
герпесом увеличивается. Таким образом, разработка научно обоснованных инновационных мероприятий по борьбе с данным видом патологии является актуальной
задачей, требующей более детального изучения особенностей развития VZV-инфекции, углубленных исследований жизненного цикла вируса и его биологии, факторов
врожденного и адаптивного противовирусного иммунитета.

About the authors

V. F. Lavrov

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serа;
Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

O. A. Svitich

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. S. Kazanova

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. R. Kinkulkina

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

V. V. Zverev

Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files